Este protocolo demostrará cómo se pueden sembrar células madre pluripotentes inducidas diferenciadas en un órgano en chip para generar una barrera hematoencefálica totalmente humana, personalizada y microfluídica, que se puede utilizar para predecir la permeabilidad de los fármacos del sistema nervioso central y para estudiar trastornos neurológicos. Usando un órgano en chip disponible comercialmente, demostraremos cómo cualquier laboratorio biológicamente orientado puede utilizar esta tecnología para generar una barrera hematoencefálica microfluída personalizada. La acumulación de evidencias sugiere que el BBB desempeña un papel en la enfermedad neurológica mediante la generación de chips BBB personalizados derivados de iPSC de individuos con una enfermedad neurológica genética.
Será posible estudiar el papel del BBB en la salud y la enfermedad. Este método también puede ser útil para las empresas farmacéuticas, que pueden utilizar esta plataforma humana BBB para detectar la penetrabilidad de los fármacos neurológicos candidatos en el cerebro humano. La aplicación de tecnologías de órgano en chip generalmente requiere habilidades de ingeniería especializadas.
El uso de plataformas disponibles comercialmente permite la aplicación de esta tecnología en cualquier laboratorio de orientación biológica. Para empezar, lleve el plato que contiene las virutas preparadas al gabinete de bioseguridad. Con una pipeta P200, lave suavemente ambos canales añadiendo 200 microlitros de medio de diferenciación neuronal en la entrada y tirando del líquido de la salida.
Evitando el contacto con los puertos, aspirar cuidadosamente el exceso de gotas de medios de la superficie del chip. Agitar suavemente la suspensión celular para garantizar una suspensión celular homogénea. Para sembrar las células progenitoras neurales derivadas de iPSC en el canal superior para generar el lado cerebral, agregue una punta P200 que contenga de 30 a 100 microlitros de suspensión celular a la concentración de una por 10 a las seis células por mililitro a la entrada del canal superior, y libere suavemente la punta de la pipeta.
Tome una pipeta P200 vacía, presione el émbolo, inserte en la salida del canal superior y tire cuidadosamente de la suspensión de una sola celda a través de la punta. Transfiera el chip al microscopio para comprobar la densidad de siembra y la distribución homogénea de las células dentro del canal superior. Después de confirmar la densidad celular con una cobertura del 20%, coloque inmediatamente las virutas en la incubadora durante dos horas a 37 grados centígrados.
Después de eso, lave las células que no se adhieren añadiendo un medio de diferenciación neuronal fresco en la entrada y tirando del líquido a través de la pipeta de la salida. Mantener las células en condiciones estáticas a 37 grados Celsius con un reemplazo medio de diferenciación neuronal diaria. Después de que los iNPC se hayan adherido o en un día posterior a la siembra, lleve el plato que contiene las virutas preparadas al gabinete de bioseguridad.
Lave suavemente el canal inferior con 200 microlitros de medio celular endotelial. Evitando el contacto con los puertos, aspirar cuidadosamente gotas de exceso de medio celular endotelial de la superficie del chip, asegurándose de dejar el medio en ambos canales. Agitar suavemente la suspensión celular para garantizar una suspensión celular homogénea.
Con una pipeta P200, extraiga de 30 a 100 microlitros de la suspensión de células endoteliales microvasculares cerebrales derivadas del iPSC a una concentración de 14 a 20 veces 10 a las seis células por mililitro, y coloque la punta en la entrada del canal inferior. El paso más crítico para lograr las propiedades de barrera funcional es la siembra de células endoteliales microvasculares cerebrales. Es crucial sembrar células a la densidad adecuada para evitar la formación de burbujas para verificar la distribución homogénea dentro del chip del órgano.
Presione el émbolo en una pipeta P200 con una punta vacía, insértelo en la salida del canal inferior y suelte lentamente el émbolo de la pipeta para tirar cuidadosamente de la suspensión de una sola célula a través del canal inferior. Aspirar el exceso de suspensión celular de la superficie de la viruta. Evite el contacto directo con los puertos de entrada y salida para asegurarse de que no se aspira ninguna suspensión celular fuera de los canales.
Transfiera el chip al microscopio para comprobar la densidad de siembra. El canal inferior se llena de celdas sin huecos observables en el medio. Después de confirmar la densidad celular correcta, sembrar las células en los chips restantes.
Para unir las células a la membrana porosa, que se encuentra en la parte superior del canal inferior, invierta cada chip y déjelas reposar en una base de viruta. Coloque un pequeño reservorio que contenga DPBS estéril dentro de la placa de 150 milímetros para proporcionar humedad a las células. Incubar las virutas a 37 grados centígrados durante aproximadamente tres horas o hasta que las células del canal inferior se hayan adherido.
Una vez que las células endoteliales microvasculares cerebrales derivadas del iPSC se hayan unido, voltee las virutas de nuevo a una posición vertical para permitir la fijación de la célula a la parte inferior del canal inferior. 48 horas después de la siembra de las células endoteliales microvasculares cerebrales derivadas de iPSC, equilibrar la temperatura del medio celular endotelial calentando en un baño de agua de 37 grados Celsius durante una hora. A continuación, desgasar el medio por incubación bajo un sistema de filtración impulsado por vacío durante 15 minutos.
A continuación, desinfecte el exterior del embalaje del módulo portátil y las bandejas con 70% de etanol, limpie y transfieralos al gabinete de bioseguridad. Abra el paquete y coloque los módulos en la bandeja Orient ellos con los depósitos hacia la parte posterior de la bandeja. Pipetear tres mililitros de los medios preequilibrados y calientes a cada depósito de entrada.
Agregue el medio de cultivo celular endotelial al depósito de entrada del canal inferior y al medio de diferenciación neuronal al depósito de entrada del canal superior del canal superior. A continuación, pipetear 300 microlitros de los medios preequilibrados y calientes a cada depósito de salida, directamente sobre cada puerto de salida. Coloque hasta seis módulos portátiles en cada bandeja.
Lleve las bandejas a la incubadora y deslícela completamente en el módulo de cultivo con la manija de la bandeja hacia afuera. Seleccione y ejecute el ciclo principal en el módulo de referencia cultural. Cierre la puerta de la incubadora y permita que el módulo de cultivo se deba a los módulos portátiles durante aproximadamente un minuto.
El ciclo de cebado se completa cuando la barra de estado está lista. Retire la bandeja del módulo de cultivo y lléela al gabinete de bioseguridad. Inspeccione la parte inferior de cada módulo portátil en el gabinete de bioseguridad para verificar que los módulos portátiles se prepararon correctamente.
Busque la presencia de pequeñas gotas en los cuatro puertos. Si cualquier módulo portátil no muestra gotas, vuelva a ejecutar el ciclo primo en esos módulos. Si algún medio goteaba sobre la bandeja, que ocurre con más frecuencia por los puertos de salida, limpie la bandeja con 70% de etanol.
A continuación, lave suavemente ambos canales de cada chip con un medio de cultivo cálido y equilibrado específico de la célula para eliminar las posibles burbujas en el canal, y coloque pequeñas gotas de medios en la parte superior de cada puerto de entrada y salida. Inserte las virutas con soportes en los módulos portátiles y coloque hasta seis en cada bandeja. Inserte las bandejas en el módulo de referencia cultural.
Programe las condiciones apropiadas de cultivo de chips de órgano, como el caudal y el estiramiento, en el módulo de cultivo. Tan pronto como se completa el ciclo de regulación, que tarda aproximadamente dos horas, comienzan las condiciones programadas. Después de eso, el módulo de cultivo comienza a fluir en las condiciones de cultivo de chip de órgano preestablecidas.
La inmunocitoquímica en el chip de barrera hematoencefálica basado en iPSC siete días después de la siembra muestra las esferas EZ diferenciadas en una población mixta de células neuronales en el canal del lado del cerebro superior, incluyendo astrocitos beta-positivos S100, células progenitoras neuronales nestin positivas, así como astrocitos positivos GFAP, y neuronas beta III con exiullo positivo. Células endoteliales microvasculares cerebrales derivadas de IPSC sembradas en el canal lateral de la sangre inferior expresadas GLUT-1 y PECAM-1. La evaluación de la permeabilidad del chip de barrera hematoencefálica demuestra que el chip de órgano sembrado con células endoteliales microvasculares cerebrales derivadas de iPSC y esferas EZ tenía una barrera ajustada en comparación con los chips de órganos sembrados con células endoteliales microvasculares cerebrales derivadas de iPSC solamente.
Los chips de órganos sembrados con esferas EZ por sí solos no mostraban ninguna propiedad de barrera. Desde el tratamiento superficial inicial del canal hasta el cambio de medio cada día, evite la formación de burbujas en el canal. A lo largo del paso en el protocolo en el que el reactivo de activación de la superficie, la matriz extracelular o el medio que contiene celdas deben insertarse a través de los canales, es extremadamente importante verificar cuidadosamente que no se encuentre ninguna burbuja.
El ensayo de permeabilidad se puede realizar para evaluar la penetrabilidad cerebral humana de los fármacos candidatos. Este enfoque puede servir para probar posibles terapias. La aplicación del chip BBB basado en iPSC permite estudiar el papel del BBB en diversas enfermedades neurológicas.
En el futuro, dicha plataforma puede ser útil para aplicaciones de medicina predictiva y personalizada.
