Este trabajo fue apoyado por el Instituto Friedrich Miescher para la Investigación Biomédica, la Sociedad Max Planck y el Programa Científico Fronteras Humanos.

Fueron aprobadas y realizadas de conformidad con las directrices del Departamento del Cantón de Basilea-Ciudad Veterinario Todos los procedimientos con animales. 1. Hardware y software de instalación <ol><li> Dos fotones configuración microscopio de barrido: <ol><li> Utilice un láser infrarrojo pulsante como una fuente de iluminación (ancho de pulso &lt;120 fs). </li><li> Utilice una exploración de cabeza compuesto por un escáner de resonancia 8 o 12 kHz y un nivel galvanómetro Nota:. Esto permite velocidades de fotogramas de 40 o 60 Hz a 750 x 400 píxeles. Una alta tasa de cuadros es fundamental para minimizar el movimiento del cerebro distorsión de la imagen inducida. Por otra parte, los resultados de escaneo rápido resonantes en un rendimiento de señal más alta y reduce fotoblanqueo 16 y fototoxicidad. </li><li> Utilice una velocidad alta Z-paso a paso piezoeléctrico secuencialmente tiempo adquirir imágenes intercaladas en múltiples profundidades Nota:. Esto es opcional y se utiliza para aumentar el rendimiento de datos a costa de la velocidad de fotogramas. </li><li> Utilice amsupresor ecánico para reducir la exposición al láser al tejido. Ajuste de la anchura de la supresor dependiendo de la amplitud de la escáner resonante Nota:. Debido a la naturaleza sinusoidal de la trayectoria de exploración de un escáner de resonancia, el haz de láser se mueve comparativamente lenta en los puntos de respuesta de exploración. Para prevenir el daño del tejido en estos puntos de entrega en donde la exposición al láser es más grande, un supresor de mecánica se introduce en el plano focal entre la exploración y lentes de tubo que detiene el haz de láser. </li><li> Para la adquisición de datos utilizar un digitalizador de alta velocidad (800 MHz) en combinación con un arreglo de compuertas programables en campo (FPGA) Nota:. Los filtros de paso alto FPGA y cubos de la señal de PMT en píxeles. La combinación del filtro de paso alto en el FPGA y el filtro de paso bajo eficaz en el resultado amplificador de PMT en un filtro de paso de banda de aproximadamente centrada alrededor de la frecuencia de repetición del láser (80 MHz). Código FPGA ejemplo se proporciona como un suplemento. </li></ol></li><li> Configuración de la rueda de ardilla hinchable basado en el diseño de Dombeck y colegas 2 <ol><li> Conectar el soporte de la bola a una línea de suministro de aire usando un tubo de suministro de aire de al menos 10 mm de diámetro interior. Maximizar la sección transversal de la entrada de suministro de aire soporte de bola y colocar amplia cantidad de tubo entre el suministro de aire principal y el soporte de la bola Nota:. Aumento de la sección transversal y el aumento de longitud de la tubería de suministro de aire reduce la generación de ruido. </li><li> Colocar una bola de espuma de poliestireno (20 cm de diámetro) en un soporte de bola de diseño personalizado e impreso-3D. </li><li> Si el paradigma de comportamiento requiere solamente hacia delante (o hacia atrás) la locomoción, restringir el movimiento de la bola para el eje horizontal (pitch) mediante la inserción de un pasador (por ejemplo, una aguja hipodérmica 19 G) en el lado de la bola Nota:. Normalmente los animales se adaptan a la configuración mucho más rápido en este paradigma de rotación reducida. </li><li> Seguir el movimiento de la pelota, usando uno o dos ratones de ordenador ópticopara detectar el movimiento en torno a dos o de los tres ejes, respectivamente Nota:. Los ratones de ordenador idealmente deben operar con un diodo de infrarrojos para la menor interferencia con la imagen. </li></ol></li><li> Configuración del entorno de realidad virtual <ol><li> Prepare el entorno de realidad virtual Nota:. Un entorno de ejemplo basado en Panda3D, un motor de juego de libre acceso, se proporciona como un suplemento. Los objetos del entorno virtual se generan utilizando Wings3D, un modelador 3D de código abierto. El programa de ejemplo lee la información de posición en una tarjeta de adquisición de datos y esto se traduce en movimiento en el entorno virtual. El código también realiza la transformación no lineal necesario para el medio ambiente que se proyecta sobre una pantalla toroidal. La construcción detallada de la pantalla toroidal se ha descrito en otra parte 14,17. </li><li> Utilice proyectores LED o pantallas de ordenador con retroiluminación LED para mostrar el entorno virtual. Integrar una cir gatingCUIT para el parpadeo rápido de los LEDs durante la exploración Nota:. Un problema inherente en dos fotones de imágenes durante la estimulación visual es fuga de luz procedente del sistema de estimulación visual, que puede reducirse mediante el blindaje del objetivo. Sin embargo, la fuga de luz del sistema de estimulación visual puede ser completamente abolida mediante la sincronización de la salida de luz del proyector a los puntos de entrega del escáner de resonancia (cuando los datos no son adquiridos), como se hace con arenas LED utilizados para la estimulación visual durante la exploración en 18 de Drosophila. Esto resulta en una alternancia de alta velocidad efectiva de estimulación visual y adquisición de datos (véase la Figura 2). La frecuencia de parpadeo (24 kHz) es órdenes de magnitud por encima del umbral de fusión de parpadeo, por encima del cual el parpadeo ya no se percibe por el animal. El diagrama del circuito electrónico de esta modificación a un proyector LED comercial se muestra en la Figura 3. </li></ol></li><li> Cachorroil seguimiento <ol><li> Utilice una cámara de vídeo basado en CMOS (30 fps) para el seguimiento de posición de la pupila. Asegúrese de que la cámara no contiene un filtro de bloqueo de infrarrojos Nota:. La pupila es visible en alto contraste durante las grabaciones debido a la luz difusa procedente del láser de excitación de dos fotones que sale a través del ojo. Posición de la pupila y el diámetro se extrae en tiempo real mediante un software personalizado programado basado en el diseño de Sakatani e Isa 19. </li></ol></li></ol> 2. La inyección de indicador de calcio Genética y Ventana de Implantes La inyección de un indicador de calcio 20 y la implantación de la ventana craneal 21 se realizó como se describió anteriormente con las siguientes adiciones: <ol><li> Inyectar el virus en la región de interés usando una pipeta de inyección de vidrio se rellenó con solución de virus y conectado a un sistema de inyección a presión. Ajustar la presión en función de la pipeta interna-de diámetro, típicamente aprox. 70-140 mbar, para inyectar aproximadamente 100 nl de solución de virus en el transcurso de 1-2 min. Pulsos de inyección de bajo volumen entregado a baja frecuencia (0,05 pulsos segundos a 2 Hz) deben ser utilizados con el fin de evitar el desbordamiento del virus a lo largo de la pipeta durante la inyección Nota:. Con el fin de controlar el volumen de inyección, la pipeta puede estar marcado en pequeña , longitudes iguales de tiempo (por ejemplo, 0,5 mm) bajo un microscopio estereoscópico. El desplazamiento del menisco entre las marcas puede ser utilizado para estimar el volumen inyectado. </li><li> Varias semanas después de la inyección de esto debería resultar en un bolo de células densamente marcados con un diámetro de aproximadamente 500 micras. La eficacia de expresión GECI en la región de interés depende de la elección de la combinación promotor GECI y, así como el título infeccioso y el serotipo de AAV recombinante utilizado Nota:. Como un ejemplo representativo, la inyección de AAV2/1-EF1α-GCaMP5 con una teta viraler de 8 x 10 12 GC / ml en la corteza visual primaria de un ratón produce la expresión satisfactoria en aproximadamente dos semanas después de la inyección (Figura 1). </li><li> La barra de la cabeza no debe obstruir el campo visual del ratón, pero debe ser lo suficientemente rígido para permitir la formación de imagen estable durante comportamiento. Esto normalmente requiere dos puntos de unión en ambos lados de la barra de la cabeza (ver Figura 1). Para sujetar firmemente la barra de la cabeza en el cráneo, asegúrese de maximizar y seque el área del cráneo expuesta donde se colocará la barra de cabeza. Además, el uso de un bisturí o una jeringa, rayar el cráneo para crear ranuras superficiales, aumentando así el área de superficie para el encolado. Cubrir el hueso con tejido adhesivo cianoacrilato antes de colocar la barra de la cabeza con cemento dental. </li></ol> 3. Procedimiento experimental <ol><li> Dos o tres semanas después de la inyección de virus, compruebe la ventana implante craneal para la claridad y la expresión bajo epiiluminación de fluorescencia. Límites claramente visibles y claramente definidas de los vasos sanguíneos superficiales son una buena indicación de que el implante ventana es adecuado para la formación de imágenes (véase la Figura 1). </li><li> Medir y ajustar la potencia del láser a un valor por debajo de 50 mW a la muestra. </li><li> Encienda el flujo de aire a la rueda de ardilla esférica. </li><li> Para fijar la cabeza bajo el microscopio, anestesiar brevemente el animal con isoflurano para reducir el estrés. Colocar el animal en un recipiente de anestesia con isoflurano y esperar hasta que las paradas de animales en movimiento (aproximadamente 10 segundos). Retire el animal e inmediatamente la cabeza fijarlo en el microscopio. </li><li> Coloque el sistema de presentación visual lo más cerca posible al animal a todavía permitir el acceso al animal. El contacto visual a menos que el animal tiene con el experimentador, menos estresado el animal será durante la fase inicial del experimento. </li><li> Asegúrese de que la ventana de implante craneal está libre de polvo y suciedad. Limpie con aguasi es necesario. </li><li> Aplicar gel de ultrasonido claro como medio de inmersión entre la ventana craneal y objetivo de inmersión en agua. Esto resuelve los problemas de degradación de la imagen lento debido a la evaporación de agua o fugas y elimina la necesidad de montar un cono en la barra de la cabeza para contener el agua Nota:. Centrífuga el gel antes de su uso para eliminar todas las burbujas de aire, y tener cuidado de no crear ningún aire burbujas durante la aplicación del gel. Las burbujas de aire pueden afectar seriamente la calidad de imagen. </li><li> Envuelva un pedazo de cinta negro alrededor de la barra de objetivo y la cabeza de protección de la luz. </li><li> Mueva el entorno de arena virtual a su posición final y ajustar la cámara de vídeo para el seguimiento de los alumnos. </li><li> Ajuste el supresor de láser para que coincida con la amplitud de exploración utilizado durante el experimento. </li><li> Inicie la grabación de datos. </li></ol>

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	<li>Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Miniature+Head-Mounted+Two-Photon+MicroscopeHigh-Resolution+Brain+Imaging+in+Freely+Moving+Animals.">A Miniature Head-Mounted Two-Photon MicroscopeHigh-Resolution Brain Imaging in Freely Moving Animals.</a> Neuron. 31 (6), 903-912 (2001).</li><li>Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+large-scale+neural+activity+with+cellular+resolution+in+awake,+mobile+mice.">Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice.</a> Neuron. 56, 43-57 (2007).</li><li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+dynamic+representations+in+the+motor+cortex+during+sensorimotor+learning.">Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning.</a> Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).</li><li>Keller, G. B., Bonhoeffer, T., H&#252;bener, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorimotor+mismatch+signals+in+primary+visual+cortex+of+the+behaving+mouse.">Sensorimotor mismatch signals in primary visual cortex of the behaving mouse.</a> Neuron. 74 (5), 809-815 (2012).</li><li>Akerboom, J., Chen, T. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+Calcium+Indicator+for+Neural+Activity+Imaging.">Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging.</a> J. Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li><li>Zhao, Y., Araki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+expanded+palette+of+genetically+encoded+Ca2++indicators.">An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators.</a> Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).</li><li>Mittmann, W., Wallace, D. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+calcium+indicator+for+chronic+in+vivo+two-photon+imaging.">A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging.</a> Nat. Methods. 5 (9), 805-811 (2008).</li><li>Margolis, D. J., L&#252;tcke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+cortical+population+activity+imaged+throughout+long-term+sensory+deprivation.">Reorganization of cortical population activity imaged throughout long-term sensory deprivation.</a> Nat. Neurosci. 15 (11), 1539-1546 (2012).</li><li>Zariwala, H. A., Borghuis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cre-dependent+GCaMP3+reporter+mouse+for+neuronal+imaging+in+vivo.">A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo.</a> J. Neurosci. 32 (9), 3131-3141 (2012).</li><li>Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+dynamics+of+hippocampal+place+cells+during+virtual+navigation.">Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation.</a> Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).</li><li>H&#246;lscher, C., Schnee, A., Dahmen, H., Setia, L., Mallot, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rats+are+able+to+navigate+in+virtual+environments.">Rats are able to navigate in virtual environments.</a> J. Exp. Biol. 208, 561-5519 (2005).</li><li>Borlinghaus, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRT+letter:+high+speed+scanning+has+the+potential+to+increase+fluorescence+yield+and+to+reduce+photobleaching).">MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching).</a> Microsc. Res. Tech. 69 (9), 689-692 (2006).</li><li>Reiff, D. F., Plett, J., Mank, M., Griesbeck, O., Borst, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virtual+Reality+for+Mice,+mousevr.blogspot.com.">Virtual Reality for Mice, mousevr.blogspot.com.</a> Nat. Neurosci. 13, 973-978 (2010).</li><li>Sakatani, T., Isa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+spontaneous+saccade-like+rapid+eye+movements+in+C57BL/6+mice.">Quantitative analysis of spontaneous saccade-like rapid eye movements in C57BL/6 mice.</a> Neurosci. Res. 58, 324-331 (2007).</li><li>Golshani, P., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+2-photon+calcium+imaging+in+layer+2/3+of+mice.">In vivo 2-photon calcium imaging in layer 2/3 of mice.</a> J. Vis. Exp. (13), (2008).</li><li>Holtmaat, A., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Schmidt-Hieber, C., H&#228;usser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+spatial+navigation+in+the+medial+entorhinal+cortex.">Cellular mechanisms of spatial navigation in the medial entorhinal cortex.</a> Nat. Neurosci. 16 (3), 325-331 (2013).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

La clave para el éxito de comportamiento de formación de imágenes de dos fotones es la estabilidad de la preparación de dos maneras: <ol><li> En el transcurso de la implantación ventana días post, respuestas inflamatorias del tejido pueden conducir a la mejora de la formación de tejido de granulación y el cartílago que dificultar o incluso impedir formación de imágenes. </li><li> Durante el experimento, el cerebro tiene que ser lo suficientemente estable para evitar los artefactos de movimiento corrompa l...

Dos fotones de imágenes de los indicadores de calcio (genéticamente codificados como GCaMP5 7 o R-GECO 8, o colorantes sintéticos como OGB o Fluo4) ha emergido como un poderoso método para medir la actividad neuronal en ratones comportarse 1-6. Se permite la medición simultánea de la actividad de cientos de células en acción cerca de un solo potencial de resolución, de hasta aproximadamente 800 m por debajo de la superficie del cerebro 9,10. Por otra parte, el uso de indicadores de calcio codificados genéticamente (Gecis) la actividad neuronal se puede medir crónicamente 5,11,12, y en tipos de células genéticamente definidas 13. En conjunto, estos métodos proporcionan un grado de resolución temporal y espacial que abre una multitud de nuevas posibilidades en el estudio de la computación neuronal in vivo. La intervención quirúrgica es necesaria para exponer y etiquetar el cerebro de un ratón para la imagen. Las células se transfectaron usando típicamente un Vir adeno-asociado recombinante<html> nos sistema (AAV) para la entrega GECI y una ventana craneal se implanta en el sitio de la inyección para obtener acceso óptico al cerebro. Un bar de la cabeza se une entonces al cráneo para la fijación de la cabeza bajo el microscopio de dos fotones. El diseño y la implementación de estas medidas es fundamental ya que la mayoría de los problemas con las imágenes despierto surgen de la inestabilidad en la preparación. Idealmente, el procedimiento descrito aquí debe permitir para formación de imágenes crónica de hasta varios meses después de la cirugía. Para habilitar el comportamiento guiado visualmente durante dos fotones de imágenes, el ratón fijo cabeza se sienta en una cinta de correr esférica aire apoyado, que puede utilizar para navegar por un entorno de realidad virtual. Locomoción del ratón en la cinta se acopla al movimiento en el entorno virtual que se muestra en una pantalla toroidal que rodea el 14,15 ratón. Variables de comportamiento, tales como locomoción, el estímulo visual, y la posición de la pupila se pueden grabar 6. t &quot;&gt; Se describen los procedimientos involucrados en la crónica de dos fotones en ratones explorando un entorno de realidad virtual Los puntos clave abordados son:. reducción de artefactos de movimiento, la reducción de la fuga de luz, la maximización del número de células grabadas de forma simultánea, y la minimización de el daño por luz. También dio detalles sobre la configuración de la rueda de ardilla hinchable, el seguimiento de los alumnos, y el entorno de realidad virtual. Los procedimientos descritos aquí se pueden utilizar para obtener imágenes de las poblaciones de células marcadas con fluorescencia en ratones fijos en la cabeza en un potencialmente amplia variedad de paradigmas de comportamiento .

<table><tbody><tr><td>Cover slips (diameter = 3-5 mm)</td><td>Menzel</td><td></td><td>window implant</td></tr><tr><td>InSight DeepSee laser</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td>microscope</td></tr><tr><td>12 kHz Resonance scanner</td><td>Cambridge Technology</td><td>G1-003-30026</td><td>microscope</td></tr><tr><td>Galvometer</td><td>Cambridge Technology</td><td>G6215H</td><td>microscope</td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>National Instruments</td><td>NI 5772</td><td>microscope</td></tr><tr><td>FPGA</td><td>National Instruments</td><td>PXIe 7965R</td><td>microscope</td></tr><tr><td>Acquisition card</td><td>National Instruments</td><td>PCIe 6363</td><td>microscope</td></tr><tr><td>Emission filter 525/50</td><td>Semrock</td><td>FF03-525/50-25</td><td>microscope</td></tr><tr><td>Piezo-electric z-drive</td><td>Physikinstrumente</td><td>P-726.1CD</td><td>microscope</td></tr><tr><td>Controller for Piezo-electric drive</td><td>Physikinstrumente</td><td>E665 LVPZT</td><td>microscope</td></tr><tr><td>Objective 16X, 0.8NA</td><td>Nikon</td><td>CFI75</td><td>microscope</td></tr><tr><td>Current amplifier</td><td>Femto</td><td>DHPCA-100</td><td>microscope</td></tr><tr><td>Photomultiplier tube</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td>microscope</td></tr><tr><td>USB Camera without IR filter</td><td>ImagingSource</td><td>DMK22BUC03</td><td>pupil tracking</td></tr><tr><td>Objective 50 mm</td><td>ImagingSource</td><td>M5018-MP</td><td>pupil tracking</td></tr><tr><td>Macro adapter rings</td><td>ImagingSource</td><td>LAexSet</td><td>pupil tracking</td></tr><tr><td>Optical computer mouse</td><td>Logitech</td><td>G500</td><td>motion tracking</td></tr><tr><td>Styrofoam ball 20 cm</td><td>e.g. idee-shop.de</td><td>08797.00.15</td><td>virtual environment</td></tr><tr><td>LED projector</td><td>Samsung</td><td>SP-F10M</td><td>virtual environment</td></tr><tr><td>Acquisition card</td><td>National Instruments</td><td>NI 6009</td><td>virtual environment</td></tr><tr><td>Panda3D game engine</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.panda3d.org/&quot;&gt;www.panda3d.org&lt;/a&gt;</td><td>virtual environment</td></tr><tr><td>Numpy library for Python</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.scipy.org/&quot;&gt;www.scipy.org&lt;/a&gt;</td><td>virtual environment</td></tr><tr><td>Scipy library for Python</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.scipy.org/&quot;&gt;www.scipy.org&lt;/a&gt;</td><td>virtual environment</td></tr><tr><td>NI-DAQmx driver</td><td>National Instruments</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.ni.com/&quot;&gt;www.ni.com&lt;/a&gt;</td><td>virtual environment</td></tr><tr><td>Ultrasound gel</td><td>Dahlhausen</td><td>5701.0342.10</td><td>imaging</td></tr></tbody></table>

two-photon calcium imaging in mice navigating a virtual reality environment

En los últimos años, dos fotones de imágenes se ha convertido en una herramienta muy valiosa en la neurociencia, ya que permite la medición de crónica de la actividad de las células identificadas genéticamente durante comportamiento 1-6. Aquí se describen los métodos para llevar a cabo de dos fotones en la corteza del ratón mientras el animal se desplaza un entorno de realidad virtual. Nos centramos en los aspectos de los procedimientos experimentales que son clave para obtener imágenes en un animal se comporta en un entorno virtual muy iluminada. Los principales problemas que se presentan en este montaje experimental que aquí la dirección estamos: minimizando los artefactos de movimiento relacionadas con el cerebro, reduciendo al mínimo la fuga de luz del sistema de proyección de realidad virtual, y minimizando el daño tisular inducida por láser. También proporcionamos software muestra para controlar el entorno de realidad virtual y de hacer el seguimiento de los alumnos. Con estos procedimientos y recursos debería ser posible convertir un microscopio de dos fotones convencional para su uso en comportarse ratones.

La calidad de imagen en imágenes de calcio de dos fotones de las poblaciones de células marcadas con un GECI depende en gran medida de la calidad de la ventana de implante craneal. Dos semanas después de la inyección del virus de la ventana del cráneo deben ser inspeccionados para mayor claridad. No debe haber ningún tejido de granulación o recrecimiento del hueso visible (Figura 1A). Por otra parte, el patrón de los vasos sanguíneos superficiales debe permanecer sin cambios y los límites de l...

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Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment

Aquí se describen los procedimientos experimentales que participan en dos fotones de imágenes de la corteza del ratón durante comportamiento en un entorno de realidad virtual.

Dos fotones de imágenes de calcio en ratones Recorriendo un entorno de realidad virtual

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically ...

two-photon-calcium-imaging-mice-navigating-virtual-reality

Research

JoVE Journal

Behavior

30.9K vistas.  Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research.  Aquí se describen los procedimientos experimentales que participan en dos fotones de imágenes de la corteza del ratón durante comportamiento en un entorno de realidad virtual. 

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In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

En Vivo 2-Photon imágenes de calcio en la capa 2 / 3 de los ratones

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

Investigación

Biología

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical neurons with two-photon microscopy has provided unique insights into cortical structure, function and plasticity. However, these studies are limited to head fixed animals, greatly reducing the behavioral complexity available for study. In this paper, we describe a procedure for performing chronic fluorescence microscopy with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely behaving mice. We used an integrated miniaturized fluorescence microscope paired with an implanted prism probe to simultaneously visualize and record the calcium dynamics of hundreds of neurons across multiple layers of the somatosensory cortex as the mouse engaged in a novel object exploration task, over several days. This technique can be adapted to other brain regions in different animal species for other behavioral paradigms.

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Here, we present a procedure for performing large-scale Ca2+ imaging with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely moving mice. Hundreds of active cells can be observed simultaneously using a miniature, head-mounted microscope coupled with an implanted prism probe.

Ca Cortical Multi-capa<sup&gt; 2+</sup&gt; Imágenes en ratones con movimientos libres con sondas de prisma y microscopía de fluorescencia miniaturizada

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

Comportamiento

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In vivo de dos fotones de imágenes de dependientes Experience-Los cambios moleculares en las neuronas corticales

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Neurociencias

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultánea de dos fotones<em&gt; En Vivo</em&gt; Imágenes de entradas sinápticas y Objetivos postsinápticos en la corteza del ratón retroesplenial

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

In vivo Imágenes de calcio en la aceituna inferior de ratón

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their activity in vivo in behaving mice. This paper describes a method for the implantation of a chronic cranial window to allow for the longitudinal imaging of brain cells in awake, head-restrained mice. In combination with genetic strategies and viral injections, it is possible to label specific cells and regions of interest with structural or physiological markers. This protocol demonstrates how to combine viral injections to label neurons in the vicinity of GCaMP6-expressing astrocytes in the cortex for simultaneous imaging of both cells through a cranial window. Multiphoton imaging of the same cells can be performed for days, weeks, or months in awake, behaving animals. This approach provides researchers with a method for viewing cellular dynamics in real time and can be applied to answer a number of questions in neuroscience.

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Presented here is a protocol for the implantation of a chronic cranial window for the longitudinal imaging of brain cells in awake, head-restrained mice.

Implantación de una ventana craneal para imágenes repetidas in vivo en ratones despiertos

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in the brain sense various biological conditions in the periphery and transmit the signals to neurons. Microglia, immune cells in the brain, are involved in synaptic development and plasticity. Therefore, the contribution of microglia to neural circuit construction in response to the internal state of the body should be tested critically by intravital imaging of the relationship between microglial dynamics and neuronal activity.
Here, we describe a technique for the simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice. Adeno-associated virus encoding R-CaMP, a gene-encoded calcium indicator of red fluorescence protein, was injected into layer 2/3 of the primary visual cortex in CX3CR1-EGFP transgenic mice expressing EGFP in microglia. After viral injection, a cranial window was installed onto the brain surface of the injected region. In vivo two-photon imaging in awake mice 4 weeks after the surgery demonstrated that neural activity and microglial dynamics could be recorded simultaneously at the sub-second temporal resolution. This technique can uncover the coordination between microglial dynamics and neuronal activity, with the former responding to peripheral immunological states and the latter encoding the internal brain states.

Here, we describe a protocol combining adeno-associated virus injection with cranial window implantation for simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice.

Imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the other hand, two-photon imaging can resolve the activity of local neural circuits at the single-cell level. It is critical to make a large cranial window to perform multiple-scale analysis using both imaging techniques in the same mouse. To achieve this, one must remove a large section of the skull and cover the exposed cortical surface with transparent materials. Previously, glass skulls and polymer-based cranial windows have been developed for this purpose, but these materials are not easily fabricated. The present protocol describes a simple method for making a large cranial window consisting of commercially available polyvinylidene chloride (PVDC) wrapping film, a transparent silicone plug, and a cover glass. For imaging the dorsal surface of an entire hemisphere, the window size was approximately 6 x 3 mm2. Severe brain vibrations were not observed regardless of such a large window. Importantly, the condition of the brain surface did not deteriorate for more than one month. Wide-field imaging of a mouse expressing a genetically-encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6f, specifically in astrocytes, revealed synchronized responses in a few millimeters. Two-photon imaging of the same mouse showed prominent calcium responses in individual astrocytes over several seconds. Furthermore, a thin layer of an adeno-associated virus was applied to the PVDC film and successfully expressed GECI in cortical neurons over the cranial window. This technique is reliable and cost-effective for making a large cranial window and facilitates the investigation of the neural and glial dynamics and their interactions during behavior at the macroscopic and microscopic levels.

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

The present protocol describes making a large (6 x 3 mm2) cranial window using food wrap, transparent silicone, and cover glass. This cranial window allows in vivo wide-field and two-photon calcium imaging experiments in the same mouse.

In vivo Imágenes de calcio de campo amplio y dos fotones de un ratón usando una ventana craneal grande

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...

An Open-Source Virtual Reality System for the Measurement of Spatial Learning in Head-Restrained Mice

Head-restrained behavioral experiments in mice allow neuroscientists to observe neural circuit activity with high-resolution electrophysiological and optical imaging tools while delivering precise sensory stimuli to a behaving animal. Recently, human and rodent studies using virtual reality (VR) environments have shown VR to be an important tool for uncovering the neural mechanisms underlying spatial learning in the hippocampus and cortex, due to the extremely precise control over parameters such as spatial and contextual cues. Setting up virtual environments for rodent spatial behaviors can, however, be costly and require an extensive background in engineering and computer programming. Here, we present a simple yet powerful system based upon inexpensive, modular, open-source hardware and software that enables researchers to study spatial learning in head-restrained mice using a VR environment. This system uses coupled microcontrollers to measure locomotion and deliver behavioral stimuli while head-restrained mice run on a wheel in concert with a virtual linear track environment rendered by a graphical software package running on a single-board computer. The emphasis on distributed processing allows researchers to design flexible, modular systems to elicit and measure complex spatial behaviors in mice in order to determine the connection between neural circuit activity and spatial learning in the mammalian brain.

Here, we present a simplified open-source hardware and software setup for investigating mouse spatial learning using virtual reality (VR). This system displays a virtual linear track to a head-restrained mouse running on a wheel by utilizing a network of microcontrollers and a single-board computer running an easy-to-use Python graphical software package.

Un sistema de realidad virtual de código abierto para la medición del aprendizaje espacial en ratones con cabeza restringida

Head-restrained behavioral experiments in mice allow neuroscientists to observe neural circuit activity with high-resolution electrophysiological and ...

Imágenes de calcio de dos fotones y de campo amplio en el colículo superior

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the emergence of the cerebral cortex. It receives direct inputs from ~30 types of retinal ganglion cells (RGCs), with each encoding a specific visual feature. It remains elusive whether the SC simply inherits retinal features or if additional and potentially de novo processing occurs in the SC. To reveal the neural coding of visual information in the SC, we provide here a detailed protocol to optically record visual responses with two complementary methods in awake mice. One method uses two-photon microscopy to image calcium activity at single-cell resolution without ablating the overlaying cortex, while the other uses wide-field microscopy to image the whole SC of a mutant mouse whose cortex is largely undeveloped. This protocol details these two methods, including animal preparation, viral injection, headplate implantation, plug implantation, data acquisition, and data analysis. The representative results show that the two-photon calcium imaging reveals visually evoked neuronal responses at single-cell resolution, and the wide-field calcium imaging reveals&#160;neural activity across the entire SC. By combining these two methods, one can reveal the neural coding in the SC at different scales, and such combination can also be applied to other brain regions.

Autor destacado: Desvelando la codificación neuronal y los mecanismos de procesamiento visual en el colículo superior 

This protocol details the procedure for imaging calcium responses in the superior colliculus (SC) of awake mice, including imaging single-neuron activity with two-photon microscopy while leaving the cortex intact in wild-type mice, and imaging the entire SC with wide-field microscopy in partial-cortex mutant mice.

Imágenes de calcio en el colículo superior de ratón

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...

Dos fotones de imágenes de calcio en ratones Recorriendo un entorno de realidad virtual

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