Ce travail a été soutenu par l&#39;Institut Friedrich Miescher pour la recherche biomédicale, la Société Max Planck, et la Human Frontiers Science Program.

Toutes les procédures d&#39;animaux ont été approuvés et mis en œuvre conformément aux lignes directrices du département vétérinaire du canton de Bâle-Ville. Une. Matériel et logiciel Setup <ol><li> Deux photons configuration balayage du microscope: <ol><li> Utiliser un laser infrarouge à impulsions comme source d&#39;éclairage (de largeur d&#39;impulsion &lt;120 fs). </li><li> Utilisez une tête de balayage composé d&#39;un scanner de résonance 8 ou 12 kHz et un niveau galvanomètre. Remarque: Cela permet des taux de 40 ou 60 Hz cadre à 750 x 400 pixels. Un taux de rafraîchissement élevé est essentiel pour minimiser cerveau mouvement induit de distorsion de l&#39;image. En outre, les résultats d&#39;analyse rapide de résonance dans un rendement de signal plus élevé et réduit photoblanchiment 16 et la phototoxicité. </li><li> Utilisez une vitesse élevée z-stepper piézo-électrique de façon séquentielle des images entrelacées de temps à acquérir des profondeurs multiples. Remarque: Cette option est facultative et utilisée pour augmenter le rendement de données au détriment de la vitesse de défilement. </li><li> Utilisez hoccultation écanique pour réduire l&#39;exposition au laser pour le tissu. Ajuster la largeur de l&#39;occultation selon l&#39;amplitude du scanner résonant. Remarque: En raison de la nature sinusoïdale du trajet de balayage d&#39;un scanner résonant, le faisceau laser se déplace lentement comparativement aux points de retournement de balayage. Pour éviter d&#39;endommager des tissus à ces points d&#39;exécution lorsque l&#39;exposition au laser est plus grand, une occultation mécanique est introduit dans le plan focal entre l&#39;analyse et les verres de tubes qui arrête le faisceau laser. </li><li> Pour l&#39;acquisition de données en utilisant un numériseur haute vitesse (800 MHz) en combinaison avec un gate array (field-programmable FPGA). Remarque: Les filtres passe-haut et FPGA bacs le signal de PMT en pixels. La combinaison du filtre passe-haut sur le FPGA et le filtre efficace passe-bas sur le résultat de l&#39;amplificateur de PMT dans un filtre passe-bande centré approximativement autour de la vitesse du laser (80 MHz) de répétition. Exemple de code FPGA est fourni en supplément. </li></ol></li><li> Installation du tapis de course gonflable sur la base de la conception de Dombeck et collègues 2 <ol><li> Connecter le support de boule à une conduite d&#39;alimentation en air au moyen d&#39;un tube d&#39;alimentation en air d&#39;au moins 10 mm de diamètre intérieur. Maximiser la section transversale de l&#39;entrée d&#39;alimentation en air de support de balle et la placer quantité suffisante de tuyau entre l&#39;arrivée d&#39;air principal et le porte-ballon. Remarque: section transversale accrue et la longueur accrue de la tubulure d&#39;amenée d&#39;air permet de réduire la génération de bruit. </li><li> Placez une balle en mousse de polystyrène (20 cm de diamètre) dans un porte-balle et imprimé en 3D conçu sur mesure. </li><li> Si le paradigme de comportement ne nécessite avant (et arrière) locomotion, limiter le mouvement de la balle à l&#39;(pitch) axe horizontal par l&#39;insertion d&#39;une broche (par exemple un G de l&#39;aiguille 19 hypodermique) sur le côté de la balle Note:. Généralement les animaux s&#39;adaptent à l&#39;installation beaucoup plus rapide dans ce paradigme de rotation réduite. </li><li> mouvement de la piste de la balle à l&#39;aide d&#39;un ou deux souris d&#39;ordinateur optiquepour détecter le mouvement autour de deux ou trois axes, respectivement. Remarque: Les souris d&#39;ordinateur devraient idéalement fonctionner avec une diode infrarouge pour moins d&#39;interférence avec l&#39;imagerie. </li></ol></li><li> Configuration de l&#39;environnement de réalité virtuelle <ol><li> Préparer l&#39;environnement de réalité virtuelle. Remarque: Un environnement de l&#39;échantillon sur la base Panda3D, un moteur de jeu disponible gratuitement, est fourni en supplément. Les objets de l&#39;environnement virtuel sont générées en utilisant Wings3D, un modeleur 3D open source. L&#39;exemple de programme lit les informations de position sur une carte d&#39;acquisition de données et le traduit en un mouvement dans l&#39;environnement virtuel. Le code exécute également la transformation non-linéaire pour l&#39;environnement nécessaire pour être projetée sur un écran toroïdal. La construction détaillée de l&#39;écran toroïdal a été décrite ailleurs 14,17. </li><li> Utilisez projecteurs à LED ou écrans d&#39;ordinateur LED rétro-éclairé pour afficher l&#39;environnement virtuel. Intégrer un cir de déclenchementCuit de scintillement rapide des DEL lors de l&#39;imagerie. Remarque: Un problème inhérent à l&#39;imagerie à deux photons pendant la stimulation visuelle est la lumière de fuite provenant du système de stimulation visuelle, qui peut être réduit en protégeant l&#39;objectif. Cependant, la lumière de fuite du système de stimulation visuelle peut être entièrement supprimée par la synchronisation de la sortie de lumière du projecteur sur les points du scanner à résonance (lorsque les données ne sont pas acquis) d&#39;exécution, comme on le fait avec les arènes de LED utilisées pour la stimulation visuelle lors de l&#39;imagerie dans Drosophila 18. Cela se traduit par une alternance haute vitesse effective de stimulation visuelle et d&#39;acquisition de données (voir la figure 2). La fréquence de clignotement (24 kHz) est de plusieurs ordres de grandeur au-dessus du seuil critique de fusion, au-dessus duquel le scintillement n&#39;est plus perçu par l&#39;animal. Le schéma du circuit électronique de cette modification à un projecteur LED du commerce est représenté sur la figure 3. </li></ol></li><li> Chiotsuivi il <ol><li> Utilisation d&#39;une caméra vidéo sur la base de CMOS (30 fps) pour le suivi de position de la pupille. Assurez-vous que l&#39;appareil photo ne contient pas de filtre de blocage infrarouge. Remarque: L&#39;élève est visible à contraste élevé lors des enregistrements en raison de la lumière parasite de deux photons laser d&#39;excitation sortant par l&#39;œil. position de la pupille et le diamètre est extrait en temps réel en utilisant un logiciel programmé sur mesure basé sur la conception de Sakatani et Isa 19. </li></ol></li></ol> 2. Injection de l&#39;indicateur de calcium génétique et la fenêtre de l&#39;implant L&#39;injection d&#39;un indicateur de calcium 20 et l&#39;implantation de la fenêtre crânienne 21 sont réalisées comme décrit précédemment avec les ajouts suivants: <ol><li> Injecter du virus dans la région d&#39;intérêt en utilisant une pipette d&#39;injection de verre remblayée avec une solution de virus, et relié à un système d&#39;injection sous pression. Régler la pression en fonction de la pipette du centre-diamètre, typiquement environ. 70 à 140 mbar, pour injecter environ 100 nl d&#39;une solution de virus, au cours de 1-2 min. Faible volume impulsions d&#39;injection livrés à basse fréquence (0,05 impulsions sec à 2 Hz) doivent être utilisées pour éviter le débordement du virus le long de la pipette lors de l&#39;injection. Remarque: Afin de contrôler le volume d&#39;injection, la pipette peut être marqué à petit , longueurs espacés (par exemple 0,5 mm) sous un microscope stéréo. Le déplacement du ménisque entre les marquages ​​peut ensuite être utilisée pour estimer le volume injecté. </li><li> Plusieurs semaines post injection cela devrait aboutir à un bolus de cellules densément marqués avec un diamètre d&#39;environ 500 um. L&#39;efficacité d&#39;expression GECI dans la région d&#39;intérêt dépend du choix de GECI et la combinaison du promoteur, ainsi que le titre infectieux et le sérotype de l&#39;AAV recombinant utilisé. Remarque: Comme exemple représentatif, avec injection de AAV2/1-EF1α-GCaMP5 un tit viraleer de 8 x 10 12 GC / ml dans le cortex visuel primaire d&#39;un résultat de la souris dans l&#39;expression satisfaisante à environ deux semaines après l&#39;injection (figure 1). </li><li> Le bar de la tête ne doit pas obstruer le champ visuel de la souris, mais doit être suffisamment rigide pour permettre l&#39;imagerie stable pendant comportement. Cela nécessite généralement deux points de fixation de chaque côté de la barre de la tête (voir la figure 1). Pour fixer fermement la barre de la tête sur le crâne, veillez à optimiser et sécher la zone du crâne exposé où la barre de la tête sera fixée. En outre, à l&#39;aide d&#39;un scalpel ou d&#39;une seringue, gratter le crâne pour créer des rainures superficielles augmentant ainsi l&#39;aire de surface pour le collage. Couvrir l&#39;os avec de la colle cyanoacrylate tissu avant de fixer la barre de la tête avec du ciment dentaire. </li></ol> 3. Procédure expérimentale <ol><li> Deux à trois semaines après l&#39;injection de virus, vérifiez la fenêtre implant crânien pour plus de clarté et d&#39;expression sous epifluorescence éclairage. Limites clairement visibles et bien définies de vaisseaux sanguins superficiels sont une bonne indication que l&#39;implant de fenêtre est adapté pour l&#39;imagerie (voir la figure 1). </li><li> Mesurer et régler la puissance du laser à une valeur inférieure à 50 mW à l&#39;échantillon. </li><li> Allumez le flux d&#39;air sur le tapis roulant sphérique. </li><li> Pour la tête de fixation sous le microscope, anesthésier brièvement l&#39;animal avec de l&#39;isoflurane à réduire le stress. Placez l&#39;animal dans un récipient de l&#39;isoflurane et attendre les arrêts d&#39;animaux en mouvement (environ 10 secondes). Retirer l&#39;animal et immédiatement la tête fixer sous le microscope. </li><li> Positionner le système d&#39;affichage visuel le plus près possible de l&#39;animal afin de permettre l&#39;accès au reste de l&#39;animal. Le contact visuel moins l&#39;animal a avec l&#39;expérimentateur, le moins stressé l&#39;animal sera au cours de la phase initiale de l&#39;expérience. </li><li> Assurez-vous que la fenêtre implant crânien est exempt de poussière et de la saleté. Nettoyer à l&#39;eausi nécessaire. </li><li> Appliquer le gel échographique claire milieu d&#39;immersion entre la fenêtre crânienne et objectif immersion dans l&#39;eau. Cela résout les problèmes de lenteur dégradation de l&#39;image due à l&#39;évaporation de l&#39;eau ou des fuites et réduit le besoin de monter un cône sur la barre de la tête pour retenir l&#39;eau. Remarque: Centrifugeuse le gel avant utilisation pour enlever toutes les bulles d&#39;air, et de prendre soin de ne pas créer d&#39;air des bulles lors de l&#39;application du gel. Des bulles d&#39;air peuvent gravement nuire à la qualité de l&#39;image. </li><li> Enrouler un morceau de ruban adhésif noir autour de la barre objectif et la tête pour protection contre la lumière. </li><li> Déplacez le domaine de l&#39;environnement virtuel à sa position finale et ajuster la caméra vidéo pour le suivi des élèves. </li><li> Régler le système d&#39;occultation laser pour correspondre à l&#39;amplitude de balayage utilisé lors de l&#39;expérience. </li><li> Commencer l&#39;enregistrement des données. </li></ol>

<ol>
	<li>Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Miniature+Head-Mounted+Two-Photon+MicroscopeHigh-Resolution+Brain+Imaging+in+Freely+Moving+Animals.">A Miniature Head-Mounted Two-Photon MicroscopeHigh-Resolution Brain Imaging in Freely Moving Animals.</a> Neuron. 31 (6), 903-912 (2001).</li><li>Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+large-scale+neural+activity+with+cellular+resolution+in+awake,+mobile+mice.">Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice.</a> Neuron. 56, 43-57 (2007).</li><li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+of+hippocampal+place+cells+at+cellular+resolution+during+virtual+navigation.">Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation.</a> Nat. Neurosci. 13 (11), 1433-1440 (2010).</li><li>Harvey, C. D., Coen, P., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice-specific+sequences+in+parietal+cortex+during+a+virtual-navigation+decision+task.">Choice-specific sequences in parietal cortex during a virtual-navigation decision task.</a> Nature. 484 (7395), 62-68 (2012).</li><li>Huber, D., Gutnisky, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+dynamic+representations+in+the+motor+cortex+during+sensorimotor+learning.">Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning.</a> Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).</li><li>Keller, G. B., Bonhoeffer, T., H&#252;bener, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorimotor+mismatch+signals+in+primary+visual+cortex+of+the+behaving+mouse.">Sensorimotor mismatch signals in primary visual cortex of the behaving mouse.</a> Neuron. 74 (5), 809-815 (2012).</li><li>Akerboom, J., Chen, T. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+Calcium+Indicator+for+Neural+Activity+Imaging.">Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging.</a> J. Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li><li>Zhao, Y., Araki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+expanded+palette+of+genetically+encoded+Ca2++indicators.">An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators.</a> Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).</li><li>Mittmann, W., Wallace, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+of+evoked+activity+from+L5+somatosensory+neurons+in+vivo.">Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo.</a> Nat. Neurosci. 14 (8), 1089-1893 (2011).</li><li>Katona, G., Szalay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+two-photon+in+vivo+imaging+with+three-dimensional+random-access+scanning+in+large+tissue+volumes.">Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes.</a> Nat. Methods. 9 (2), 201-208 (2012).</li><li>Mank, M., Santos, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+calcium+indicator+for+chronic+in+vivo+two-photon+imaging.">A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging.</a> Nat. Methods. 5 (9), 805-811 (2008).</li><li>Margolis, D. J., L&#252;tcke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+cortical+population+activity+imaged+throughout+long-term+sensory+deprivation.">Reorganization of cortical population activity imaged throughout long-term sensory deprivation.</a> Nat. Neurosci. 15 (11), 1539-1546 (2012).</li><li>Zariwala, H. A., Borghuis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cre-dependent+GCaMP3+reporter+mouse+for+neuronal+imaging+in+vivo.">A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo.</a> J. Neurosci. 32 (9), 3131-3141 (2012).</li><li>Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+dynamics+of+hippocampal+place+cells+during+virtual+navigation.">Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation.</a> Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).</li><li>H&#246;lscher, C., Schnee, A., Dahmen, H., Setia, L., Mallot, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rats+are+able+to+navigate+in+virtual+environments.">Rats are able to navigate in virtual environments.</a> J. Exp. Biol. 208, 561-5519 (2005).</li><li>Borlinghaus, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRT+letter:+high+speed+scanning+has+the+potential+to+increase+fluorescence+yield+and+to+reduce+photobleaching).">MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching).</a> Microsc. Res. Tech. 69 (9), 689-692 (2006).</li><li>Reiff, D. F., Plett, J., Mank, M., Griesbeck, O., Borst, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virtual+Reality+for+Mice,+mousevr.blogspot.com.">Virtual Reality for Mice, mousevr.blogspot.com.</a> Nat. Neurosci. 13, 973-978 (2010).</li><li>Sakatani, T., Isa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+spontaneous+saccade-like+rapid+eye+movements+in+C57BL/6+mice.">Quantitative analysis of spontaneous saccade-like rapid eye movements in C57BL/6 mice.</a> Neurosci. Res. 58, 324-331 (2007).</li><li>Golshani, P., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+2-photon+calcium+imaging+in+layer+2/3+of+mice.">In vivo 2-photon calcium imaging in layer 2/3 of mice.</a> J. Vis. Exp. (13), (2008).</li><li>Holtmaat, A., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Schmidt-Hieber, C., H&#228;usser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+spatial+navigation+in+the+medial+entorhinal+cortex.">Cellular mechanisms of spatial navigation in the medial entorhinal cortex.</a> Nat. Neurosci. 16 (3), 325-331 (2013).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

La clé du succès de comportement imagerie à deux photons est la stabilité de la préparation de deux façons: <ol><li> Au cours de la fenêtre de jours après l&#39;implantation, les réponses inflammatoires du tissu peut conduire à l&#39;amélioration de la formation du tissu de granulation et du cartilage qui va gêner ou même empêcher l&#39;imagerie. </li><li> Pendant l&#39;expérience, le cerveau doit être suffisamment stable pour éviter les artefacts de mouvement de corrompre neuronal signal de fluores...

Imagerie à deux photons des indicateurs de calcium (codés génétiquement comme GCaMP5 7 ou R-GECO 8, ou des colorants synthétiques comme OGB ou Fluo4) a émergé comme une puissante méthode de mesure de l&#39;activité neuronale en comporter souris 1-6. Il permet la mesure simultanée de l&#39;activité de plusieurs centaines de cellules à l&#39;action quasi-unique résolution potentielle, jusqu&#39;à environ 800 um en dessous de la surface du cerveau 9,10. En outre, en utilisant des indicateurs de calcium génétiquement codés (GECIS) l&#39;activité neuronale peut être mesurée de façon chronique 5,11,12, et dans des types cellulaires génétiquement déterminées 13. Ensemble, ces méthodes fournissent un degré de résolution temporelle et spatiale qui ouvrent une multitude de nouvelles possibilités dans l&#39;étude de calcul neuronal in vivo. Une intervention chirurgicale est nécessaire d&#39;exposer et étiqueter le cerveau de la souris pour l&#39;imagerie. Les cellules sont transfectées en utilisant typiquement un vir adéno-associé recombinant<html> nous système (AAV) pour la livraison GECI et une fenêtre crânienne est implanté sur le site d&#39;injection pour obtenir un accès optique au cerveau. Une barre de tête est ensuite fixé sur le crâne pour la tête de fixation sous le microscope à deux photons. La conception et la mise en œuvre de ces étapes est essentiel car la plupart des problèmes de l&#39;imagerie éveillé découlent de l&#39;instabilité dans la préparation. Idéalement, le procédé décrit ici devrait permettre l&#39;imagerie chronique pouvant aller jusqu&#39;à plusieurs mois après la chirurgie. Pour activer le comportement guidé visuellement lors de l&#39;imagerie à deux photons, la tête la souris fixe se trouve sur un tapis roulant sphérique de l&#39;air pris en charge, qu&#39;il peut utiliser pour naviguer dans un environnement de réalité virtuelle. Locomotion de la souris sur le tapis roulant est couplé au mouvement dans l&#39;environnement virtuel qui s&#39;affiche sur un écran toroïdal entourant le 14,15 de la souris. Variables comportementales telles que la locomotion, stimulus visuel, et la position de la pupille peuvent être enregistrées 6. t &quot;&gt; Nous décrivons les procédures impliquées dans chronique imagerie à deux photons dans les souris d&#39;explorer un environnement de réalité virtuelle Les principaux points abordés sont:. réduction des artefacts de mouvement, la réduction des fuites de lumière, la maximisation du nombre de cellules enregistrées simultanément, et la minimisation des dommages photo. Nous fournissons également des détails sur la mise en place du tapis de course gonflable, le suivi des élèves, et l&#39;environnement de réalité virtuelle. Les procédures décrites ici peuvent être utilisés pour l&#39;imagerie des populations de cellules marquées par fluorescence dans des souris fixes de la tête dans une potentiellement grande variété de paradigmes comportementaux .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="653">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">cover slips (d = 3-5 mm)</td>
			<td style="width:151px;">Menzel</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">window implant</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">InSight DeepSee laser</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td></td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12kHz resonance scanner</td>
			<td>Cambridge Technology</td>
			<td>G1-003-30026</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Galvometer</td>
			<td>Cambridge Technology</td>
			<td>G6215H</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Digitizer</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI 5772</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FPGA</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>PXIe 7965R</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acquisition card</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>PCIe 6363</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Emission filter 525/50</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF03-525/50-25</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Piezo-electric z-drive</td>
			<td>Physikinstrumente</td>
			<td>P-726.1CD</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Controller for piezo-electric drive</td>
			<td>Physikinstrumente</td>
			<td>E665 LVPZT</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Objective 16x, 0.8NA</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI75</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Current amplifier</td>
			<td style="width:151px;">Femto</td>
			<td style="width:119px;">DHPCA-100</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Photomultiplier tube</td>
			<td style="width:151px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">USB Camera without IR filter</td>
			<td>ImagingSource</td>
			<td>DMK22BUC03&#160;</td>
			<td>pupil tracking</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Objective 50 mm</td>
			<td>ImagingSource</td>
			<td>M5018-MP&#160;</td>
			<td>pupil tracking</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Macro adapter rings</td>
			<td>ImagingSource</td>
			<td>LAexSet</td>
			<td>pupil tracking</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Optical computer mouse</td>
			<td>Logitech</td>
			<td>G500</td>
			<td>motion tracking</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Styrofoam ball 20 cm</td>
			<td>e.g. idee-shop.de</td>
			<td>08797.00.15</td>
			<td>virtual environment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LED projector</td>
			<td>Samsung</td>
			<td>SP-F10M&#160;</td>
			<td>virtual environment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acquisition card</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td style="width:119px;">NI 6009</td>
			<td>virtual environment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Panda3D game engine</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.panda3d.org/">www.panda3d.org</a></td>
			<td>virtual environment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Numpy library for Python</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:119px;"><a href="http://www.scipy.org/">www.scipy.org</a></td>
			<td>virtual environment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Scipy library for Python</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:119px;"><a href="http://www.scipy.org/">www.scipy.org</a></td>
			<td>virtual environment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">NI-DAQmx driver</td>
			<td style="width:151px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;"><a href="http://www.ni.com/">www.ni.com</a></td>
			<td>virtual environment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Ultrasound gel</td>
			<td style="width:151px;">Dahlhausen</td>
			<td style="width:119px;">5701.0342.10</td>
			<td>imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-photon calcium imaging in mice navigating a virtual reality environment

Au cours des dernières années, l&#39;imagerie à deux photons est devenu un outil précieux dans les neurosciences, car il permet de mesurer chronique de l&#39;activité des cellules génétiquement identifiés lors de comportements 1-6. Nous décrivons ici les méthodes d&#39;effectuer une imagerie à deux photons dans le cortex de la souris alors que l&#39;animal navigue un environnement de réalité virtuelle. Nous nous concentrons sur les aspects des procédures expérimentales qui sont essentiels à l&#39;imagerie chez un animal se comporter dans un environnement virtuel bien éclairée. Les principaux problèmes qui se posent dans ce dispositif expérimental que nous sommes ici adresse: minimiser les mouvements des artefacts liés au cerveau, en minimisant les fuites de lumière à partir du système de projection de la réalité virtuelle, et en minimisant induite par laser des lésions tissulaires. Nous fournissons également des logiciels de l&#39;échantillon à contrôler l&#39;environnement de réalité virtuelle et de faire le suivi des élèves. Avec ces procédures et les ressources, il devrait être possible de convertir un microscope à deux photons pour une utilisation conventionnelle en se comportant souris.

La qualité de l&#39;image en deux photons imagerie calcique de populations de cellules marquées avec un GECI dépend largement de la qualité de la fenêtre implant crânien. Deux semaines après l&#39;injection du virus de la fenêtre crânienne doivent être inspectés pour plus de clarté. Il devrait y avoir aucun tissu de granulation ou de la repousse osseuse visible (Figure 1A). En outre, le motif de vaisseaux sanguins superficiels devrait rester inchangé et les limites du système vasculaire do...

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Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment

Nous décrivons ici les procédures expérimentales impliquées dans l&#39;imagerie à deux photons de cortex de la souris pendant le comportement dans un environnement de réalité virtuelle.

Deux photons Imaging calcium dans la souris Naviguer une réalité environnement virtuel

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically ...

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Research

JoVE Journal

Behavior

30.9K vues.  Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research.  Nous décrivons ici les procédures expérimentales impliquées dans l'imagerie à deux photons de cortex de la souris pendant le comportement dans un environnement de réalité virtuelle. 

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Development of a Virtual Reality Assessment of Everyday Living Skills

Cognitive impairments affect the majority of patients with schizophrenia and these impairments predict poor long term psychosocial outcomes.&#160; Treatment studies aimed at cognitive impairment in patients with schizophrenia not only require demonstration of improvements on cognitive tests, but also evidence that any cognitive changes lead to clinically meaningful improvements.&#160; Measures of &#8220;functional capacity&#8221; index the extent to which individuals have the potential to perform skills required for real world functioning. &#160;Current data do not support the recommendation of any single instrument for measurement of functional capacity.&#160; The Virtual Reality Functional Capacity Assessment Tool (VRFCAT) is a novel, interactive gaming based measure of functional capacity that uses a realistic simulated environment to recreate routine activities of daily living. Studies are currently underway to evaluate and establish the VRFCAT&#8217;s sensitivity, reliability, validity, and practicality.&#160;This new measure of functional capacity is practical, relevant, easy to use, and has several features that improve validity and sensitivity of measurement of function in clinical trials of patients with CNS disorders.

A challenge for proving treatment efficacy for cognitive impairments in schizophrenia is finding the optimizing measurement of skills related to everyday functioning.&#160; The Virtual Reality Functional Capacity Assessment Tool (VRFCAT) is an interactive gaming based computerized measure aimed at skills associated with everyday functioning, including baseline impairments and treatment related changes.

Développement d&#39;une évaluation de la vie quotidienne des compétences de la réalité virtuelle

Cognitive impairments affect the majority of patients with schizophrenia and these impairments predict poor long term psychosocial outcomes.&#160; ...

Recherche

Sciences du comportement

A Protocol for Housing Mice in an Enriched Environment

Environmental enrichment (EE) is a housing environment for mice that boosts mental and physical health compared to standard laboratory housing. Our recent studies demonstrate that environmental enrichment decreases adiposity, increases energy expenditure, resists diet induced obesity, and causes cancer remission and inhibition in mice. EE typically consists of larger living space, a variety of &#8216;toys&#8217; to interact with, running wheels, and can include a number of other novel environmental changes. All of this fosters a more complex social engagement, cognitive and physical stimulations. Importantly, the toy location and type of toy is changed regularly, which encourages the mice to adapt to a frequently changing and novel environment. Many variables can be manipulated in EE to promote health effects in mice. Thus these approaches are difficult to control and must be properly managed to successfully replicate the associated phenotypes. Therefore, the goal of this video is to demonstrate how EE is properly set up and maintained to assure a complex, challenging, and controlled environment so that other researchers can easily reproduce the protective effects of EE against obesity and cancer.

Environmental enrichment for mice requires a complex and challenging setup, as well as comprehensive husbandry and handling techniques to assure robust metabolic and anti-cancer effects in the mice. This protocol provides detailed procedures to reproduce the above mentioned effects in mice.

Un protocole pour souris Bricolage dans un environnement enrichi

Environmental enrichment (EE) is a housing environment for mice that boosts mental and physical health compared to standard laboratory housing. Our recent ...

Multifunctional Setup for Studying Human Motor Control Using Transcranial Magnetic Stimulation, Electromyography, Motion Capture, and Virtual Reality

The study of neuromuscular control of movement in humans is accomplished with numerous technologies. Non-invasive methods for investigating neuromuscular function include transcranial magnetic stimulation, electromyography, and three-dimensional motion capture. The advent of readily available and cost-effective virtual reality solutions has expanded the capabilities of researchers in recreating &#8220;real-world&#8221; environments and movements in a laboratory setting. Naturalistic movement analysis will not only garner a greater understanding of motor control in healthy individuals, but also permit the design of experiments and rehabilitation strategies that target specific motor impairments (e.g. stroke). The combined use of these tools will lead to increasingly deeper understanding of neural mechanisms of motor control. A key requirement when combining these data acquisition systems is fine temporal correspondence between the various data streams. This protocol describes a multifunctional system&#8217;s overall connectivity, intersystem signaling, and the temporal synchronization of recorded data. Synchronization of the component systems is primarily accomplished through the use of a customizable circuit, readily made with off the shelf components and minimal electronics assembly skills.

Transcranial magnetic stimulation, electromyography, and 3D motion capture are commonly used non-invasive techniques for investigating neuromuscular function in humans. In this paper, we describe a protocol that synchronously samples data generated by all three of these tools along with the unique addition of virtual reality stimulus presentation and feedback.

Configuration multifonctions pour l&#39;étude de contrôle du moteur humain utilisant la stimulation magnétique transcrânienne, électromyographie, Motion Capture, et Réalité Virtuelle

The study of neuromuscular control of movement in humans is accomplished with numerous technologies. Non-invasive methods for investigating neuromuscular ...

Using Virtual Reality to Transfer Motor Skill Knowledge from One Hand to Another

As far as acquiring motor skills is concerned, training by voluntary physical movement is superior to all other forms of training (e.g. training by observation or passive movement of trainee&#39;s hands by a robotic device). This obviously presents a major challenge in the rehabilitation of a paretic limb since voluntary control of physical movement is limited. Here, we describe a novel training scheme we have developed that has the potential to circumvent this major challenge. We exploited the voluntary control of one hand and provided real-time movement-based manipulated sensory feedback as if the other hand is moving. Visual manipulation through virtual reality (VR) was combined with a device that yokes left-hand fingers to passively follow right-hand voluntary finger movements. In healthy subjects, we demonstrate enhanced within-session performance gains of a limb in the absence of voluntary physical training. Results in healthy subjects suggest that training with the unique VR setup might also be beneficial for patients with upper limb hemiparesis by exploiting the voluntary control of their healthy hand to improve rehabilitation of their affected hand.

We describe a novel virtual-reality based setup which exploits voluntary control of one hand to improve motor-skill performance in the other (non-trained) hand. This is achieved by providing real-time movement-based sensory feedback as if the non-trained hand is moving. This new approach may be used to enhance rehabilitation of patients with unilateral hemiparesis.

Utilisant la réalité virtuelle à transférer les connaissances de la motricité d’une main à l’autre

As far as acquiring motor skills is concerned, training by voluntary physical movement is superior to all other forms of training (e.g. training by ...

Mobile Game-based Virtual Reality Program for Upper Extremity Stroke Rehabilitation

Stroke rehabilitation requires repetitive, intensive, goal-oriented therapy. Virtual reality (VR) has the potential to satisfy these requirements. Game-based therapy can promote patients&#39; engagement in rehabilitation therapy as a more interesting and a motivating tool. Mobile devices such as smartphones and tablet PCs can provide personalized home-based therapy with interactive communication between patients and clinicians. In this study, a mobile VR upper extremity rehabilitation program using game applications was developed. The findings from the study show that the mobile game-based VR program effectively promotes upper extremity recovery in patients with stroke. In addition, patients completed two weeks of treatment using the program without adverse effects and were generally satisfied with the program. This mobile game-based VR upper extremity rehabilitation program can substitute for some parts of the conventional therapy that are delivered one-on-one by an occupational therapist. This time-efficient, easy to implement, and clinically effective program would be a good candidate tool for tele-rehabilitation for upper extremity recovery in patients with stroke. Patients and therapists can collaborate remotely through these e-health rehabilitation programs while reducing economic and social costs.

Here, we present a protocol to develop and apply a mobile game-based virtual reality program for the recovery of upper limb dysfunction in patients with stroke. The present study shows that the mobile program is feasible and effectively promotes upper limb recovery in stroke patients.

Programme mobile axée sur le jeu de réalité virtuelle pour rééducation membre supérieur

Stroke rehabilitation requires repetitive, intensive, goal-oriented therapy. Virtual reality (VR) has the potential to satisfy these requirements. ...

Measuring the Kinematics of Daily Living Movements with Motion Capture Systems in Virtual Reality

The inability to complete instrumental activities of daily living (IADL) is a precursor to various neuropsychological diseases. Questionnaire-based assessments of IADL are easy to use but prone to subjective bias. Here, we describe a novel virtual reality (VR) test to assess two complex IADL tasks: handling financial transactions and using public transportation. While a participant performs the tasks in a VR setting, a motion capture system traces the position and orientation of the dominant hand and head in a three-dimensional Cartesian coordinate system. Kinematic raw data are collected and converted into &#39;kinematic performance measures,&#39; i.e., motion trajectory, moving distance, and time to completion. Motion trajectory is the path of a particular body part (e.g., dominant hand or head) in space. Moving distance refers to the total distance of the trajectory, and time to completion is how long it took to complete an IADL task. These kinematic measures could discriminate patients with cognitive impairment from healthy controls. The development of this kinematic measuring protocol allows detection of early IADL-related cognitive impairments.

We designed a virtual reality test to assess instrumental activities of daily living (IADL) with a motion capture system. We propose a detailed kinematic analysis to interpret the participant&#39;s various movements, including trajectory, moving distance, and time to completion to evaluate IADL capabilities.

Mesurer la cinématique des mouvements de la vie quotidienne avec les systèmes de Capture de mouvement en réalité virtuelle

The inability to complete instrumental activities of daily living (IADL) is a precursor to various neuropsychological diseases. Questionnaire-based ...

A Networked Desktop Virtual Reality Setup for Decision Science and Navigation Experiments with Multiple Participants

Investigating the interactions among multiple participants is a challenge for researchers from various disciplines, including the decision sciences and spatial cognition. With a local area network and dedicated software platform, experimenters can efficiently monitor the behavior of the participants that are simultaneously immersed in a desktop virtual environment and digitalize the collected data. These capabilities allow for experimental designs in spatial cognition and navigation research that would be difficult (if not impossible) to conduct in the real world. Possible experimental variations include stress during an evacuation, cooperative and competitive search tasks, and other contextual factors that may influence emergent crowd behavior. However, such a laboratory requires maintenance and strict protocols for data collection in a controlled setting. While the external validity of laboratory studies with human participants is sometimes questioned, a number of recent papers suggest that the correspondence between real and virtual environments may be sufficient for studying social behavior in terms of trajectories, hesitations, and spatial decisions. In this article, we describe a method for conducting experiments on decision-making and navigation with up to 36 participants in a networked desktop virtual reality setup (i.e., the Decision Science Laboratory or DeSciL). This experiment protocol can be adapted and applied by other researchers in order to set up a networked desktop virtual reality laboratory.

This paper describes a method for conducting multi-user experiments on decision-making and navigation using a networked computer laboratory.

Une installation de réalité virtuelle Bureau en réseau pour les sciences de la décision et des expériences de Navigation avec plusieurs Participants

Investigating the interactions among multiple participants is a challenge for researchers from various disciplines, including the decision sciences and ...

Virtual Reality Experiments with Physiological Measures

Virtual reality (VR) experiments are increasingly employed because of their internal and external validity compared to real-world observation and laboratory experiments, respectively. VR is especially useful for geographic visualizations and investigations of spatial behavior. In spatial behavior research, VR provides a platform for studying the relationship between navigation and physiological measures (e.g., skin conductance, heart rate, blood pressure). Specifically, physiological measures allow researchers to address novel questions and constrain previous theories of spatial abilities, strategies, and performance. For example, individual differences in navigation performance may be explained by the extent to which changes in arousal mediate the effects of task difficulty. However, the complexities in the design and implementation of VR experiments can distract experimenters from their primary research goals and introduce irregularities in data collection and analysis. To address these challenges, the Experiments in Virtual Environments (EVE) framework includes standardized modules such as participant training with the control interface, data collection using questionnaires, the synchronization of physiological measurements, and data storage. EVE also provides the necessary infrastructure for data management, visualization, and evaluation. The present paper describes a protocol that employs the EVE framework to conduct navigation experiments in VR with physiological sensors. The protocol lists the steps necessary for recruiting participants, attaching the physiological sensors, administering the experiment using EVE, and assessing the collected data with EVE evaluation tools. Overall, this protocol will facilitate future research by streamlining the design and implementation of VR experiments with physiological sensors.

Virtual reality (VR) experiments can be difficult to implement and require meticulous planning. This protocol describes a method for the design and implementation of VR experiments that collect physiological data from human participants. The Experiments in Virtual Environments (EVE) framework is employed to accelerate this process.

Expériences de réalité virtuelle avec mesures physiologiques

Virtual reality (VR) experiments are increasingly employed because of their internal and external validity compared to real-world observation and ...

Longitudinal Two-Photon Imaging of Dorsal Hippocampal CA1 in Live Mice

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from subcellular to network levels and at temporal scales from milliseconds to weeks. In addition, two-photon imaging can be combined with a variety of behavioral tasks to explore the causal relationships between brain function and behavior. However, in mammals, limited penetration and scattering of light have limited two-photon intravital imaging mostly to superficial brain regions, thus precluding longitudinal investigation of deep-brain areas such as the hippocampus. The hippocampus is involved in spatial navigation and episodic memory and is a long-standing model used to study cellular as well as cognitive processes important for learning and recall, both in health and disease. Here, a preparation that enables chronic optical access to the dorsal hippocampus in living mice is detailed. This preparation can be combined with two-photon optical imaging at cellular and subcellular resolution in head fixed, anesthetized live mice over several weeks. These techniques enable repeated imaging of neuronal structure or activity-evoked plasticity in tens to hundreds of neurons in the dorsal hippocampal CA1. Furthermore, this chronic preparation can be used in combination with other techniques such as micro-endoscopy, head-mounted wide field microscopy or three-photon microscopy, thus greatly expanding the toolbox to study cellular and network processes involved in learning and memory.

This method describes a chronic preparation that allows optical access to the hippocampus of living mice. This preparation can be used to perform longitudinal optical imaging of neuronal structural plasticity and activity-evoked cellular plasticity over a period of several weeks.

Imagerie longitudinale à deux photons de l'hippocampe dorsal CA1 chez les souris vivantes

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from ...

Online Explorative Study on the Learning Uses of Virtual Reality Among Early Adopters

Virtual reality (VR) has shown great educational potential because it makes it possible to simulate any desired situation or event, thus playing an important role in addressing current educational challenges. Despite the unlimited learning possibilities that VR may offer, unless users are willing to apply virtual devices to education, the investment of time, money, and effort will be fruitless. It is therefore crucial to assess the educational interest of the first generation of VR users and to identify their current needs. To this end, in this study we designed an online questionnaire and applied it through the SaaS (Software as a service) of a private server. The sample consisted of 117 early VR adopters recruited via a main portal of communication and information technologies in Spain. In order to engage participants, we posted a thread in the main forum, which is dedicated to the advances and potential uses of VR. Once the responses were gathered, we analyzed the relationship between 12 variables (mean contrasts with Snedecor&#39;s F, and contingency analysis with chi-square and Sommer&#39;s d). The results showed that the current profile of a VR user is a male over 35 years old, with university studies, and who has purchased his viewer recently (&#60;1 year). As for the learning and teaching applications that these users were interested in, only 13.7% of the participants in this study use VR for educational purposes, although 28.2% were interested, indicating that perhaps the lack of applications or learning experiences may be hampering the use of VR within education. Almost half of the early adopters surveyed would like to learn using VR technology and are somehow optimistic about the relationship between VR and education, particularly those who are younger.

This article describes the profile of Spanish early adopters of virtual reality and their interests and preferences regarding learning and educational applications for this technology. To this aim, we designed an online questionnaire and interviewed 117 users of the main virtual reality forum on the Internet.

Étude exploratoire en ligne sur les utilisations de l'apprentissage de la réalité virtuelle chez les premiers adoptants

Virtual reality (VR) has shown great educational potential because it makes it possible to simulate any desired situation or event, thus playing an ...