이 작품은 생물 의학 연구를위한 프리드리히 Miescher 연구소, 막스 플랑크 사회, 인간 프론티어 과학 프로그램에 의해 지원되었다.

모든 동물의 절차는 승인 광저우 바젤 슈타 트의 수의학 부서의 지침에 따라 수행 하였다. 1. 하드웨어 및 소프트웨어 설치 <ol><li> 두 광자 주사 현미경 설정 : <ol><li> 조명 원 (펄스 폭 &lt;120 FSEC)로 펄스 적외선 레이저를 사용합니다. </li><li> . 8 또는 12 kHz의 공진 스캐너와 표준 검류계 주 구성 스캔 헤드를 사용 :이 750 X 400 픽셀에서 40 또는 60Hz의 프레임 속도를 가능하게한다. 높은 프레임 레이트는 뇌 운동 유도 화상의 왜곡을 최소화하기 위해 중요하다. 또한, 빠른 공진 스캔 높은 신호 수율 결과와 감소는 16 광독성을 photobleaching에. </li><li> 여러 깊이에서 획득 시간 인터리빙 된 이미지를 순차적으로 압전 고속 Z-스테퍼를 사용하여 참고.이 선택 및 프레임 레이트의 희생 데이터 수율을 높이기 위해 사용된다. </li><li> 오전을 사용하여조직에 레이저 노출을 줄이기 echanical 랭커. 스캐너의 공진 진폭에 따라 블 랭커의 폭을 조정 주 :. 인해 공진 스캐너의 스캔 경로의 정현파 성질, 레이저 빔 주사 턴어라운드 점에서 비교적 느린 이동. 레이저 노광이 가장 크다 이러한 턴어라운드 지점에서 조직의 손상을 방지하기 위해, 기계적 랭커는 레이저 빔을 정지 스캔 및 튜브 렌즈 사이의 초점면에 도입된다. </li><li> . 데이터 수집을위한 필드 프로그래머블 게이트 어레이 (FPGA) 주와 함께 고속 디지타이저 (800 메가 헤르츠)를 사용 : FPGA 고역 통과 필터 및 화소로 PMT 신호 궤. 대역 통과 필터의 PMT 증폭기 결과에 FPGA 및 효과적인 저역 통과 필터의 고역 통과 필터의 조합은 대략 레이저 (80 메가 헤르츠)의 반복률을 중심. 샘플 FPGA 코드는 보충 교재로 제공된다. </li></ol></li><li> Dombeck 및 동료의 디자인을 기반으로 항공 지원 디딜 방아 설치 2 <ol><li> 적어도 10mm 내경의 공기 공급 튜브를 이용하여 공기 공급관로 볼 홀더를 연결한다. 볼 홀더 급기 입구의 단면적을 최대화하고 메인 급기와 볼 홀더 주 사이 튜브의 충분한 양을 넣. 증가 단면과 공기 공급 튜브의 증가 된 길이는 소음 발생을 감소시킨다. </li><li> 맞춤 설계 및 3D 인쇄 볼 홀더에 스티로폼 볼 (20cm 직경)를 놓습니다. </li><li> 행동 패러다임은 앞으로 (뒤로) 운동이 필요한 경우, 볼의 측면에 핀 (예를 들어, 19 G 피하 주사 바늘)를 삽입하여 수평 (피치) 축에 공의 움직임을 제한 참고 :. 일반적으로 동물에 적응 이 감소 회전 패러다임에서 훨씬 빨리 설치. </li><li> 하나 또는 두 개의 광학 컴퓨터 마우스를 사용하여 공의 궤도 운동각각 두 개의 주위에 운동 또는 세 축 모두를 감지 할 수 있습니다 :. 컴퓨터 마우스 이상적 이미징 이상 간섭 적외선 다이오드와 함께 작동해야합니다. </li></ol></li><li> 가상 현실 환경 설정 <ol><li> 가상 현실 환경을 준비합니다 :. Panda3D를, 자유롭게 사용 가능한 게임 엔진을 기반으로 샘플 환경을 보충 교재로 제공된다. 가상 환경의 목적은 Wings3D, 오픈 소스 3D 모델링을 사용하여 생성됩니다. 샘플 프로그램 데이터 수집 카드에 위치 정보를 판독하고, 가상 환경에서 운동으로 이러한 변환한다. 코드는 또한 토 로이드 형 스크린 상에 투영되는 환경에 필요한 비선형 변환을 수행한다. 토 로이드 형 화면의 상세한 구성 밖에도 14, 17 설명되었다. </li><li> 가상 환경을 표시하는 LED 프로젝터 또는 LED 백라이트 컴퓨터 화면을 사용합니다. 게이팅 CIR 통합. 촬상 주 동안 LED의 빠른 플리커위한 CUIT : 시각 자극 동안 두 광자 이미징 본질적인 문제는 대물 차폐함으로써 감소 될 수있는 시각적 자극 시스템에서 발생하는 광 누설이다. 이미징 동안 시각적 인 자극에 사용되는 LED 무대와 함께 이루어집니다 그러나, 시각적 자극 시스템에서 빛 누수가 완전히 (데이터가 수집되지 않음) 공진 스캐너의 선회 지점에 프로젝터의 빛 출력을 동기화하여 폐지 할 수있다 초파리 18. 이 시각적 인 자극 및 데이터 수집의 효과적인 고속 교대 (그림 2 참조)가 발생합니다. 플리커 주파수 (24 ㎑의) 깜빡 거림이 더 이상 동물에 의해 감지되지 않는 이상, 플리커 융합 임계 값 이상 규모의 명령입니다. 시판 LED 프로젝터에 본 변형의 전자 회로도가도 3에 도시된다. </li></ol></li><li> 새끼를 낳다일리노이 추적 <ol><li> 동공 위치 추적을위한 CMOS 기반의 비디오 카메라 (30 fps)를 사용합니다. 카메라가 적외선 차단 필터를 포함하지 않는 있는지 확인하십시오 :. 학생 인해 눈을 통해 나오는 두 광자 여기 레이저에서 미광에 녹음하는 동안 높은 반면에 볼 수 있습니다. 학생의 위치와 직경은 Sakatani와 사 (19)의 디자인을 기반으로 사용자 정의 프로그래밍 소프트웨어를 사용하여 실시간으로 추출된다. </li></ol></li></ol> 2. 유전 칼슘 표시기 및 창 임플란트의 주입 이전에 다음과 같은 추가 설명 된 바와 같이 칼슘 표시기 (20)와 두개골 창 (21)의 주입의 주입이 수행된다 : <ol><li> 바이러스 용액을 채워서 및 압력 분사 시스템에 연결된 유리 주입 피펫을 이용하여 관심 영역에 바이러스를 주입. 피펫에 따라 압력을 조정 안직경, 일반적으로 약. 70-140 밀리바, 1 ~ 2 분에 걸쳐 바이러스 솔루션의 약 100 NL을 주입한다. 저주파 (2 Hz에서 0.05 초 펄스)에 전달 저용량 분사 펄스는 주사 동안 피펫 따라 바이러스의 오버 플로우를 방지하기 위해 사용되어야한다 참고. 주입량을 모니터하기 위해, 피펫은 소규모로 표시 될 수있다 , 스테레오 현미경 균등 길이 (예 : 0.5 mm). 마킹 사이의 메 니스 커스의 변위는 주입 부피를 추정하는데 사용될 수있다. </li><li> 몇 주 후 주입이 약 500 μm의 직경과 밀도가 표지 세포의 알약 발생한다. 또한 지역 GECI 발현 효능 GECI 프로모터 및 배합의 선택뿐만 아니라, 전염성 역가 및 사용 재조합 AAV의 혈청 형에 따라 주 :. 대표적인 예로서, AAV2/1-EF1α-GCaMP5의 분사 바이러스 가슴만족스러운 표정에 마우스 결과의 일차 시각 피질에 8 × 10 12 GC / ㎖ 어에는 약 2 주 동안 주사 (그림 1)을 배치한다. </li><li> 헤드 바는 마우스의 시야를 방해하지 말고 행동하는 동안 안정된 영상을 허용 할 정도로 단단해야한다. 이것은 일반적으로 머리 바의 양쪽에 부착 2 점 (그림 1 참조)이 필요합니다. 단단히 두개골에 머리 막대를 연결하려면, 머리 막대가 첨부됩니다 노출 된 두개골의 영역을 극대화하고 건조해야합니다. 또한, 메스 나 주사기를 사용함으로써 접착에 대한 표면적을 증가 표면 홈을 만들 두개골 긁힐. 치과 용 시멘트로 머리 줄을 연결하기 전에 시아 노 아크릴 레이트 조직 접착제로 뼈를 커버. </li></ol> 3. 실험 절차 <ol><li> 바이러스 주입 다음 2 ~ 3 주를, 에피에서 선명도와 표현의 두개골 창 임플란트를 확인형광 조명. 표재성 혈관 분명히 가시적이고 선명하게 정의 경계 윈도우 임플란트 (도 1 참조) 이미징에 적합 함 좋은 지표이다. </li><li> 측정 시료에 50 mW의 이하 값으로 레이저 파워를 조정한다. </li><li> 구형 디딜 방아로의 공기 흐름을 켭니다. </li><li> 현미경으로 머리 고정을 위해, 간단하게 스트레스를 줄이기 위해 이소 플루 란과 동물을 마취. 이소 플루 란 마취 용기에 동물을 배치하고 동물 정지가 (약 10 초) 이동 때까지 기다립니다. 동물을 제거하고 즉시 머리 현미경으로 고정합니다. </li><li> 여전히 동물에 대한 액세스를 허용하는 동물에 최대한 가까운 영상 표시 시스템을 배치합니다. 이하 가시 동물 실험으로, 적은 동물은 실험의 초기 단계에서 강조 될 것이다 갖는다. </li><li> 두개골 창 임플란트는 먼지와 먼지가 묻어 있는지 확인합니다. 물 청소필요한 경우. </li><li> 두개골 창 및 물 침수 목표 사이의 침수 매체로 명확한 초음파 젤을 적용합니다. 이는 수분 증발 또는 누설 느린 이미지 저하의 문제를 해결하고 물을 잡아 머리 줄에 콘을 장착 할 필요가 완화 참고 :. 원심 분리기 젤을하기 전에 모든 공기 방울을 제거하고 공기를 생성하지 않도록주의하는 사용 젤을 적용하는 동안 거품. 기포가 심하게 화질을 저하시킬 수있다. </li><li> 차광을위한 목적과 머리 바 주위에 검은 색 테이프의 조각을 감싸십시오. </li><li> 최종 위치로 가상 환경 분야를 이동하고 동공 추적을위한 비디오 카메라를 조정합니다. </li><li> 실험 동안에 사용 스캔 진폭과 일치하도록 레이저 블 랭커를 설정한다. </li><li> 데이터 기록을 시작합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Miniature+Head-Mounted+Two-Photon+MicroscopeHigh-Resolution+Brain+Imaging+in+Freely+Moving+Animals.">A Miniature Head-Mounted Two-Photon MicroscopeHigh-Resolution Brain Imaging in Freely Moving Animals.</a> Neuron. 31 (6), 903-912 (2001).</li><li>Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+large-scale+neural+activity+with+cellular+resolution+in+awake,+mobile+mice.">Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice.</a> Neuron. 56, 43-57 (2007).</li><li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+of+hippocampal+place+cells+at+cellular+resolution+during+virtual+navigation.">Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation.</a> Nat. Neurosci. 13 (11), 1433-1440 (2010).</li><li>Harvey, C. D., Coen, P., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice-specific+sequences+in+parietal+cortex+during+a+virtual-navigation+decision+task.">Choice-specific sequences in parietal cortex during a virtual-navigation decision task.</a> Nature. 484 (7395), 62-68 (2012).</li><li>Huber, D., Gutnisky, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+dynamic+representations+in+the+motor+cortex+during+sensorimotor+learning.">Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning.</a> Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).</li><li>Keller, G. B., Bonhoeffer, T., H&#252;bener, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorimotor+mismatch+signals+in+primary+visual+cortex+of+the+behaving+mouse.">Sensorimotor mismatch signals in primary visual cortex of the behaving mouse.</a> Neuron. 74 (5), 809-815 (2012).</li><li>Akerboom, J., Chen, T. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+Calcium+Indicator+for+Neural+Activity+Imaging.">Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging.</a> J. Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li><li>Zhao, Y., Araki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+expanded+palette+of+genetically+encoded+Ca2++indicators.">An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators.</a> Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).</li><li>Mittmann, W., Wallace, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+of+evoked+activity+from+L5+somatosensory+neurons+in+vivo.">Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo.</a> Nat. Neurosci. 14 (8), 1089-1893 (2011).</li><li>Katona, G., Szalay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+two-photon+in+vivo+imaging+with+three-dimensional+random-access+scanning+in+large+tissue+volumes.">Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes.</a> Nat. Methods. 9 (2), 201-208 (2012).</li><li>Mank, M., Santos, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+calcium+indicator+for+chronic+in+vivo+two-photon+imaging.">A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging.</a> Nat. Methods. 5 (9), 805-811 (2008).</li><li>Margolis, D. J., L&#252;tcke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+cortical+population+activity+imaged+throughout+long-term+sensory+deprivation.">Reorganization of cortical population activity imaged throughout long-term sensory deprivation.</a> Nat. Neurosci. 15 (11), 1539-1546 (2012).</li><li>Zariwala, H. A., Borghuis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cre-dependent+GCaMP3+reporter+mouse+for+neuronal+imaging+in+vivo.">A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo.</a> J. Neurosci. 32 (9), 3131-3141 (2012).</li><li>Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+dynamics+of+hippocampal+place+cells+during+virtual+navigation.">Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation.</a> Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).</li><li>H&#246;lscher, C., Schnee, A., Dahmen, H., Setia, L., Mallot, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rats+are+able+to+navigate+in+virtual+environments.">Rats are able to navigate in virtual environments.</a> J. Exp. Biol. 208, 561-5519 (2005).</li><li>Borlinghaus, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRT+letter:+high+speed+scanning+has+the+potential+to+increase+fluorescence+yield+and+to+reduce+photobleaching).">MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching).</a> Microsc. Res. Tech. 69 (9), 689-692 (2006).</li><li>Reiff, D. F., Plett, J., Mank, M., Griesbeck, O., Borst, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virtual+Reality+for+Mice,+mousevr.blogspot.com.">Virtual Reality for Mice, mousevr.blogspot.com.</a> Nat. Neurosci. 13, 973-978 (2010).</li><li>Sakatani, T., Isa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+spontaneous+saccade-like+rapid+eye+movements+in+C57BL/6+mice.">Quantitative analysis of spontaneous saccade-like rapid eye movements in C57BL/6 mice.</a> Neurosci. Res. 58, 324-331 (2007).</li><li>Golshani, P., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+2-photon+calcium+imaging+in+layer+2/3+of+mice.">In vivo 2-photon calcium imaging in layer 2/3 of mice.</a> J. Vis. Exp. (13), (2008).</li><li>Holtmaat, A., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Schmidt-Hieber, C., H&#228;usser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+spatial+navigation+in+the+medial+entorhinal+cortex.">Cellular mechanisms of spatial navigation in the medial entorhinal cortex.</a> Nat. Neurosci. 16 (3), 325-331 (2013).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

행동 두 광자 이미징의 성공의 열쇠는 두 가지 방법으로 제제의 안정성 : <ol><li> 일 포스트 창 주입의 과정을 통해, 조직의 염증 반응은 육아 조직 및 방해 또는 영상을 방지 할 수 연골의 형성의 향상으로 이어질 수 있습니다. </li><li> 실험 기간 동안 뇌는 신경 활동과 관련된 형광 신호를 손상시키지 모션 아티팩트를 방지하기 위해 충분히 안정되어 있습니다. </li></ol> 두개골 ?...

(유전자 GCaMP5 7 R-GECO 8, OGB 또는 Fluo4 같은 합성 염료와 같은 인코딩) 칼슘 지표의 두 광자 영상은 쥐에게 1-6 행동에 신경 활동을 측정하는 강력한 방법으로 떠오르고있다. 약 800 μm의 뇌 표면 9,10 아래까지 거의 하나의 활동 전위 해상도에서 수백 개의 셀의 활동의 동시 측정을 가능하게합니다. 또한, 유전자에 의해 코딩 칼슘 지표 (GECIs)하여 신경 활성 만성적 5,11,12을 측정 할 수 있고, 유 전적으로 정의 세포 유형 13. 함께,이 방법은 생체 내에서 신경 계산의 연구에 새로운 가능성의 군중을 열어 시간과 공간 해상도의 정도를 제공합니다. 외과 적 수술은 이미지에 마우스 뇌를 노출하고 레이블 할 필요가있다. 셀은 일반적으로 재조합 아데노 - 관련 비르를 사용하여 형질<html> GECI 배송 및 두개골 창 우리 (AAV) 시스템은 뇌에 광 액세스를 얻기 위해 주사 부위에 주입된다. 헤드 바는 다음 두 광자 현미경으로 머리 고정 용 두개골에 부착된다. 웨이크 이미징 문제의 대부분은 제조에서 불안정성으로부터 발생으로 다음 단계의 설계 및 구현은 중요하다. 이상적으로 여기에 기술 된 절차는 수술 후 수개월까지의 만성 이미징을 허용한다. 두 광자 이미징 동안 시각적으로 유도 동작을 사용하려면, 머리 고정 마우스는 가상 현실 환경을 탐색하는 데 사용할 수있는 공기를 지원하는 구형 디딜 방아에 앉아있다. 트레드밀 마우스 운동력은 마우스 14,15를 둘러싼 환형 화면에 표시되는 가상 환경으로의 이동에 연결된다. 그러한 운동, 시각적 자극과 동공 위치와 같은 행동 변수가 6을 기록 할 수있다. t는 &quot;&gt; 우리는 가상 현실 환경을 탐험 생쥐의 만성 두 광자 이미징에 관련된 절차에 대해 설명합니다 해결하는 핵심 사항은 다음과 같습니다. 운동 유물의 감소, 빛 누수의 감소를 동시에 기록 세포의 수의 최대화 및 최소화 사진을 손상. 우리는 또한 공중 지원 디딜 방아, 눈동자 추적, 가상 현실 환경을 설정하는 방법에 대한 세부 사항을 제공합니다. 여기에서 설명하는 절차는 행동 패러다임의 잠재적 다양한 머리 고정 생쥐의 형광 표지 세포 인구 이미징 사용할 수 있습니다 .

<table><tbody><tr><td>Cover slips (diameter = 3-5 mm)</td><td>Menzel</td><td></td><td>window implant</td></tr><tr><td>InSight DeepSee laser</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td>microscope</td></tr><tr><td>12 kHz Resonance scanner</td><td>Cambridge Technology</td><td>G1-003-30026</td><td>microscope</td></tr><tr><td>Galvometer</td><td>Cambridge Technology</td><td>G6215H</td><td>microscope</td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>National Instruments</td><td>NI 5772</td><td>microscope</td></tr><tr><td>FPGA</td><td>National Instruments</td><td>PXIe 7965R</td><td>microscope</td></tr><tr><td>Acquisition card</td><td>National Instruments</td><td>PCIe 6363</td><td>microscope</td></tr><tr><td>Emission filter 525/50</td><td>Semrock</td><td>FF03-525/50-25</td><td>microscope</td></tr><tr><td>Piezo-electric z-drive</td><td>Physikinstrumente</td><td>P-726.1CD</td><td>microscope</td></tr><tr><td>Controller for Piezo-electric drive</td><td>Physikinstrumente</td><td>E665 LVPZT</td><td>microscope</td></tr><tr><td>Objective 16X, 0.8NA</td><td>Nikon</td><td>CFI75</td><td>microscope</td></tr><tr><td>Current amplifier</td><td>Femto</td><td>DHPCA-100</td><td>microscope</td></tr><tr><td>Photomultiplier tube</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td>microscope</td></tr><tr><td>USB Camera without IR filter</td><td>ImagingSource</td><td>DMK22BUC03</td><td>pupil tracking</td></tr><tr><td>Objective 50 mm</td><td>ImagingSource</td><td>M5018-MP</td><td>pupil tracking</td></tr><tr><td>Macro adapter rings</td><td>ImagingSource</td><td>LAexSet</td><td>pupil tracking</td></tr><tr><td>Optical computer mouse</td><td>Logitech</td><td>G500</td><td>motion tracking</td></tr><tr><td>Styrofoam ball 20 cm</td><td>e.g. idee-shop.de</td><td>08797.00.15</td><td>virtual environment</td></tr><tr><td>LED projector</td><td>Samsung</td><td>SP-F10M</td><td>virtual environment</td></tr><tr><td>Acquisition card</td><td>National Instruments</td><td>NI 6009</td><td>virtual environment</td></tr><tr><td>Panda3D game engine</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.panda3d.org/&quot;&gt;www.panda3d.org&lt;/a&gt;</td><td>virtual environment</td></tr><tr><td>Numpy library for Python</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.scipy.org/&quot;&gt;www.scipy.org&lt;/a&gt;</td><td>virtual environment</td></tr><tr><td>Scipy library for Python</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.scipy.org/&quot;&gt;www.scipy.org&lt;/a&gt;</td><td>virtual environment</td></tr><tr><td>NI-DAQmx driver</td><td>National Instruments</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.ni.com/&quot;&gt;www.ni.com&lt;/a&gt;</td><td>virtual environment</td></tr><tr><td>Ultrasound gel</td><td>Dahlhausen</td><td>5701.0342.10</td><td>imaging</td></tr></tbody></table>

two-photon calcium imaging in mice navigating a virtual reality environment

이 동작을 1-6 동안 유전자 식별 세포의 활동의 만성 측정을 허용하는 최근 몇 년 동안, 두 광자 이미징, 신경 과학에서 매우 중요한 도구가되고있다. 여기서 우리는 동물이 가상 현실 환경을 탐색하는 동안 마우스 피질에서 두 광자 이미징을 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 우리는 밝은 조명을 가상 환경에서 행동하는 동물 이미징 열쇠입니다 실험 절차의 측면에 초점을 맞추고있다. 우리가 여기에 주소가이 실험 장치에서 발생하는 주요 문제 : 뇌 운동 관련 유물을 최소화 가상 현실 프로젝션 시스템에서 빛의 누출을 최소화하고, 레이저 유도 조직의 손상을 최소화. 또한 가상 현실 환경을 제어하고 동공 추적 할 샘플 소프트웨어를 제공한다. 이러한 절차 및 그와는 생쥐 행동에 사용하기위한 종래 이광자 현미경으로 변환 할 수 있어야한다.

GECI로 표지 된 세포 집단의 2 광자 칼슘 이미징 화질은 크게 두개 창 임플란트의 품질에 의존한다. 바이러스 주입에게 두개골 창을 다음과 같은 두 주 동안 명확성을 위해 검사를해야한다. 더 육아 조직 또는 뼈의 재성장 표시 (그림 1A)이 없어야합니다. 더욱이, 표재성 혈관의 패턴은 변경되지 않고 남아 있어야하고 혈관의 경계가 선명하게 정의되어야한다. 동시에 GECI 발현도 확인할 ?...

Watch this Scientific Journal Video about Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment at JoVE.com

Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment

여기에서 우리는 가상 현실 환경에서 동작하는 동안 마우스 피질의 두 광자 영상에 포함 된 실험 절차에 대해 설명합니다.

가상 현실 환경을 탐색 마우스의 두 광자 칼슘 이미징

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically ...

two-photon-calcium-imaging-mice-navigating-virtual-reality

Research

JoVE Journal

Behavior

31.0K 조회수.  Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research.  여기에서 우리는 가상 현실 환경에서 동작하는 동안 마우스 피질의 두 광자 영상에 포함 된 실험 절차에 대해 설명합니다. 

비디오: Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

레이어의 VIVO에서 2 광자 칼슘 이미징 마우스의 2 / 3

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

연구

생물학

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical neurons with two-photon microscopy has provided unique insights into cortical structure, function and plasticity. However, these studies are limited to head fixed animals, greatly reducing the behavioral complexity available for study. In this paper, we describe a procedure for performing chronic fluorescence microscopy with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely behaving mice. We used an integrated miniaturized fluorescence microscope paired with an implanted prism probe to simultaneously visualize and record the calcium dynamics of hundreds of neurons across multiple layers of the somatosensory cortex as the mouse engaged in a novel object exploration task, over several days. This technique can be adapted to other brain regions in different animal species for other behavioral paradigms.

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Here, we present a procedure for performing large-scale Ca2+ imaging with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely moving mice. Hundreds of active cells can be observed simultaneously using a miniature, head-mounted microscope coupled with an implanted prism probe.

다층 피질 칼슘<sup&gt; 2+</sup&gt; 프리즘 프로브 및 소형 형광 현미경으로 자유롭게 움직이는 마우스에서 이미징

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

행동분석학

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

두피 뉴런에서 생체 내 두 - 광자의 영상은 경험에 의존 분자 변경

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

신경과학

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

동시에 두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 마우스 Retrosplenial 코어 텍스에서 시냅틱 입력의 이미징 및 시냅스 대상

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

생체 내 마우스 열등올리브의 칼슘 이미징

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in the brain sense various biological conditions in the periphery and transmit the signals to neurons. Microglia, immune cells in the brain, are involved in synaptic development and plasticity. Therefore, the contribution of microglia to neural circuit construction in response to the internal state of the body should be tested critically by intravital imaging of the relationship between microglial dynamics and neuronal activity.
Here, we describe a technique for the simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice. Adeno-associated virus encoding R-CaMP, a gene-encoded calcium indicator of red fluorescence protein, was injected into layer 2/3 of the primary visual cortex in CX3CR1-EGFP transgenic mice expressing EGFP in microglia. After viral injection, a cranial window was installed onto the brain surface of the injected region. In vivo two-photon imaging in awake mice 4 weeks after the surgery demonstrated that neural activity and microglial dynamics could be recorded simultaneously at the sub-second temporal resolution. This technique can uncover the coordination between microglial dynamics and neuronal activity, with the former responding to peripheral immunological states and the latter encoding the internal brain states.

Here, we describe a protocol combining adeno-associated virus injection with cranial window implantation for simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice.

깨어 있는 생쥐의 소교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the other hand, two-photon imaging can resolve the activity of local neural circuits at the single-cell level. It is critical to make a large cranial window to perform multiple-scale analysis using both imaging techniques in the same mouse. To achieve this, one must remove a large section of the skull and cover the exposed cortical surface with transparent materials. Previously, glass skulls and polymer-based cranial windows have been developed for this purpose, but these materials are not easily fabricated. The present protocol describes a simple method for making a large cranial window consisting of commercially available polyvinylidene chloride (PVDC) wrapping film, a transparent silicone plug, and a cover glass. For imaging the dorsal surface of an entire hemisphere, the window size was approximately 6 x 3 mm2. Severe brain vibrations were not observed regardless of such a large window. Importantly, the condition of the brain surface did not deteriorate for more than one month. Wide-field imaging of a mouse expressing a genetically-encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6f, specifically in astrocytes, revealed synchronized responses in a few millimeters. Two-photon imaging of the same mouse showed prominent calcium responses in individual astrocytes over several seconds. Furthermore, a thin layer of an adeno-associated virus was applied to the PVDC film and successfully expressed GECI in cortical neurons over the cranial window. This technique is reliable and cost-effective for making a large cranial window and facilitates the investigation of the neural and glial dynamics and their interactions during behavior at the macroscopic and microscopic levels.

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

The present protocol describes making a large (6 x 3 mm2) cranial window using food wrap, transparent silicone, and cover glass. This cranial window allows in vivo wide-field and two-photon calcium imaging experiments in the same mouse.

생체 내 큰 두개골 창을 사용한 마우스의 광시야 및 2광자 칼슘 이미징

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...

An Open-Source Virtual Reality System for the Measurement of Spatial Learning in Head-Restrained Mice

Head-restrained behavioral experiments in mice allow neuroscientists to observe neural circuit activity with high-resolution electrophysiological and optical imaging tools while delivering precise sensory stimuli to a behaving animal. Recently, human and rodent studies using virtual reality (VR) environments have shown VR to be an important tool for uncovering the neural mechanisms underlying spatial learning in the hippocampus and cortex, due to the extremely precise control over parameters such as spatial and contextual cues. Setting up virtual environments for rodent spatial behaviors can, however, be costly and require an extensive background in engineering and computer programming. Here, we present a simple yet powerful system based upon inexpensive, modular, open-source hardware and software that enables researchers to study spatial learning in head-restrained mice using a VR environment. This system uses coupled microcontrollers to measure locomotion and deliver behavioral stimuli while head-restrained mice run on a wheel in concert with a virtual linear track environment rendered by a graphical software package running on a single-board computer. The emphasis on distributed processing allows researchers to design flexible, modular systems to elicit and measure complex spatial behaviors in mice in order to determine the connection between neural circuit activity and spatial learning in the mammalian brain.

Here, we present a simplified open-source hardware and software setup for investigating mouse spatial learning using virtual reality (VR). This system displays a virtual linear track to a head-restrained mouse running on a wheel by utilizing a network of microcontrollers and a single-board computer running an easy-to-use Python graphical software package.

머리가 구속된 마우스의 공간 학습 측정을 위한 오픈 소스 가상 현실 시스템An open-source virtual reality system for the measurement of spatial learning in head-trained mice

Head-restrained behavioral experiments in mice allow neuroscientists to observe neural circuit activity with high-resolution electrophysiological and ...

Superior Colliculus의 Two-photon 및 Wide-field Calcium 이미징

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the emergence of the cerebral cortex. It receives direct inputs from ~30 types of retinal ganglion cells (RGCs), with each encoding a specific visual feature. It remains elusive whether the SC simply inherits retinal features or if additional and potentially de novo processing occurs in the SC. To reveal the neural coding of visual information in the SC, we provide here a detailed protocol to optically record visual responses with two complementary methods in awake mice. One method uses two-photon microscopy to image calcium activity at single-cell resolution without ablating the overlaying cortex, while the other uses wide-field microscopy to image the whole SC of a mutant mouse whose cortex is largely undeveloped. This protocol details these two methods, including animal preparation, viral injection, headplate implantation, plug implantation, data acquisition, and data analysis. The representative results show that the two-photon calcium imaging reveals visually evoked neuronal responses at single-cell resolution, and the wide-field calcium imaging reveals&#160;neural activity across the entire SC. By combining these two methods, one can reveal the neural coding in the SC at different scales, and such combination can also be applied to other brain regions.

저자 스포트라이트: Unveiling Neural Coding and Mechanisms of Visual Processing in the Superior Colliculus 

This protocol details the procedure for imaging calcium responses in the superior colliculus (SC) of awake mice, including imaging single-neuron activity with two-photon microscopy while leaving the cortex intact in wild-type mice, and imaging the entire SC with wide-field microscopy in partial-cortex mutant mice.

Mouse Superior Colliculus의 칼슘 이미징

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...

가상 현실 환경을 탐색 마우스의 두 광자 칼슘 이미징

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

레이어의 VIVO에서 2 광자 칼슘 이미징 마우스의 2 / 3

다층 피질 칼슘

두피 뉴런에서 생체 내 두 - 광자의 영상은 경험에 의존 분자 변경

동시에 두 광자

생체 내 마우스 열등올리브의 칼슘 이미징

깨어 있는 생쥐의 소교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징

생체 내 큰 두개골 창을 사용한 마우스의 광시야 및 2광자 칼슘 이미징

머리가 구속된 마우스의 공간 학습 측정을 위한 오픈 소스 가상 현실 시스템An open-source virtual reality system for the measurement of spatial learning in head-trained mice

Mouse Superior Colliculus의 칼슘 이미징

Mouse Superior Colliculus의 칼슘 이미징