Este método será útil para estudios biológicos básicos relacionados con la interacción entre la microbiota intestinal y la salud intestinal. Además, Este protocolo se puede utilizar para la detección de posibles probióticos y nutracéuticos para curar problemas de salud intestinal, como síndrome intestinal con fugas y enfermedades inflamatorias intestinales. Este protocolo utiliza un sistema de imágenes de alto rendimiento para permitir un análisis cuantitativo rápido y preciso de la permeabilidad intestinal en C.elegans tratados con diversas bacterias y productos químicos.
Recomendamos que un científico que no esté familiarizado con esta técnica limite el número de muestras para evitar el etiquetado incorrecto y otros errores. Este procedimiento consta de muchos pasos que requieren demostración visual, como la transferencia de gusanos a placas de 96 pozos y el uso de la máquina Operetta, así como el software Harmony. Comience preparando 500 mililitros de medio LB estéril.
Inocular una sola colonia de P.aeruginosa en el medio, e incubar el cultivo durante 14 a 15 horas a 37 grados celsius mientras se agita a 150 rpm. Al día siguiente, distribuya uniformemente el cultivo bacteriano en dos tubos de 500 mililitros, y centrifugarlos a 3, 220 veces g y cuatro grados centígrados durante 30 minutos. Retire el sobrenadante, dejando 25 mililitros en cada tubo, para un volumen restante total de 50 mililitros, luego resuspender el pellet bacteriano.
Almacene el cultivo bacteriano a cuatro grados centígrados hasta que esté listo para usar. Para probar los efectos de las bacterias en la permeabilidad intestinal de C.elegans, retire los cultivos del refrigerador, y vórtice a fondo. Agregue un total de 800 microlitros a cada placa NGM fresca, y deje que las placas se sequen en una incubadora de 20 grados Celsius durante la noche.
Para preparar las placas DIM, agregue 50 mililitros de medio de agar NGM en una botella de caldo de DIM que contenga caldo NGM, y mezcle bien. Luego, vierta 20 mililitros del medio en cada plato Petri de 90 por 15 milímetros. Prepare las placas DMSO añadiendo 20 mililitros de DMSO que contengan el medio NGM a cada plato Petri, y deje las placas a temperatura ambiente durante al menos tres horas para solidificarse.
Esparza 800 microlitros de cultivo de E.coli o P.aeruginosa con vórtice en cada placa NGM fresca, y deja que las placas se sequen en una incubadora de 20 grados Celsius durante la noche. Lave las larvas L4 sincronizadas por la edad con S-buffer y transfiera aproximadamente 500 gusanos a las placas NGM que contienen diferentes bacterias y productos químicos. Luego, incuba las placas a 20 grados centígrados durante 48 horas.
Prepare las placas suplementadas con FITC-dextran mezclando dos mililitros de E.coli termoactivado con cuatro miligramos de FITC-dextran. Agregue 100 microlitros de la mezcla a cada una de las 20 placas de agar NGM frescas, y deje que las placas se sequen durante una hora en un banco de laboratorio limpio. Después de 48 horas de tratamiento, lave los gusanos con S-buffer, transfieralos a placas suplementadas con FITC-dextran y a placas NGM sin FITC-dextran, e incubar las placas durante la noche.
Al día siguiente, lave los gusanos con S-buffer y déjelos arrastrarse en la placa de agar NGM fresca durante una hora. Agregue 50 microlitros de 4%formaldehído a cada pozo de una placa negra de 96 bien, de fondo plano, y transfiera aproximadamente 50 gusanos a cada pozo. Después de uno a dos minutos, retire todo el formaldehído y agregue 100 microlitros de medio de montaje en cada pozo.
El formaldehído es un producto químico tóxico y debe manipularse con cuidado. Para capturar imágenes fluorescentes, pulse el icono Abrir tapa dentro del software de imágenes e inserte la placa en la máquina. Haga clic en Configuración, seleccione el tipo de placa y agregue los canales brightfield y EGFP.
Para ajustar el diseño, vaya a la selección Diseño y seleccione Seguimiento. Establezca la primera imagen en un micrómetro, el número de planos a 10 y la distancia a un micrómetro. Seleccione uno de los pozos de tratamiento y un campo de captura, y pulse Probar en la sección Ejecutar experimento.
Si las imágenes son satisfactorias, vuelva a la sección Configuración y pulse el icono Restablecer. A continuación, seleccione todos los pozos de destino y un número adecuado de campos de captura. Vaya a Ejecutar experimento, introduzca el nombre de la placa y pulse Inicio.
Para medir la intensidad de la fluorescencia, vaya a la sección Análisis de imagen, introduzca la imagen y busque la celda eligiendo el canal EGFP y el método B.Ajuste los parámetros según las direcciones del manuscrito y elija la media como salida. Pulse el icono Aplicar para guardar la configuración. Para obtener un mapa de calor y una tabla de datos, vaya a la sección Evaluación y ajuste el parámetro de lectura y, a continuación, inicie la evaluación.
C.elegans mostró un aumento significativo de la fluorescencia FITC-dextran después de la incubación con P.aeruginosa en comparación con las otras dos cepas bacterianas, lo que indica que P.aeruginosa causó más daño vital a la barrera intestinal epitelial y mayor permeabilidad intestinal. P.aeruginosa vivo e inactivado por calor desencadenó efectos muy diferentes sobre la permeabilidad intestinal en C.elegans. Tras la inactivación del calor, tanto las imágenes de fluorescencia como los datos estadísticos indican que P.aeruginosa no desencadenó toxicidad para los nematodos.
Un co-tratamiento de 48 horas con DIM disminuyó significativamente la intensidad de fluorescencia FITC-dextran dentro de las tripas de los gusanos expuestos a P.aeruginosa, lo que demuestra que DIM puede considerarse un buen producto natural para curar la disfunción de la permeabilidad intestinal causada por infecciones bacterianas. Es importante recordar que durante la preparación de las placas recubiertas FITC-dextran, es necesario minimizar la exposición a la luz debido a la sensibilidad a la luz de FITC-dextran. Esta técnica se puede utilizar para determinar los efectos patógenos y probióticos de las bacterias intestinales y sus componentes activos mediante la prueba de las bacterias, así como su composición química.
