El trabajo cuenta con el apoyo parcial del Fondo de la Universidad de Wageningen (WUF), el Programa del Consejo de Becas de China para Estudiantes Graduados y una subvención NWO-VIDI 12378.

1. Condiciones de cultivo y pruebas de plantas
<ol><li>Cultivar y mantener las plantas en invernaderos controlados o cámaras climáticas dentro del rango de temperatura de 18-22 °C y bajo régimen de luz natural o con un régimen de 16 h/8 h día/noche. Retire las ramas axilares para que las plantas sean más manejables.</li>
	<li>Para la patata, mantener las plantitas in vitro en frascos de plástico estériles que contengan medio Murashige-Skoog (MS) (sacarosa de 20 g/L, sales de 5 g/L ms con vitaminas, agar 8 g/L, pH 5,8) en condiciones controladas en cámaras climáticas a 18 °C con un régimen de 16 h/8 h día/noche durante dos semanas y luego transferirlas a macetas de suelo esterilizado en compartimentos de invernadero regulados.</li>
</ol>2. Agroinfiltración
<ol><li>Material vegetal: Para Nicotiana benthamiana,use alrededor de plantas cultivadas con semillas de 4-5 semanas de edad. Para la patata, utilice alrededor de trasplantes de 4-5 semanas de edad de in vitro. Elija hojas jóvenes, sanas y completamente desarrolladas para infiltraciones.</li>
	<li>
Cultivo de Agrobacterium:<ol>
<li>Preparar el medio YEB con antelación (Tabla 1). Llene los tubos de 50 ml con un medio YEB de 10 ml suplementado con acetosirona de 1 μl (200 mM), tampón MES de 100 μl (ácido sulfónico de 2-(N-morfolino)-etano, 1 M) y los antibióticos apropiados. Pipeta 20 μl de glicerol stock de las cepas deseadas (Tabla 2) (que contiene el gen de interés) en el YEB. Iniciar cultivos para todas las cepas de Agrobacterium en este ensayo al mismo tiempo. Incubar las células agitando durante 1-2 días a 28 °C y 200 rpm a un OD600 de aproximadamente 1.0.</li>
		<li>Cosechar células por centrifugación a 3.000 x g durante 10 min. Vierta el sobrenadante y resuspend el pellet en medio de MMA recién hecho (Tabla 3) a un OD600 de 0.3. Suavemente células de vórtice para resuspend ellos. Para la coinfiltración de dos cepas bacterianas, mezcle el cultivo en una proporción de 1:1.</li>
		<li>Deje el cultivo en el banco a temperatura ambiente durante 1-6 horas antes de las infiltraciones. Mientras tanto, etiquete las plantas a infiltrar y la fecha del experimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Infiltraciones: Use una jeringa sin agujas de 1 ml para infiltrarse en las suspensiones de Agrobacterium. Inyecte cuidadosa y lentamente los paneles de hojas con las suspensiones de la jeringa (por razones de salud y seguridad, se debe usar protección ocular durante este proceso). Infiltrar al menos tres plantas por cada cepa. Utilice tres hojas por planta para servir como triplicados. Nota: Normalmente, 1 ml de suspensión de Agrobacterium s podría ser suficiente para 3 plantas de N. benthamiana. Para la papa, se necesita más suspensión porque las hojas de las especies solanum son más difíciles de infiltrar. Los volúmenes requeridos de suspensiones dependen de las especies solanum. Evite la contaminación cruzada cambiando guantes o esterilizando guantes con etanol entre infiltraciones y no regando las plantas hasta el día después de la inoculación.</li>
	<li>Puntuación: Puntuar las respuestas macroscópicas unos 3 días después de la infiltración cuando el fenotipo de muerte celular es claro (Figura 1). Si el fenotipo de muerte celular es cuantitativo, utilice los criterios dados (Figura 2). Brevemente, las escalas para la puntuación macroscópica de la muerte celular dependen principalmente de los porcentajes de muerte celular del área infiltrada. Los porcentajes de muerte celular se representan en una escala de 0% (sin síntomas) a 100% (muerte celular confluente). Las respuestas intermedias van desde respuestas débiles como la clorosis hasta el aumento de los niveles de muerte celular. Si se desea, la puntuación macroscópica también se puede evaluar cuantitativamente utilizando equipos modernos de fotoimagen.</li>
</ol>3. Pvx Agroinfection
<ol><li>Material vegetal: Para N. benthamiana,use alrededor de 2-3 plantas cultivadas con semillas de 2-3 semanas de edad. Para la patata, utilice alrededor de trasplantes de 2-3 semanas de edad de in vitro. Para pruebas a gran escala, utilice plantas ligeramente más viejas (4-5 semanas), ya que estas plantas tienen hojas más y más grandes para acomodar un mayor número de puntos de inoculación de Agrobacterium.</li>
	<li>
Cultivo de Agrobacterium: <ol>
<li>Prepare el medio YEB con anticipación. Llene los tubos de 10 ml con 3 ml de YEB suplementados con los antibióticos apropiados. Pipeta 20 μl de glicerol stock de las cepas deseadas (Tabla 2) (que contiene el gen de interés) en el YEB. Iniciar cultivos para todas las cepas de Agrobacterium en este ensayo al mismo tiempo. Incubar las células agitando durante 1-2 días a 28 °C y 200 rpm a un OD600 de aproximadamente 1.0.</li>
		<li>Pipetear unos 300 μl de cada cepa de Agrobacterium y esparcirlos sobre placas de medio de agar sólido LB complementadas con los antibióticos apropiados e incubar las células a 28 °C durante 1-2 días.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Infecciones: Utilice una espátula para recoger el cultivo de Agrobacterium en el plato. Sumerja un palillo de dientes de madera en el cultivo de Agrobacterium en la espátula y perfore las hojas para inocular gran cantidad de bacterias. Inocular al menos tres plantas para cada cepa. Utilice tres hojas por planta para servir como triplicados. En cada hoja, haga múltiples sitios de inoculación para cada cepa.</li>
	<li>Puntuación: Puntuar las respuestas macroscópicas unas dos semanas después de la inoculación(Figura 3). Para pantallas de alto rendimiento, registre las respuestas cualitativas (sí/no) para cada punto de inoculación. A continuación, calcule el porcentaje de sitios que responden y compárelos con los controles.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+and+exploiting+late+blight+resistance+in+the+age+of+effectors.">Understanding and exploiting late blight resistance in the age of effectors.</a> Ann. Rev. Phytopathol. 49, 507-531 (2011).</li><li>Ellis, J. G., Rafiqi, M., Gan, P., Chakrabarti, A., Dodds, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+discovery+and+functional+analysis+of+effector+proteins+of+fungal+and+oomycete+plant+pathogens.">Recent progress in discovery and functional analysis of effector proteins of fungal and oomycete plant pathogens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 12, 399-405 (2009).</li><li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+genomics+accelerates+discovery+and+functional+profiling+of+potato+disease+resistance+and+Phytophthora+infestans+avirulence+genes.">Effector genomics accelerates discovery and functional profiling of potato disease resistance and Phytophthora infestans avirulence genes.</a> Plos One. 3, 1-10 (2008).</li><li>Oh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+expression+screens+of+Phytophthora+infestans+RXLR+effectors+reveal+diverse+phenotypes,+including+activation+of+the+Solanum+bulbocastanum+disease+resistance+protein+Rpi-blb2.">In planta expression screens of Phytophthora infestans RXLR effectors reveal diverse phenotypes, including activation of the Solanum bulbocastanum disease resistance protein Rpi-blb2.</a> Plant Cell. 21, 2928-2947 (2009).</li><li>Tyler, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytophthora+genome+sequences+uncover+evolutionary+origins+and+mechanisms+of+pathogenesis.">Phytophthora genome sequences uncover evolutionary origins and mechanisms of pathogenesis.</a> Science. 313, 1261-1266 (2006).</li><li>Haas, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+and+analysis+of+the+Irish+potato+famine+pathogen+Phytophthora+infestans.">Genome sequence and analysis of the Irish potato famine pathogen Phytophthora infestans.</a> Nature. 461, 393-398 (2009).</li><li>Levesque, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+necrotrophic+plant+pathogen+Pythium+ultimum+reveals+original+pathogenicity+mechanisms+and+effector+repertoire.">Genome sequence of the necrotrophic plant pathogen Pythium ultimum reveals original pathogenicity mechanisms and effector repertoire.</a> Genome Biol. 11, 1-22 (2010).</li><li>Lamour, K. H., Win, J., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oomycete+genomics:+new+insights+and+future+directions.">Oomycete genomics: new insights and future directions.</a> FEMS Microbiol. Lett. 274, 1-8 (2007).</li><li>Stassen, J. H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+identification+in+the+lettuce+downy+mildew+Bremia+lactucae+by+massively+parallel+transcriptome+sequencing.">Effector identification in the lettuce downy mildew Bremia lactucae by massively parallel transcriptome sequencing.</a> Mol. Plant Pathol. 13, 719-731 (2012).</li><li>Kemen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+gain+and+loss+during+evolution+of+obligate+parasitism+in+the+white+rust+pathogen+of+Arabidopsis+thaliana.">Gene gain and loss during evolution of obligate parasitism in the white rust pathogen of Arabidopsis thaliana.</a> PLoS Biol. 9, 1-21 (2011).</li><li>Win, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Effector biology of plant-associated organisms: concepts and perspectives. , 1-13 (2012).</li><li>Hogenhout, S. A., van der Hoorn, R. A. L., Terauchi, R., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+effector+biology+of+plant-associated+organisms.">Emerging concepts in effector biology of plant-associated organisms.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 22, 115-122 (2009).</li><li>Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+catalogue+of+the+effector+secretome+of+plant+pathogenic+oomycetes.">A catalogue of the effector secretome of plant pathogenic oomycetes.</a> Ann. Rev. Phytopathol. 44, 41-60 (2006).</li><li>van der Hoorn, R. A. L., Laurent, F., Roth, R., De Wit, P. J. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agroinfiltration+is+a+versatile+tool+that+facilitates+comparative+analyses+of+Avr9/Cf-9-induced+and+Avr4/Cf-4-induced+necrosis.">Agroinfiltration is a versatile tool that facilitates comparative analyses of Avr9/Cf-9-induced and Avr4/Cf-4-induced necrosis.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 13, 439-446 (2000).</li><li>Dangl, J. L., Jones, J. D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+pathogens+and+integrated+defence+responses+to+infection.">Plant pathogens and integrated defence responses to infection.</a> Nature. 411, 826-833 (2001).</li><li>Kapila, J., de Rycke, R., van Montagu, M., Angenon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Agrobacterium-mediated+transient+gene+expression+system+for+intact+leaves.">An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves.</a> Plant Sci. 122, 101-108 (1997).</li><li>Kanneganti, T. D., Huitema, E., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+expression+of+oomycete+and+fungal+genes.">In planta expression of oomycete and fungal genes.</a> Methods Mol. Biol. 354, 35-43 (2007).</li><li>Vleeshouwers, V. G. G. A., Rietman, H., Lamour, K., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+expression+systems.+Oomycete+Genetics+and+Genomics.">In planta expression systems. Oomycete Genetics and Genomics.</a> Diversity, Interactions, and Research Tools. 23, 455-475 (2009).</li><li>Peng, W. T., Lee, Y. W., Nester, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phenolic+recognition+profiles+of+the+Agrobacterium+tumefaciens+VirA+protein+are+broadened+by+a+high+level+of+the+sugar+binding+protein+ChvE.">The phenolic recognition profiles of the Agrobacterium tumefaciens VirA protein are broadened by a high level of the sugar binding protein ChvE.</a> J. Bacteriol. 180, 5632-5638 (1998).</li><li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+virus-induced+gene+silencing+implicates+heat+shock+protein+90+in+plant+disease+resistance.">High throughput virus-induced gene silencing implicates heat shock protein 90 in plant disease resistance.</a> EMBO J. 22, 5690-5699 (2003).</li><li>Ma, L., Lukasik, E., Gawehns, F., Takken, F. L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+agroinfiltration+for+transient+expression+of+plant+resistance+and+fungal+effector+proteins+in+Nicotiana+benthamiana+leaves.">The use of agroinfiltration for transient expression of plant resistance and fungal effector proteins in Nicotiana benthamiana leaves.</a> Methods Mol. Biol. 835, 61-74 (2012).</li><li>Bhaskar, P. B., Venkateshwaran, M., Wu, L., An&#233;, J. M., Jiang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transient+gene+expression+and+silencing:+A+rapid+tool+for+functional+gene+assay+in+potato.">Agrobacterium-mediated transient gene expression and silencing: A rapid tool for functional gene assay in potato.</a> Plos One. 4, 1-8 (2009).</li><li>van der Fits, L., Deakin, E. A., Hoge, J. H. C., Memelink, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ternary+transformation+system:+constitutive+virG+on+a+compatible+plasmid+dramatically+increases+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">The ternary transformation system: constitutive virG on a compatible plasmid dramatically increases Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Mol. Biol. 43, 495-502 (2000).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+enabled+the+isolation+of+the+R3a+late+blight+resistance+gene+in+potato.">Comparative genomics enabled the isolation of the R3a late blight resistance gene in potato.</a> Plant J. 42, 251-261 (2005).</li><li>Armstrong, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ancestral+oomycete+locus+contains+late+blight+avirulence+gene+Avr3a,+encoding+a+protein+that+is+recognized+in+the+host+cytoplasm.">An ancestral oomycete locus contains late blight avirulence gene Avr3a, encoding a protein that is recognized in the host cytoplasm.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7766-7771 (2005).</li><li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+spectrum+late+blight+resistance+in+potato+differential+set+plants+MaR8+and+MaR9+is+conferred+by+multiple+stacked+R+genes.">Broad spectrum late blight resistance in potato differential set plants MaR8 and MaR9 is conferred by multiple stacked R genes.</a> Theor. Appl. Genet. 124, 923-935 (2012).</li><li>Torto, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EST+mining+and+functional+expression+assays+identify+extracellular+effector+proteins+from+the+plant+pathogen+Phytophthora.">EST mining and functional expression assays identify extracellular effector proteins from the plant pathogen Phytophthora.</a> Genome Res. 13, 1675-1685 (2003).</li><li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agroinfection-based+high-throughput+screening+reveals+specific+recognition+of+INF+elicitins+in+Solanum.">Agroinfection-based high-throughput screening reveals specific recognition of INF elicitins in Solanum.</a> Mol. Plant Pathol. 7, 499-510 (2006).</li><li>Koncz, C., Schell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promoter+of+TL-DNA+gene+5+controls+the+tissue-specific+expression+of+chimeric+genes+carried+by+a+novel+type+of+agrobacterium+binary.">The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimeric genes carried by a novel type of agrobacterium binary.</a> Mol. Gen. Genet. 204, 383-396 (1986).</li><li>Lazo, G. R., Stein, P. A., Ludwig, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+transformation-competent+Arabidopsis+genomic+library+in+Agrobacterium.">A DNA transformation-competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium.</a> Bio-Technol. 9, 963-967 (1991).</li><li>Rietman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Putting the Phytophthora infestans genome sequence at work; multiple novel avirulence and potato resistance gene candidates revealed [PhD thesis]. , (2011).</li><li>Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transient+assays+of+gene+expression+in+lettuce,+tomato+and+Arabidopsis.">Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis.</a> Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).</li><li>van engelen, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pBINPLUS+-+an+improved+plant+transformation+vector+based+on+pBIN19.">pBINPLUS - an improved plant transformation vector based on pBIN19.</a> Transgenic Res. 4, 288-290 (1995).</li><li>Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATEWAYTM+vectors+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">GATEWAYTM vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Trends Plant Sci. 7, 193-195 (2002).</li><li>Xiang, C. B., Han, P., Lutziger, I., Wang, K., Oliver, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mini+binary+vector+series+for+plant+transformation.">A mini binary vector series for plant transformation.</a> Plant Mol. Biol. 40, 711-717 (1999).</li><li>Curtis, M. D., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gateway+cloning+vector+set+for+high-throughput+functional+analysis+of+genes+in+planta.">A gateway cloning vector set for high-throughput functional analysis of genes in planta.</a> Plant Physiol. 133, 462-469 (2003).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Los ensayos transitorios como la agroinfiltración y la agroinfección son métodos eficientes que son vitales para la investigación molecular moderna de la fitopatología. A pesar de algunas limitaciones, estos métodos satisfacen la demanda de análisis funcionales eficientes y robustos de alto rendimiento en las plantas.
El sistema de agroinfiltración es un ensayo funcional ampliamente utilizado en una variedad de especies de plantas. La agroinfiltración facilita la entrega de varios transgenes en la misma célula con la expresión simultánea de proteínas que interactúan. Esto es ventajoso para recapitular las relaciones R-AVR, mediante la coinfiltración de cepas de Agrobacterium que expresan genes Avr con cepas que expresan los genes R coincidentes. Además, para los pares R-AVR conocidos, tales coinfiltraciones se pueden utilizar como controles positivos. Incluir estos controles es importante porque en algunos genotipos de plantas, la eficiencia de transformación puede estar por debajo del umbral para detectar respuestas. Incluir controles negativos, por ejemplo, una cepa de Agrobacterium que contiene un vector sin un inserto de genes, también es esencial para determinar si un determinado genotipo de planta plantea respuestas de defensa inespecíficas a Agrobacterium. Esta característica ocurre a una cierta frecuencia en el germoplasma de la patata, y no todas las especies de Solanum son adecuadas para este sistema de expresión basado en Agrobacterium. En general, el ensayo de agroinfiltración funciona muy bien en N. benthamiana y en la mayoría de los genotipos de patata. Además de la efectonomía, hay varias otras aplicaciones potenciales para la técnica de agroinfiltración, como la producción de proteínas a partir de transgenes y la localización de proteínas en células vegetales por microscopía confocal.
La agroinfección de PVX es un sistema de cribado altamente sensible y, por lo general, más adecuado para exámenes de detección de alto rendimiento. Puesto que el Agrobacterium ahora está ahora solamente localmente presente, las respuestas inespecíficas a esta bacteria ahora no son muy inquietantes, pues el virus de PVX asume el control la extensión adicional del transgene. Sin embargo, las plantas pueden ser resistentes al PVX, o montar respuestas de resistencia extrema (ER), y en ese caso el método de agroinfección no es adecuado. Otra limitación del método de agroinfección pvx es el tamaño del inserto del gen de interés. Los fenotipos observados de respuestas pueden variar de una necrosis negra intensa que rodea la herida a la necrosis débil cerca del punto de la inoculación. Tanto en las especies de N. benthamiana como en solanum, la agroinfección por PVX se reconoce como más sensible que la agroinfiltración.
Teniendo en cuenta que el fondo genético de los diversos genotipos de plantas ensayados puede tener algunas restricciones (ver arriba), generalmente obtenemos conclusiones similares por agroinfección y agroinfiltración de PVX. Estos resultados también son comparables a los obtenidos en otros ensayos, como las infiltraciones de proteínas29 y ELISA3. Teniendo en cuenta las ventajas y limitaciones de ambos sistemas, se recomienda utilizar ambos métodos para complementarse entre sí o confirmar resultados independientes.

Efectoroómica, un enfoque de genómica funcional de alto rendimiento ha surgido recientemente como una poderosa herramienta para identificar genes de resistencia(R)en plantas de cultivo y genes de avirulencia(Avr)coincidentes de patógenos1-4. En contraste con la transformación estable más lenta con genes R, la estrategia efectoómica se basa en ensayos transitorios de secuencias de genes patógenos.
Desde la era de la genómica, los genomas de patógenos de plantas han sido ampliamente explorados. Por ejemplo, para los oomycetes, que incluyen los patógenos vegetales más devastadores, se han generado y analizado grandes colecciones de secuencias en busca de genes que desempeñen un papel durante la interacción con la planta5-10. Una clase de proteínas patógenas representa efectores, que manipulan la estructura y la función de las células huésped, ya sea para facilitar la infección (factores de virulencia) o para desencadenar respuestas de defensa (factores de avirulencia)11-13. La expresión de genes Avr en células vegetales que contienen genes R suele tener como resultado la respuesta a la muerte celular hipersensible (HR)14,15. En planta la expresión de los genes R y Avr se puede lograr utilizando sistemas de expresión transitoria como Agrobacterium tumefaciens -basado en la transformación transitoria (agroinfiltración)16. Esta transformación transitoria también se puede aplicar en combinación con sistemas de expresión viral (agroinfección)17,18.
Para la agroinfiltración, el agente más comúnmente utilizado es A. tumefaciens, un patógeno de amplio rango de plantas de dicot. A . tumefaciens contiene un plásmido inductor de tumores (Ti). El ADN de transferencia (T-DNA) de un plásmido Ti se translocará en las células vegetales después de que se active la maquinaria de virulencia de la bacteria. Esto puede ser desencadenado en células vegetales heridas, por los compuestos fenólicos de bajo peso molecular liberados y monosacáridos en un ambiente ligeramente ácido19. El gen de virulencia se activa después de la infiltración de suspensiones de Agrobacterium en paneles de hojas definidos por las venas principales. Luego, las células vegetales en los paneles de hojas se transformarán y expresarán los transgenes contenidos en la región T-DNA.
Agroinfection se basa en Agrobacteriumherida-inoculado, que media el desplazamiento de un virus a las células de la planta. El virus luego se propaga aún más a los tejidos vegetales adyacentes, en ausencia de Agrobacterium. Para la agroinfección, se pueden utilizar varios virus de plantas. Los virus ARN son vectores ideales para la expresión génica porque pueden multiplicarse a niveles muy altos en plantas infectadas. Entre los virus arn de las plantas, el virus de la patata X (PVX) es ampliamente utilizado para las pantallas de efectonomía. Para facilitar las pruebas funcionales de un gen insertado, se clonaron en el T-DNA de A. tumefaciensel promotor del virus del mosaico de la coliflor 35S y el terminador de la nopalina sintasa. Después de que el T-DNA se transfiere a las células de la planta, el genoma de PVX contenido en el T-DNA se transcribe del promotor 35S. Luego, las partículas de virus se propagan sistémicamente en las plantas infectadas, lo que resulta en la expresión del gen insertado. Este método basado tanto en Agrobacterium como en PVX se denomina agroinfección PVX.
Aquí mostramos ejemplos de ensayos de agroinfiltración y agroinfección pvx. Como plantas huésped utilizamos germoplasma de patata(solanum sección Petota),para lo cual los enfoques efectorómicos han sido pioneros y han demostrado ser exitosos3,4. También utilizamos Nicotiana benthamiana,que es reconocida como una planta modelo en plantas solanáceas 14,21,22.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="955">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Beef extract</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">B4888</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Bacteriological peptone</td>
			<td style="width:267px;">Oxoid</td>
			<td style="width:219px;">LP0037</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:267px;">Oxoid</td>
			<td style="width:219px;">LP0021</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">MgSO4</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">208094</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">MS salts (without vitamins)</td>
			<td style="width:267px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:219px;">M0221</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">MES</td>
			<td style="width:267px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:219px;">M1503</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">LB broth powder</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">L3022</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">D134406</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Syringe (1 ml)</td>
			<td style="width:267px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:219px;">300013</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Incubator</td>
			<td style="width:267px;">Infors HT</td>
			<td style="width:219px;">Multitron II</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:267px;">Heraeus</td>
			<td style="width:219px;">Multifuge 3S-R</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:267px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:219px;">Biophotometer 6131</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agroinfiltration and pvx agroinfection in potato and nicotiana benthamiana

La agroinfiltración y la agroinfección por PVX son dos ensayos eficientes de expresión transitoria para el análisis funcional de genes candidatos en plantas. El agente más comúnmente utilizado para la agroinfiltración es Agrobacterium tumefaciens, un patógeno de muchas especies de plantas de dicot. Esto implica que la agroinfiltración se puede aplicar a muchas especies de plantas. Aquí, presentamos nuestros protocolos y resultados esperados al aplicar estos métodos a la patata(Solanum tuberosum),su especie silvestre relacionada con tubérculos(Solanum sección Petota)y la planta modelo Nicotiana benthamiana. Además del análisis funcional de genes individuales, como los genes de resistencia(R)o avirulencia(Avr),el ensayo de agroinfiltración es muy adecuado para recapitular las interacciones R-AVR asociadas con interacciones específicas de patógenos del huésped simplemente entregando transgenes R y Avr en la misma célula. Sin embargo, algunos genotipos vegetales pueden elevar las respuestas de defensa inespecíficas a Agrobacterium,como observamos por ejemplo para varios genotipos de patata. En comparación con la agroinfiltración, la detección de la actividad avr con la agroinfección PVX es más sensible, más de alto rendimiento en pantallas funcionales y menos sensible a las respuestas de defensa inespecíficas a Agrobacterium. Sin embargo, la defensa inespecífica al PVX puede ocurrir y hay un riesgo de faltar respuestas debido a la resistencia extrema virus-inducida. A pesar de tales limitaciones, en nuestra experiencia, la agroinfiltración y la agroinfección de PVX son ensayos adecuados y complementarios que se pueden utilizar simultáneamente para confirmar los resultados de cada uno.

La Figura 1 muestra un experimento representativo de agroinfiltración con 7 efectores diferentes (E1-E7) en patata y N. benthamiana. La muerte celular aparece en los paneles de hojas infiltradas unos 3 días después de la infiltración. El grado del fenotipo de la muerte celular necesita ser comparado con los controles. Se utilizó comocontrolpositivo una mezcla de la cepa Agrobacterium AGL1(pVirG)23 que contenía pBINplus-R3a y pK7WG2-AVR3a, mientras que AGL1(pVirG) se utilizó como control negativo. Las figuras 1A y 1B muestran buenos ejemplos de agroinfiltración en el genotipo de patata MaR8 (Mastenbroek R8)26 y N. benthamiana,respectivamente, que son muy susceptibles de agroinfiltración. Hay muerte celular confluente en el panel de la hoja coinfiltrado con control positivo, mientras que ninguna respuesta de muerte celular se produce con control negativo o pBINplus-R3a. En MaR8, dos efectores AVR3a (E2) y AVR4 (E3) inducen una muerte celular, mientras que los otros efectores (E1 y E4-E7) no. En N. benthamiana, ninguno de los efectores probados induce una respuesta de muerte celular. Las figuras 1C y 1D muestran ejemplos de agroinfiltración en la patata silvestre Solanum berthaultii 483-1 y Solanum rechei 210-5, que no son bien susceptibles para la técnica de agroinfiltración. En S. berthaultii 483-1, el tejido foliar muestra una necrosis inespecífica a los controles negativos, así como a todos los efectores probados. En S. rechei 210-5, los paneles de hojas infiltradas muestran una respuesta de muerte celular muy débil al control positivo.
La Figura 2 muestra un rango de escalas de puntuación que se pueden utilizar para cuantificar la respuesta a Agrobacteriumagroinfiltrado. Los porcentajes de muerte celular se representan en una escala 0-100%. Los fenotipos observados van desde síntomas macroscópicamente no visibles (0%), pasando por un rango de respuestas intermedias que muestran clorosis y aumento de los niveles de muerte celular, hasta la muerte celular confluente (100%).
La Figura 3 muestra un experimento representativo después de la agroinfección de PVX en patata. Normalmente, la muerte celular de expansión se puede encontrar en los sitios alrededor de dos semanas después de la inoculación de la dedo-selección. Como se muestra en ambos paneles de figuras, la muerte celular en expansión está presente en los sitios que fueron inoculados con pGR106-CRN2 (control positivo utilizando el efector crinkler Crn2), que es un gen inductor de muerte celular general de P. infestans27. Aparte de respuesta de menor importancia a herir, no se observa ninguna muerte celular de expansión en los sitios que eran diente-recogen inoculados con el pGR106-empty (control negativo). En la Figura 3A,que representa el genotipo de patata MaR3 (Mastenbroek R3), dos pGR106-efectores (E1 y E2) no indujeron la muerte celular. En la Figura 3B,se presenta un resultado positivo del cribado efector en el Solanum huancabambense silvestre 354-1; La respuesta a la muerte celular se observó a dos pGR106-efectores (E1-E3, que representan las elicitinas)28.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig1.jpg"> Figura 1. Ejemplos de agroinfiltración en patata y N. benthamiana. Plantas incluyendo(A)un genotipo de patata MaR8 (Mastenbroek R8),(B) N. benthamiana,(C) Solanum berthaultii 483-1 y (D) Solanum rechei 210-5 fueron infiltrados con una mezcla de la cepa Agrobacterium AGL1(pVirG) 23 que contiene pBINplus-R3a y pK7WG2-AVR3a (control positivo), AGL1(pvirG) (control negativo), pBINplus-R3a, y siete efectores (E1-E7). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a>.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig2.jpg"> Figura 2. Cuantificación de respuestas de agroinfiltración. La fotografía muestra escalas de puntuación representativas para la muerte celular, que van desde 0% (sin síntomas) a 100% (muerte celular confluente). Las respuestas intermedias van desde respuestas débiles como la clorosis hasta el aumento de los niveles de muerte celular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a>.
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig3.jpg"> Figura 3. Ejemplos de agroinfección de PVX en papa. Genotipo de papa MaR3 (Mastenbroek R3)(A)y Solanum huancabambense 354-1(B)de recogida de dientes inoculados con pGR106-CRN2 (control positivo), pGR106-vacío (control negativo) y pGR106-E1-2 (efectores), o pGR106-E1-E3, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a>.
Tabla 1. Medio YEB
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>1 L</td>
			<td>destilado H2O</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 g</td>
			<td>sacarosa</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 g</td>
			<td>extracto de carne de vacuno</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 g</td>
			<td>peptona bacteriológica</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 g</td>
			<td>extracto de levadura</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 ml</td>
			<td>MgSO4 (1 M)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2. Vectores y cepas utilizados para la agroinfiltración y la agroinfección de PVX. Se pueden utilizar varios vectores binarios. Los vectores en la lista a continuación permiten una alta expresión de los genes candidatos y han funcionado bien en nuestras manos. Preferimos utilizar la cepa Agrobacterium GV3101(pMP90)29 en N. benthamiana y encontrar AGL130 que contiene el plásmido ayudante pVirG (pBBR1MCS-5.virGN54D)23 más adecuado en patata31. Se han analizado cepas adicionales en otros grupos en varias plantas modelo, incluyendo N. benthamiana, pero no en la patata32.
<img alt="Table 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971table2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971table2.jpg">
GW: versión de puerta de enlace36
Tabla 3. Medio de MMA. <img alt="Table 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971table3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971table3.jpg">
Ajuste el pH a 5.6.

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Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

La agroinfiltración y la agroinfección por PVX son ensayos funcionales de rutina para la expresión ectópica transitoria de genes en plantas. Estos métodos son ensayos eficientes en estrategias efectoómicas (resistencia rápida y descubrimiento de genes de avirulencia) y cruciales para la investigación moderna en fitopatología molecular. Satisfacen la demanda de análisis funcionales robustos de alto rendimiento en las plantas.

Agroinfiltración y PVX Agroinfección en Papa y Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

agroinfiltration-pvx-agroinfection-potato-nicotiana

Research

JoVE Journal

Biology

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

20.1K vistas.  Wageningen University. La agroinfiltración y la agroinfección por PVX son ensayos funcionales de rutina para la expresión ectópica transitoria de genes en plantas. Estos métodos son ensayos eficientes en estrategias efectoómicas (resistencia rápida y descubrimiento de genes de avirulencia) y cruciales para la investigación moderna en fitopatología molecular. Satisfacen la demanda de análisis funcionales robustos de alto rendimiento en las plantas.

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Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

Inducida por el virus de silenciamiento génico (VIGS) en Nicotiana benthamiana Y tomate

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Investigación

Biología

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Agroinfiltration eficiente de las plantas para la expresión transitoria de alto nivel de proteínas recombinantes

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short period of time. However, this technology is only just beginning to be applied to large-scale production as many technological obstacles to scale up are now being overcome. Here, we demonstrate a simple and reproducible method for industrial-scale transient protein production based on vacuum infiltration of Nicotiana plants with Agrobacteria carrying launch vectors. Optimization of Agrobacterium cultivation in AB medium allows direct dilution of the bacterial culture in Milli-Q water, simplifying the infiltration process. Among three tested species of Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana &#215; N. excelsior) was selected as the most promising host due to the ease of infiltration, high level of reporter protein production, and about two-fold higher biomass production under controlled environmental conditions. Induction of Agrobacterium harboring pBID4-GFP (Tobacco mosaic virus-based) using chemicals such as acetosyringone and monosaccharide had no effect on the protein production level. Infiltrating plant under 50 to 100 mbar for 30 or 60 sec resulted in about 95% infiltration of plant leaf tissues. Infiltration with Agrobacterium laboratory strain GV3101 showed the highest protein production compared to Agrobacteria laboratory strains LBA4404 and C58C1 and wild-type Agrobacteria strains at6, at10, at77 and A4. Co-expression of a viral RNA silencing suppressor, p23 or p19, in N. benthamiana resulted in earlier accumulation and increased production (15-25%) of target protein (influenza virus hemagglutinin).

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Transient protein production in Nicotiana plants based on vacuum infiltration with Agrobacteria carrying launch vectors (Tobacco mosaic virus-based) is a rapid and economic approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins. We simplified the procedure and improved target accumulation by optimizing conditions of bacteria cultivation, selecting host species, and co-introducing RNA silencing suppressors.

La optimización y utilización de<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Mediada por la producción de proteína transitoria en<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

Complementación de luciferase imagen ensayo en hojas de Nicotiana benthamiana para determinar transitoriamente proteínas interacción dinámica

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing need in developing efficient methods for recombinant antibody production. As of 2019, there were more than 70 FDA-approved monoclonal antibodies, and there is exponential growth potential. Despite their promise, limiting factors for widespread use are manufacturing costs and complexity. Potentially, plants offer low-cost, safe, and easily scalable protein manufacturing&#160;strategies. Plants like Nicotiana benthamiana not only can correctly fold and assemble complex mammalian proteins but also can add critical post-translational modifications similar to those offered by mammalian cell cultures. In this work, by using native GFP and an acid-stable variant of green fluorescent protein (GFP) fused to human monoclonal antibodies, we were able to visualize the entire transient antibody expression and purification process from N. benthamiana plants. Depending on the experiment&#39;s purpose, native GFP fusion can ensure easier visualization during the expression phase in the plants, while acid-stable GFP fusion allows for visualization during downstream processing. This scalable and straightforward procedure can be performed by a single researcher to produce milligram quantities of highly pure antibody or antibody fusion proteins in a matter of days using only a few small plants. Such a technique can be extended to the visualization of any type of antibody purification process and potentially many other proteins, both in plant and other expression systems. Moreover, these techniques can benefit virtual instructions and be executed in a teaching laboratory by undergraduate students possessing minimal prior experience with molecular biology techniques, providing a foundation for project-based exploration with real-world applications.

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

We describe here a simple method for expression, extraction, and purification of recombinant human IgG fused to GFP in Nicotiana benthamiana. This protocol can be extended to purification and visualization of numerous proteins that utilize column chromatography. Moreover, the protocol is adaptable to the in-person and virtual college teaching laboratory, providing project-based exploration.

Producción de proteínas de fusión IgG expresada transitoriamente en Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

Cuantificación del inicio de la muerte celular a través de imágenes continuas

Studying Cell Death Initiation Using a Digital Microscope

Hypersensitive response (HR)-conferred resistance is an effective defense response that can be determined by the N resistance genes. HR is manifested as the formation of cell death zones on inoculated leaves. Here, a protocol for studying the rate of cell death initiation by imaging inoculated leaves in the time between the cell death initiation and the cell death appearance using a digital microscope is presented. The digital microscope enables a continuous imaging process in desired intervals, which allows an accurate determination of cell death initiation rate up to minutes exactly, as opposed to hours in traditional methods. Imaging with the digital microscope is also independent of light and can therefore be used during day and night without disturbing the circadian rhythm of the plant. Different pathosystems resulting in programmed cell death development could be studied using this protocol with minor modifications. Overall, the protocol thus allows simple, accurate, and inexpensive identification of cell death initiation rate.

Autor destacado: Un enfoque simplificado para estudiar el inicio de la muerte celular en la respuesta hipersensible 

Here we present a protocol for studying the rate of programmed cell death initiation by continuously imaging inoculated leaves following cell death induction.

Estudio de la iniciación de la muerte celular mediante un microscopio digital

Hypersensitive response (HR)-conferred resistance is an effective defense response that can be determined by the N resistance genes. HR is manifested as ...

An Experimental Study on Colorado Potato Beetle Hibernation Under Natural Conditions

One of the major pests of potato Solanum tuberosum L. in the temperate zone is the insect Colorado potato beetle (CPB). Most studies on the immunity and diseases of the CPB are conducted during active feeding stages. Nonetheless, there are fewer studies on resting stages, although these beetles spend most of their life cycle in a state of winter diapause (hibernation). In this work, a method for investigating CPB hibernation under natural conditions was developed and tested, offering an opportunity to collect a sufficient number of individuals in winter. In this article, CPB survival was assessed, and infectious agents at different stages of hibernation were identified. CPB mortality increased during the hibernation, reaching a maximum in April-May. Entomopathogenic fungi (Beauveria, Isaria, and Lecanicillium) and bacteria Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas, and Serratia were isolated&#160;from the dead insects. The survival rate of the beetles for the entire hibernation period was 61%. No frozen or desiccated beetles were found, indicating the success of the presented method.

Here we present a method for studying Colorado potato beetle hibernation under the natural conditions of the temperate zone as well as a technique for collecting beetles in winter. This method allows to obtain a desired number of overwintering individuals for various analyses at any stage of hibernation.

Un estudio experimental sobre la hibernación del escarabajo de la papa de Colorado en condiciones naturales

One of the major pests of potato Solanum tuberosum L. in the temperate zone is the insect Colorado potato beetle (CPB). Most studies on the immunity and ...

Análisis de la resiliencia de la papa bajo tensiones relacionadas con el clima

High Throughput Image-Based Phenotyping for Determining Morphological and Physiological Responses to Single and Combined Stresses in Potato

High throughput image-based phenotyping is a powerful tool to non-invasively determine the development and performance of plants under specific conditions over time. By using multiple imaging sensors, many traits of interest can be assessed, including plant biomass, photosynthetic efficiency, canopy temperature, and leaf reflectance indices. Plants are frequently exposed to multiple stresses under field conditions where severe heat waves, flooding, and drought events seriously threaten crop productivity. When stresses coincide, resulting effects on plants can be distinct due to synergistic or antagonistic interactions. To elucidate how potato plants respond to single and combined stresses that resemble naturally occurring stress scenarios, five different treatments were imposed on a selected potato cultivar (Solanum tuberosum L., cv. Lady Rosetta) at the onset of tuberization, i.e. control, drought, heat, waterlogging, and combinations of heat, drought, and waterlogging stresses. Our analysis shows that waterlogging stress had the most detrimental effect on plant performance, leading to fast and drastic physiological responses related to stomatal closure, including a reduction in the quantum yield and efficiency of photosystem II and an increase in canopy temperature and water index. Under heat and combined stress treatments, the relative growth rate was reduced in the early phase of stress. Under drought and combined stresses, plant volume and photosynthetic performance dropped with an increased temperature and stomata closure in the late phase of stress. The combination of optimized stress treatment under defined environmental conditions together with selected phenotyping protocols allowed to reveal&#160;the dynamics of morphological and physiological responses to single and combined stresses. Here, a useful tool is presented for plant researchers looking to identify plant traits indicative of resilience to several climate change-related stresses.

Autor destacado: Desentrañando las respuestas de las plantas al estrés abiótico utilizando la plataforma robótica PlantScreen

We designed an image-based phenotyping protocol to determine the morphological and physiological responses to single and combined heat, drought, and waterlogging treatments. This approach enabled the identification of early, late, and recovery responses at a whole plant level, particularly above-ground parts, and highlighted the necessity of using multiple imaging sensors.

Fenotipado basado en imágenes de alto rendimiento para determinar las respuestas morfológicas y fisiológicas a estreses simples y combinados en patata

High throughput image-based phenotyping is a powerful tool to non-invasively determine the development and performance of plants under specific conditions ...