Nuestro protocolo reconoce la necesidad de recapitular mejor la barrera hematoencefálica humana in vitro para el estudio de mecanismos celulares complejos que afectan la recuperación posterior al accidente cerebrovascular. Nuestro modelo triple exhibe una integridad robusta que está relacionada en parte con la gran compartimentación de los insertos de pozos, lo que nos permite disminuir la frecuencia de cambio y evitar la interrupción de las poblaciones. Nuestro modelo es una gran herramienta para estudiar los cambios moleculares y celulares que ocurren en la barrera hematoencefálica durante y después del accidente cerebrovascular isquémico.
Nuestro protocolo permite el descubrimiento de nuevos objetivos y terapias para mejorar la recuperación posterior al accidente cerebrovascular. Los tratamientos actuales para el accidente cerebrovascular isquémico son sensibles al tiempo y, en consecuencia, no siempre son efectivos. Comience cultivando HBVP en matraces de cultivo T75 con una superficie activada para la adhesión celular dentro de una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados hasta que sea confluente.
Una vez alcanzada la confluencia, aspire el medio pericito viejo y lave las células con cinco mililitros de PBS de Dulbecco caliente. Aspirar el PBS de Dulbecco y separar las células del matraz utilizando una combinación de cuatro mililitros de solución tibia de tripsina EDTA y un mililitro de PBS de Dulbecco. Incubar el matraz durante cinco minutos a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono.
Ver bajo un microscopio para confirmar si las células están separadas del matraz. Añadir cinco mililitros de medio de pericito caliente que contenga 2% de FBS al matraz y transferir las células desprendidas a un tubo de centrífuga de 50 mililitros. Centrifugar la suspensión celular durante tres minutos a 200 g permitiendo que las células formen un pellet en el fondo del tubo.
Aspire el medio del tubo asegurándose de que el pellet celular permanezca intacto. Vuelva a suspender el pellet celular en medio pericito. Calcule la cantidad de medio dependiendo de la confluencia de las células y el número de insertos de pocillos necesarios.
Tome 10 microlitros de las células resuspendidas, colóquelas en un portaobjetos de conteo de células y cuente el número de células. Determinar la densidad celular y sembrar 300, 000 células por inserto en un mililitro de medio pericito en el lado abluminal de los insertos del pozo. Cultivar astrocitos humanos primarios utilizando el medio astrocito que contiene 2% FBS como se describe en el manuscrito de texto.
Determinar la densidad celular y sembrar 300, 000 células por pocillo en el fondo de las placas de seis pocillos de cultivo de tejidos. Cubra la placa para evitar la evaporación e incube durante la noche. Del mismo modo, cultive HBMEC en placas de cultivo de tejidos utilizando un medio clásico completo que contenga 10% de FBS como se describe en el texto manuscrito.
Saque las placas de seis pocillos de cultivo de tejidos que contienen astrocitos y los insertos de pocillos que contienen pericitos de la incubadora. Aspirar el medio astrocito de las placas de seis pocillos de cultivo de tejidos y añadir un mililitro de medio de pericito y un mililitro de medio de astrocito a cada pocillo. Aspirar el medio pericito de los insertos de pocillos y colocarlos en las placas de seis pocillos de cultivo de tejidos que contienen los astrocitos sembrados.
Semilla de HBMEC a una densidad de 300.000 células por pocillo en dos mililitros de medio clásico completo en el lado apical de los mismos insertos de pocillos. Lave las células tres veces con PBS de Dulbecco. Para cultivos de células triples sometidos a privación de oxígeno-glucosa, agregue un medio libre de glucosa a los compartimentos apical y basolateral.
Sustituir el medio de cultivo por medio fresco y cultivos celulares de control normóxico. Coloque cultivos triples de control en la incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados. Coloque una placa de Petri que contenga 20 mililitros de agua estéril en la cámara de la incubadora de hipoxia para proporcionar una humidificación adecuada de los cultivos.
Abra la cámara liberando la abrazadera del anillo, luego coloque los cultivos celulares en los estantes. Selle la cámara asegurando la abrazadera del anillo. Abra los puertos de entrada y salida de la cámara y conecte el tubo desde la parte superior del medidor de flujo de la cámara.
Conecte el tubo desde la parte inferior del medidor de flujo al tanque de gas a través de un filtro de aire. Abra la válvula de control de flujo del tanque girándola en sentido contrario a las agujas del reloj para permitir un flujo de gas mínimo. Abra lentamente la válvula reguladora de presión girando en el sentido de las agujas del reloj.
Enjuague la cámara con la mezcla de gases durante cinco minutos a un caudal de 20 litros por minuto. Desconecte la cámara de la fuente de gas y cierre firmemente ambas abrazaderas de plástico blanco. Apague la válvula de control de flujo del tanque girando en el sentido de las agujas del reloj.
Cierre la válvula reguladora de presión girando en sentido contrario a las agujas del reloj. Coloque la cámara de hipoxia en una incubadora convencional a 37 grados centígrados durante cuatro horas. Coloque el instrumento TEER esterilizado en el gabinete de bioseguridad y enchufe los electrodos en el medidor de ohmios de voltios epiteliales.
Esterilice los electrodos en 30 mililitros de solución de alcohol isopropílico al 70% durante un mínimo de 30 minutos. Encienda el instrumento TEER y ajuste la función a ohmios. Retire los electrodos de la solución de alcohol isopropílico al 70% y colóquelos en 20 mililitros de PBS de Dulbecco durante un mínimo de 30 minutos hasta que la lectura digital en el dispositivo TEER lea cero ohmios.
Inserte la punta larga del electrodo a través de una de las tres aberturas en el hangar de inserción del pozo en blanco que lo baje hasta que toque el fondo del pozo. Asegúrese de que la púa corta descanse sobre el cultivo apical en la parte inferior del inserto del pozo. Espere hasta que los valores de lectura digital en el instrumento TEER se nivelen antes de registrar el valor.
Vuelva a colocar los electrodos en el PBS de Dulbecco para lavarlos entre mediciones. Continúe recopilando todas las mediciones TEER para dos controles de inserción de pozo en blanco más. Recopile las mediciones TEER de las placas de muestra como se demostró anteriormente.
Una vez que se han realizado todas las mediciones, el electrodo vuelve a la solución de alcohol isopropílico al 70% durante 30 minutos. Luego desconecte los electrodos del instrumento TEER y déjelos secar al aire. Calcule los valores TEER.
Aspirar el medio del compartimiento basolateral y reemplazarlo con dos mililitros de medio de crecimiento de células endoteliales libres de rojo fenol en el modelo de barrera hematoencefálica de cultivo de células triples. Lave las celdas en el compartimiento apical dos veces con HBSS. Agregue un mililitro de la solución de dextrano FITC en el compartimiento apical y cubra la placa con papel de aluminio, luego coloque la placa en la incubadora a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante una hora.
Tome 100 microlitros de medio de los compartimentos basolaterales y transfiéralo a una placa negra de 96 pocillos. Mida la fluorescencia utilizando un lector de microplacas con las longitudes de onda de excitación y emisión establecidas en 480 y 530 nanómetros, respectivamente. Semilla 200 microlitros de HBMEC, astrocitos primarios y HBVP en el centro de platos con fondo de vidrio de 35 milímetros recubiertos de poli-D-lisina a una densidad de 150, 000 células por plato.
Antes de sembrar HBMEC, cubra la parte inferior de los platos con el factor de fijación. Permita que las células se adhieran a la superficie del vidrio dejándolas durante la noche a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono. Una vez alcanzada la confluencia, deseche el medio de cultivo y agregue dos mililitros de medio libre de glucosa precalentado para la privación de oxígeno-glucosa o medio normal para los controles.
Después del tratamiento de privación de oxígeno-glucosa, reemplace el medio con el medio optimizado para imágenes en todos los platos, luego realice imágenes de fluorescencia de células vivas con el filtro GFP y la incubadora de microscopio confocal de etapa superior como se describe en el manuscrito de texto. La integridad de la barrera de la monocapa endotelial en las configuraciones indicadas del modelo de barrera hematoencefálica se evaluó determinando TEER antes y después de las privaciones de oxígeno-glucosa, así como después de 24 horas de reoxigenación. Durante cuatro horas, la privación de oxígeno-glucosa causó una disminución significativa en los valores de TEER solo en el monocultivo HBMEC y el modelo de cocultivo con HBMEC y HBVP.
Estos niveles disminuidos alcanzaron los niveles basales después de 24 horas de reoxigenación. Los valores de TEER en el modelo de triple cocultivo fueron significativamente más altos que los de los controles de doble cocultivo o control de monocultivo inmediatamente después de la privación de oxígeno-glucosa. La permeabilidad paracelular de las monocapas endoteliales a 20 kilodalton de masa molecular, FITC dextrano, se incrementó drásticamente en el monocultivo de HBMEC y, en menor medida, en el modelo de cocultivo con HBMEC y HBVP en comparación con los controles normóxicos.
Además, los niveles de permeabilidad dextrano FITC de 20 kilodalton fueron los más bajos en el modelo de triple barrera cerebro-sangre entre todos los modelos en condiciones de privación normóxica y de oxígeno-glucosa. No se observaron cambios en el flujo de dextrano de 70 kilodalton, FITC a través de monocapas endoteliales en ninguno de los modelos. Todos los tipos humanos primarios expuestos a la privación de oxígeno-glucosa exhibieron una fuerte fluorescencia verde, lo que demuestra que las células vivas fotografiadas eran hipóxicas.
Después de sembrar pericitos vasculares del cerebro humano en el lado abluminal de los insertos de pozo, es muy importante cubrirlos con la placa abatible para evitar la evaporación. En nuestro modelo, utilizamos un diámetro de poro relativamente pequeño de 0,4 micrómetros de insertos de pocillos de poliéster, lo que lo hace adecuado para la detección de candidatos a fármacos para cualquier enfermedad que requiera cruzar la barrera hematoencefálica para el tratamiento. Esta técnica proporciona una excelente oportunidad para visualizar la modificación de proteínas y transportadores si es necesario.
