Мы благодарим Крис Вебстер для выполнения предварительных экспериментов показано на рисунке 3 представительных результатов и Джейсон Уоттс и Крис Вебстер за полезные замечания по рукописи. Финансирование данного исследования была предоставлена ​​за счет гранта от Национального института здоровья (США) (R01DK074114) в JLW. Некоторые штаммы нематод, используемые в этой работе были предоставлены Caenorhabditis генетический центр, который финансируется по NIH Управления научно-исследовательских программ в области инфраструктуры (P40 OD010440).

Полиненасыщенные жирные кислоты являются чувствительными к тепла, света и кислорода. Таким образом, необходимо соблюдать осторожность при подготовке добавок пластины жирных кислот, такие жирные кислоты, которые не подвергались воздействию избыточного тепла и света. NGM среды, содержащие 0,1% Tergitol (NP-40) в автоклаве и частично охлаждают, после чего натриевые соли жирных кислот добавляют при постоянном перемешивании. Планшеты дают высохнуть в темноте. Поглощение жирных кислот С. Элеганс культивировали на этих пластин может быть контролируют с помощью газовой хроматографии. 1. Подготовка жирных кислот дополняется СМИ <ol><li> Отмерьте медиа компоненты в соответствующего размера колбы. На 1 л, добавляют 17 г бактоагар 2,5 г триптона, 3 г NaCl, 1 холестерина мл 5 мг / мл, растворенный в этаноле и 10 мл 10% Tergitol, растворенный в воде. </li><li> Добавить 80% конечной требуемой объема Millipore воды и автоклав СМИ наряду с пустыми стеклянными бутылками (равно числу различныхКонцентрации жирных кислот быть проверено), а также соответствующий градуированные цилиндры. </li><li> Прохладный СМИ в водяной бане до 55 ° С В то время как носитель охлаждения подготовки рабочей исходного раствора натриевой соли жирных кислот разламывают на стеклянную ампулу, с использованием техники безопасности и обеспечение частицы стекла не смешиваются в с жирными кислотами. Взвесить достаточно жирную кислоту, чтобы сделать рабочую запас 100 мм. </li><li> Доведите раствор жирной кислоты до конечной концентрации 100 мМ очищенной водой. Полностью растворения соли натрия жирных кислот, как правило, занимает около 20-30 минут. Продуть рабочий запас жирных кислот с аргон или азот, так как контакт с инертным газом предотвращает окисление. Закройте флакон крышкой и храните рабочий запас в темноте, пока СМИ не остынет. </li><li> (Необязательно) Если РНК-интерференции СМИ желательно, измерить ампициллин и изопропилового β-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ) решения здесь. </li><li> Когда агар остынет до 55 ° C добавить на 1 л: 1мл 1 М MgSO 4, 1 мл 1 М CaCl 2 и 25 мл фосфатного буфера (108,3 г KH 2 PO 4 и 35,6 г K 2 HPO 4 на 1 л в автоклаве). Добавить фильтр стерилизовать ампициллин и решения ИПТГ Если сделать RNAi пластины. Для всех типов плит, добавляют стерильную воду, чтобы довести конечный объем медиа до 1 л </li><li> Рядом пламени, передачу мультимедийных файлов в автоклаве и соответствующего размера мерный цилиндр, а затем добавить теплую стерильную воду до требуемого объема. Трансфер СМИ возвращается в исходное колбу и смешать перемешиванием. </li><li> Рядом пламени, передачу мультимедийных файлов на несколько бутылок, равным числу концентраций, которые будут испытаны путем измерения с автоклаве и соответствующего размера градуированный цилиндр. Поддерживать Определенную часть средств массовой информации, как жидкости с помощью водяной бани, пока работает фондовый жирные кислоты полностью не растворится. </li><li> Положите одну бутылку на магнитной мешалки и перемешать, пока СМИ не теплая на ощупь, но не жарко. Не забудьте оставить себе достаточновремя движение в маточного раствора жирных кислот и разлить в чашки, прежде чем средства массовой информации начинает затвердевать. Если мешалка имеет контроль температуры, установите его до 55 ° С </li><li> Разбавьте рабочий запас 100 мМ жирных кислот в СМИ в процессе окончательной концентрации желаемого. Перемешать медиа до белого осадка не находится в растворе (приблизительно 1 мин). Медиа-прежнему может быть немного облачно впоследствии. </li><li> (Необязательно) Если РНК-интерференции СМИ желательно добавить ампициллин до 0,1 мг / мл и IPTG до 2 мм конечная концентрация. </li><li> Налейте СМИ с использованием автоматизированной помощи пипетки и стерильный 25 мл пипетки, добавив, 8 мл СМИ на 60 мм пластины или 25 мл СМИ на 100 мм пластины. Повторите жирную добавление кислоты и тарелку розлива шаги для оставшихся бутылок. </li><li> После того, как агар укрепил, покрыть кислоты с добавкой тарелки жирные с коробкой или Хранить при комнатной температуре в хорошо вентилируемом ящике для защиты от света окисления. </li><li> Семя Е. палочка OP50 на тарелки через два дня после пластины высохли.Для 60-мм чашках, пипетки 300 мкл ночной культуры, выращенной OP50 (при 37 ° С). Если RNAi планшеты налил, семян 300 мкл РНК-интерференции бактерий после пластины высохли в течение четырех дней. Тарелка время высыхания может потребоваться корректировка в связи с различиями в влажности в различных лабораторных условиях. </li><li> Инкубируйте пластин в темноте при комнатной температуре в то время как бактериальный газон сушки. </li></ol> 2. Склонение зародышевых клеток уничтожения добавок DGLA <ol><li> C. Элеганс выращенные на чашках, содержащих 0,3 мм DGLA (20:03 н-6) становятся бесплодными из-за разрушения половых клеток в обеих личиночной стадии и взрослых нематод. <ol><li> Подготовка синхронизированный население L1 личинок обработкой беременных гермафродитов с щелочным раствором гипохлорита (для раствора 10 мл: 0,5 мл 5М NaOH, 2,5 мл хлорной и 7 мл H 2 O). Аккуратно рок беременной гермафродитов в этом растворе до взрослого червяс раствориться. Яйца будут сохранены, и может быть осаждали центрифугированием с низкой скоростью. </li><li> Вымойте Подготовительного яйцо 3 раза в M9 буфера (3 г KH 2 PO 4, 6 г Na 2 HPO 4, 5 г NaCl, 1 мл 1 М MgSO 4, H 2 O в 1 L. Добавить MgSO 4 после автоклавирования). Для обеспечения достаточного количества кислорода, ресуспендируют яйца в 15 мл пластиковую пробирку до конечного объема 5 мл буфера M9 и рок на шейкере в течение ночи. </li><li> L1 личинки должны быть добавлены к дополненных пластин через два дня после посева с OP50, или один день после посева бактерий RNAi. Выдержите червей при 20 ° С в течение трех дней или пока они не достигнут взрослой стадии. </li></ol></li><li> Взрослые черви могут быть забил на стерильность с помощью рассекает микроскоп с достаточно большим увеличением визуализировать эмбрионов развивающиеся в матке. Успешная потеря половых клеток появится в виде прозрачного матки пустоту яиц. </li><li> Черви также может быть засчитан в установлении и окрашивания нуклеиновой акраситель diamindinophenylindole чид (DAPI), что облегчает визуализацию ядер в половых клетках и развивающихся эмбрионов. Быстрое DAPI пятна достигается путем выбора червей в каплю M9 буфера на часовое стекло 9. <ol><li> Наводнение часы-стекло с 1 мл 0,2 нг / м. DAPI в 95% растворе этанола, дайте постоять примерно 5 мин. </li><li> Возьмите червей в каплю Vectashield на слайде, а затем накройте покровным. </li><li> Уплотнение покровное и хранят при температуре 4 ° С в темноте в течение ночи для оптимального окрашивания, однако слайды также можно рассматривать немедленно. Оценка на наличие или отсутствие зародышевых клеток ядер с использованием флуоресцентного микроскопа, снабженного УФ-лампы и фильтра. </li></ol></li></ol> 3. Подтверждение жирных кислот поглощение газовой хроматографии Общая состав жирных кислот в С. Элеганс может быть определена путем получения метиловых эфиров жирных кислот (Fames), которые затем выделена и измерена количественно с использованием газовой Chromatography 4. <ol><li> Сбор 500-1000 взрослых червей путем промывания их из пластин с водой и передачи в силанизированного 13 мм х 100 мм стекло винта верхней трубы. </li><li> Пусть черви поселиться под действием силы тяжести, а затем удалить столько воды, сколько возможно со стеклянной пипетки Пастера. </li><li> Вымойте червей один раз водой, а затем снова удалить столько воды, сколько возможно. </li><li> FAMEs формируются путем добавления 1 мл 2,5% H 2 SO 4 в метаноле, а затем нагревание при 70 ° С в течение 1 часа на водяной бане. </li><li> Удалить труб из водяной бани и охлаждают в течение 1 мин. </li><li> Экстракт Fames добавлением 1,5 мл воды и 0,25 мл гексана. </li><li> Отчет трубы и энергично встряхивают. </li><li> Пробирки центрифужные в настольной клинической центрифуге в течение 1 мин при максимальной скорости, чтобы отделить от водного растворителя гексана. </li><li> Трансфер гексан (верхний слой) к GC флакона вставки в GC флакона, стараясь не передавать какие-либо водной фазы. Для GC анализ, 1-2 мкл МЭЖК в гексане впрыскивается на полярной капиллярной колонки газовой хроматографии, подходящей для анализа Fames. Agilent 7890 GC инжектор установлен при 250 ° С, со скоростью потока 1,4 мл / мин, и GC печь запрограммирован на начальной температуре 130 ° С, которая проходит в течение 1 мин. Впоследствии температуру увеличили 10 ° С / мин до 190 ° С, а затем увеличили еще раз на 5 ° C / мин до 210 ° С и выдерживают в течение 1 мин. </li><li> Чтобы гарантировать, что поглощение DGLA произошло, анализировать Fames методом пламенной ионизации обнаружения (FID) или масс-спектрометрии обнаружения (MS), с использованием аутентичных стандартов для идентификации C. Элеганс жирных кислот. </li></ol>

<ol>
	<li>Haeggstrom, J. Z., Funk, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoxygenase+and+leukotriene+pathways:+biochemistry,+biology,+and+roles+in+disease.">Lipoxygenase and leukotriene pathways: biochemistry, biology, and roles in disease.</a> Chem. Rev. 111, 5866-5898 (2011).</li><li>de Lorgeril, M., Salen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+health+effects+of+dietary+saturated+and+omega-6+and+omega-3+polyunsaturated+fatty+acids.">New insights into the health effects of dietary saturated and omega-6 and omega-3 polyunsaturated fatty acids.</a> BMC Med. 10, 50 (2012).</li><li>Spychalla, J. P., Kinney, A. J., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+animal+omega-3+fatty+acid+desaturase+by+heterologous+expression+in+Arabidopsis.">Identification of an animal omega-3 fatty acid desaturase by heterologous expression in Arabidopsis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 1142-1147 (1997).</li><li>Watts, J. L., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+polyunsaturated+fatty+acid+synthesis+in+Caenorhabditis+elegans.">Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).</li><li>Watts, J. L., Phillips, E., Griffing, K. R., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiencies+in+C20+Polyunsaturated+Fatty+Acids+Cause+Behavioral+and+Developmental+Defects+in+Caenorhabditis+elegans+fat-3+Mutants.">Deficiencies in C20 Polyunsaturated Fatty Acids Cause Behavioral and Developmental Defects in Caenorhabditis elegans fat-3 Mutants.</a> Genetics. 163, 581-589 (2003).</li><li>Kahn-Kirby, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+Polyunsaturated+Fatty+Acids+Drive+TRPV-Dependent+Sensory+Signaling+In+Vivo.">Specific Polyunsaturated Fatty Acids Drive TRPV-Dependent Sensory Signaling In Vivo.</a> Cell. 119, 889-900 (2004).</li><li>Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulation+of+unsaturated+fatty+acid+composition+in+C.+elegans.">Genetic regulation of unsaturated fatty acid composition in C. elegans.</a> PLoS Genet. 2, e108 (2006).</li><li>Webster, C. M., Deline, M. L., Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+response+pathways+protect+germ+cells+from+omega-6+polyunsaturated+fatty+acid-mediated+toxicity+in+Caenorhabditis+elegans.">Stress response pathways protect germ cells from omega-6 polyunsaturated fatty acid-mediated toxicity in Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 373, 14-25 (2013).</li><li>Kadyk, L. C., Lambie, E. J., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=glp-3+is+required+for+mitosis+and+meiosis+in+the+Caenorhabditis+elegans+germ+line.">glp-3 is required for mitosis and meiosis in the Caenorhabditis elegans germ line.</a> Genetics. 145, 111-121 (1997).</li><li>Watts, J. L., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+manipulation+implicates+lipid+signaling+in+the+regulation+of+germ+cell+maintenance+in+C.+elegans.">Dietary manipulation implicates lipid signaling in the regulation of germ cell maintenance in C. elegans.</a> Dev. Biol. 292, 381-392 (2006).</li><li>Pryor, W. A., Stanley, J. P., Blair, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoxidation+of+polyunsaturated+fatty+acids:+II.+A+suggested+mechanism+for+the+formation+of+TBA-reactive+materials+from+prostaglandin-like+endoperoxides.">Autoxidation of polyunsaturated fatty acids: II. A suggested mechanism for the formation of TBA-reactive materials from prostaglandin-like endoperoxides.</a> Lipids. 11, 370-379 (1976).</li><li>Kniazeva, M., Shen, H., Euler, T., Wang, C., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+maternal+phospholipid+composition+and+IP(3)-dependent+embryonic+membrane+dynamics+by+a+specific+fatty+acid+metabolic+event+in+C.+elegans.">Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans.</a> Genes Dev. 26, 554-566 (2012).</li><li>Edmonds, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin/FOXO+signaling+regulates+ovarian+prostaglandins+critical+for+reproduction.">Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction.</a> Dev. Cell. 19, 858-871 (2010).</li><li>O'Rourke, E. J., Kuballa, P., Xavier, R., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=omega-6+Polyunsaturated+fatty+acids+extend+life+span+through+the+activation+of+autophagy.">omega-6 Polyunsaturated fatty acids extend life span through the activation of autophagy.</a> Genes Dev. 27, 429-440 (2013).</li><li>Taubert, S., Van Gilst, M. R., Hansen, M., Yamamoto, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mediator+subunit,+MDT-15,+integrates+regulation+of+fatty+acid+metabolism+by+NHR-49-dependent+and+-independent+pathways+in+C.+elegans.">A Mediator subunit, MDT-15, integrates regulation of fatty acid metabolism by NHR-49-dependent and -independent pathways in C. elegans.</a> Genes Dev. 20, 1137-1149 (2006).</li><li>Lesa, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+chain+polyunsaturated+fatty+acids+are+required+for+efficient+neurotransmission+in+C.+elegans.">Long chain polyunsaturated fatty acids are required for efficient neurotransmission in C. elegans.</a> J. Cell Sci. 116, 4965-4975 (2003).</li><li>Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+desaturation+and+the+regulation+of+adiposity+in+Caenorhabditis+elegans.">Fatty acid desaturation and the regulation of adiposity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 176, 865-875 (2007).</li><li>Goudeau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+desaturation+links+germ+cell+loss+to+longevity+through+NHR-80/HNF4+in+C.+elegans.">Fatty acid desaturation links germ cell loss to longevity through NHR-80/HNF4 in C. elegans.</a> PLoS Biol. 9, e1000599 (2011).</li><li>Yang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ARC/Mediator+subunit+required+for+SREBP+control+of+cholesterol+and+lipid+homeostasis.">An ARC/Mediator subunit required for SREBP control of cholesterol and lipid homeostasis.</a> Nature. 442, 700-704 (2006).</li></ol>

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Здесь мы опишем метод добавок C. Элеганс с диетическими ненасыщенных жирных кислот. Как упоминалось выше, необходимо соблюдать осторожность при подготовке ПНЖК, дополненной пластин, так как реактивный характер двойных связей в ПНЖК вызывает эти жирные кислоты чувствительны к оки?...

Жирные кислоты необходимы структурные компоненты мембран, а также молекулы эффективного хранения энергии. Кроме того, жирные кислоты можно отщепить от клеточных мембран по липаз и быть ферментативно модифицированы с получением сигнализации эффекторы 1. Природные полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) содержат два или более цис двойные связи. Омега-3 жирные кислоты и омега-6 жирные кислоты отличаются друг от друга на основе позиции двойных связей по отношению к концевой метильной группы жирной кислоты. Здоровые диеты требуют как омега-6 и омега-3 жирных кислот. Тем не менее, западные диеты особенно богаты омега-6 жирных кислот и бедными в омега-3 жирных кислот. Высокий омега-6 омега-3 соотношение жирных кислот в связано с повышенным риском сердечно-сосудистых и воспалительных заболеваний, однако, точные полезные и вредные функции конкретных жирных кислот не до конца понятны 2. Аскариды Caenorhabditis Elegaнс является полезной при изучении функции жирных кислот, потому что она синтезирует все ферменты, необходимые для производства целого ряда омега-6 и омега-3 жирных кислот, в том числе омега-3 десатуразой, деятельность, отсутствует у большинства животных 3,4. Мутанты, лишенные жирные десатурации кислоты ферменты не дают конкретных ПНЖК, что приводит к целому ряду развития и неврологических дефектов 4-6. Для изучения физиологических эффектов диетических жирных кислот, мы разработали биохимический анализ, совместимый с генетического анализа с использованием как мутант и RNAi нокдауна методы в С. Элеганс. Дополнение с конкретным ПНЖК достигается путем добавления жирных кислот раствора натриевой соли в агаровой среде до заливки. Это приводит к поглощению ПНЖК в Е. палочка источником пищи, где он накапливается в бактериальных мембранах. С. Элеганс глотать ПНЖК-содержащих бактерии, и это диетических добавок достаточно, чтобы спасти неисправенц из ПНЖК-дефицитных мутантов. Дополнение большинства жирных кислот не имеет пагубные последствия для дикого типа животных, однако, конкретные омега-6 жирных кислот, особенно дигомо-гамма-линоленовой кислоты (DGLA, 20:03 н-6) вызывают постоянное разрушение С. Элеганс половые клетки 7,8. Газовая хроматография используется для контроля поглощения в дополненной жирной кислоты в бактериальной источника питания (или OP50 или HT115), а также в нематод. Добавление моющего средства Tergitol (NP-40) в средствах массовой информации позволяет равномерное распределение жирных кислот через всю пластину и более эффективное поглощение жирных кислот со стороны Е. палочка и нематоды. Мы обнаружили, что ненасыщенные жирные кислоты могут быть легко поглощается бактериями и С. Элеганс, но поглощение насыщенных жирных кислот гораздо менее эффективным. Эта статья описывает шаг за шагом, как дополнение к среде агара с жирными кислотами, а также, как контролировать поглощение жирных кислот в гое нематода с помощью газовой хроматографии.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="765">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Bacto-Agar</td>
			<td style="width:128px;">Difco</td>
			<td style="width:155px;">214010</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Tryptone</td>
			<td style="width:128px;">Difco</td>
			<td style="width:155px;">211705</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">NaCl</td>
			<td style="width:128px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:155px;">3624-05</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Tergitol</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">NP40S-500mL</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">C8667-25G</td>
			<td style="width:275px;">(5 mg/mL in ethanol)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">MgSO4</td>
			<td style="width:128px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:155px;">2504-01</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">CaCl2</td>
			<td style="width:128px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:155px;">1311-01</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">K2HPO4</td>
			<td style="width:128px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:155px;">3254-05</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:128px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:155px;">3246-05</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Sodium dihomogamma linolenate</td>
			<td style="width:128px;">NuCHEK</td>
			<td style="width:155px;">S-1143</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Warm sterile Millipore water</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Sterile water for collecting worms</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Nuclease-free Water for DGLA stock solution</td>
			<td style="width:128px;">Ambion</td>
			<td style="width:155px;">AM9932</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:128px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">BP1760-25</td>
			<td style="width:275px;">100 mg/ml in water (for RNAi plates)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:128px;">Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:155px;">12481C100</td>
			<td style="width:275px;">1 M in water (for RNAi plates)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">HSO4</td>
			<td style="width:128px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:155px;">9681-03</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Methanol</td>
			<td style="width:128px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">A452-4</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Hexane</td>
			<td style="width:128px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">H302-4</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">diamindinophenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">D9542</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">VectaShield</td>
			<td style="width:128px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:155px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Glass Flask</td>
			<td style="width:128px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">4980-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Autoclaveable Glass bottles with stirbars</td>
			<td style="width:128px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:155px;">FB-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Autoclaveable Glass Graduated Cylinder</td>
			<td style="width:128px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:155px;">08-557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Stir Plate</td>
			<td style="width:128px;">VWR</td>
			<td style="width:155px;">97042-642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Waterbath at 55+ &#176;C</td>
			<td style="width:128px;">Precision Scientific Inc.</td>
			<td style="width:155px;">66551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Screwcap Brown Glass Vial</td>
			<td style="width:128px;">Sun SRI</td>
			<td style="width:155px;">200 494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Argon gas tank</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Automated Pipette aid</td>
			<td style="width:128px;">Pipette-Aid</td>
			<td style="width:155px;">P-90297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Sterile Serological Pipettes (25 ml)</td>
			<td style="width:128px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">4489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Bunsen Burner</td>
			<td style="width:128px;">VWR</td>
			<td style="width:155px;">89038-534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Dissection microscope</td>
			<td style="width:128px;">Leica</td>
			<td style="width:155px;">TLB3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Silanized glass tube</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:155px;">STT-13100-S</td>
			<td>for FAMEs derivitization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">PTFE Screw caps</td>
			<td style="width:128px;">Kimble-Chase</td>
			<td style="width:155px;">1493015D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Clinical tabletop centrifuge</td>
			<td style="width:128px;">IEC</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">GC Crimp Vial</td>
			<td style="width:128px;">SUN SRi</td>
			<td style="width:155px;">200 000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">GC Vial Insert</td>
			<td style="width:128px;">SUN SRi</td>
			<td style="width:155px;">200 232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">GC Vial cap</td>
			<td style="width:128px;">SUN SRi</td>
			<td style="width:155px;">200 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Gas Chromatograph</td>
			<td style="width:128px;">Agilent</td>
			<td style="width:155px;">7890A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Mass Spectrometry Detector</td>
			<td style="width:128px;">Agilent</td>
			<td style="width:155px;">5975C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Column for gas chromatography</td>
			<td style="width:128px;">Suppelco</td>
			<td style="width:155px;">SP 2380</td>
			<td>30 m x 0.25 mm fused silica capillary column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dietary supplementation of polyunsaturated fatty acids in caenorhabditis elegans

Жирные кислоты необходимы для многочисленных клеточных функций. Они выступают в качестве эффективных молекул хранения энергии, составляют гидрофобного ядра мембран, а также участвовать в различных сигнальных путей. Caenorhabditis Элеганс синтезирует все ферменты, необходимые для производства целого ряда омега-6 и омега-3 жирных кислот. Это, в сочетании с простой анатомии и диапазон доступных генетических инструментов, делают его привлекательным моделью для изучения функции жирных кислот. Для того чтобы исследовать генетические пути, которые опосредуют физиологические эффекты биологически активных жирных кислот, мы разработали метод в целях пополнения C. Элеганс диета с ненасыщенных жирных кислот. Дополнение является эффективным средством для изменения состава жирных кислот червей, а также может быть использован, чтобы спасти дефекты в кислых дефицитом мутантов жирных. Наш метод использует нематод роста среднего агар (NGM) с добавлением жирных acidsodium солей. Жирные кислоты в дополненных пластин стать IncorporaТед в мембраны бактериальной источника пищи, который затем, с которой соприкасается С. Элеганс, которые питаются на дополненных бактерий. Мы также описываем протокол газовой хроматографии для мониторинга изменений в составе жирных кислот, которые происходят в дополненных червей. Это эффективный способ пополнить рацион больших и малых популяций C. Элеганс, что позволяет для ряда приложений для этого метода.

Дополнение от С. Элеганс диета ограничена способностью бактериального источника питания для поглощения и включать жирные кислоты в бактериальной мембраны. Для определения способности Е. палочка OP50 ассимилировать различных жирных кислот в мембранах его, OP50 высевали на носит...

Watch this Scientific Journal Video about Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

&lt;em&gt; Caenorhabditis Elegan &lt;/ EM&gt; является полезной моделью для изучения функции полиненасыщенных жирных кислот в развитии и физиологии. Этот протокол описывает эффективный метод дополняющий &lt;em&gt; C. Элеганс &lt;/ EM&gt; диета с полиненасыщенными жирными кислотами.

Диетических добавок полиненасыщенных жирных кислот в<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

dietary-supplementation-polyunsaturated-fatty-acids-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Biology

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

17.0K Views.  Washington State University.  Caenorhabditis Elegan является полезной моделью для изучения функции полиненасыщенных жирных кислот в развитии и физиологии. Этот протокол описывает эффективный метод дополняющий C. Элеганс диета с полиненасыщенными жирными кислотами. 

Video: Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

Выделение и В пробирке Активация Caenorhabditis Элеганс Сперма

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide range of species, including mammals. It also causes a decrease in body weight and fertility, as well as lower levels of plasma glucose, insulin, and IGF-1 in these animals. This treatment is often referred to as dietary restriction (DR) or caloric restriction (CR). The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as an important model organism for studying the biology of aging. Both environmental and genetic manipulations have been used to model DR and have shown to extend lifespan in C. elegans. However, many of the reported DR studies in C. elegans were done by propagating animals in liquid media, while most of the genetic studies in the aging field were done on the standard solid agar in petri plates. Here we present a DR protocol using standard solid NGM agar-based plate with killed bacteria.

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Here we present a protocol for performing solid plate-based dietary restriction in C. elegans with killed bacteria.

Твердые пластины основе Диетические ограничения в Caenorhabditis Элеганс</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Покадровый Микроскопия раннего эмбриогенеза в Caenorhabditis Элеганс

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Основной<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; Методы синхронизации и наблюдения

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Добыча простагландинов и анализа в<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we know about C. elegans is limited to laboratory cultivation of the nematodes that may not necessarily reflect the environments they normally inhabit in nature. Cultivation of C. elegans in a 3D habitat that is more similar to the 3D matrix that worms encounter in rotten fruits and vegetative compost in nature could reveal novel phenotypes and behaviors not observed in 2D. In addition, experiments in 3D can address how phenotypes we observe in 2D are relevant for the worm in nature. Here, a new method in which C. elegans grows and reproduces normally in three dimensions is presented. Cultivation of C. elegans in Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) can allow us to measure the reproductive fitness of C. elegans strains or different conditions in a 3D environment. We also present a novel method, termed Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), to cultivate C. elegans in 3D for microscopic analysis. These methods allow scientists to study C. elegans biology in conditions that are more reflective of the environments they encounter in nature. These can help us to understand the overlying evolutionary relevance of the physiology and behavior of C. elegans we observe in the laboratory.

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

We present a simple method to construct 3D nematode cultivation systems called NGT-3D and NGB-3D. These can be used to study nematode fitness and behaviors in habitats that are more similar to natural Caenorhabditis elegans habitats than the standard 2D laboratory C. elegans culture plates.

Выращивание<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; В трех измерениях в лаборатории

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

Измерение коэффициентов потребления кислорода в неповрежденной Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular vesicles (EVs) function outside the cell to regulate global physiological processes by transferring proteins, nucleic acids, metabolites, and lipids between tissues. EVs reflect the physiological state of their cells of origin. EVs are implicated to have fundamental roles in virtually every aspect of human health. Thus, EV protein and genetic cargos are being increasingly analyzed for biomarkers of health and disease. However, the EV field still lacks a tractable invertebrate model system that permits the study of EV cargo composition. C. elegans is well suited for EV research because it actively secretes EVs outside of its body into its external environment, permitting facile isolation. This article provides all the necessary information for generating, purifying, and quantifying these environmentally secreted C. elegans EVs including how to work quantitatively with very large populations of age-synchronized worms, purifying EVs, and a flow cytometry protocol that directly measures the number of intact EVs in the purified sample. Thus, the large library of genetic reagents available for C. elegans research can be tapped into for investigating the impacts of genetic pathways and physiological processes on EV cargo composition.

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

This article presents methods for generating, purifying, and quantifying Caenorhabditis elegans extracellular vesicles.

Очищение и анализ Caenorhabditis elegans Внеклеточные Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a growing number of age-associated diseases. For instance, proteins with polyglutamine expansions are prone to aggregation, as exemplified with the huntingtin protein and concomitant onset of Huntington&#8217;s disease. The age-associated deterioration of the proteome has been widely studied through the use of transgenic Caenorhabditis elegans expressing polyQ repeats fused to a yellow fluorescent protein (YFP). This polyQ::YFP transgenic animal model facilitates the direct quantification of the age-associated decline of the proteome through imaging the progressive formation of fluorescent foci (i.e., protein aggregates) and subsequent onset of locomotion defects that develop as a result of the collapse of the proteome. Further, the expression of the polyQ::YFP transgene can be driven by tissue-specific promoters, allowing the assessment of proteostasis across tissues in the context of an intact multicellular organism. This model is highly amenable to genetic analysis, thus providing an approach to quantify aging that is complementary to lifespan assays. We describe how to accurately measure polyQ::YFP foci formation within either neurons or body wall muscle during aging, and the subsequent onset of behavioral defects. Next, we highlight how these approaches can be adapted for higher throughput, and potential future applications using other emerging strategies for C. elegans genetic analysis.

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Proteostatic decline is a hallmark of aging, facilitating the onset of neurodegenerative diseases. We outline a protocol to quantifiably measure proteostasis in two different Caenorhabditis elegans tissues through heterologous expression of polyglutamine repeats fused to a fluorescent reporter. This model allows rapid in vivo genetic analysis of proteostasis.

Количественная оценка тканеспецифического снижения протеостатического снижения caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This increased attention has called for the diversification and improvement of animal models capable of reproducing disease phenotypes observed in humans with PCDs. Though murine models have proven invaluable, they are expensive and are associated with laborious, low-throughput methods. Use of the Caenorhabditis elegans nematode model to study PCDs has been justified by its relative ease of maintenance, low cost, and rapid generation time, which allow for high-throughput applications. Additionally, high conservation between the C. elegans and human genomes makes this model an invaluable discovery tool. Nematodes that express fluorescently tagged tissue-specific polyglutamine (polyQ) tracts exhibit age- and polyQ length-dependent aggregation characterized by fluorescent foci. Such reporters are often employed as proxies to monitor changes in proteostasis across tissues. Manual aggregate quantification is time-consuming, limiting experimental throughput. Furthermore, manual foci quantification can introduce bias, as aggregate identification can be highly subjective. Herein, a protocol consisting of worm culturing, image acquisition, and data processing was standardized to support high-throughput aggregate quantification using C. elegans that express intestine-specific polyQ. By implementing a C. elegans-based image processing pipeline using CellProfiler, an image analysis software, this method has been optimized to separate and identify individual worms and enumerate their respective aggregates. Though the concept of automation is not entirely unique, the need to standardize such procedures for reproducibility, elimination of bias from manual counting, and increase throughput is high. It is anticipated that these methods can drastically simplify the screening process of large bacterial, genomic, or drug libraries using the C. elegans model.

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

The following protocol describes the development and optimization of a high-throughput workflow for worm culturing, fluorescence imaging, and automated image processing to quantify polyglutamine aggregates as an assessment of changes in proteostasis.

Автоматизация количественной оценки агрегатов в Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...