Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias, (número de concesión IOS-0.842.701 a CAC), y el Instituto Nacional de Salud (R00MH080599 a BY, R21 NS062313 a NC y NS069844 a CAC). Nos gustaría agradecer a James Schutt, Emily Han, y Leni Truong para el apoyo técnico, y la Bolsa de centro de Bloomington para líneas de vuelo. Todos los chips se fabrican en las instalaciones de Lurie nanofabricación de la Universidad de Michigan.

1. Hacer que el chip PDMS Para hacer que un chip de PDMS del molde SU-8, siga los pasos 1.1 a 1.7. Si un chip es a la mano, pero necesita montado para su uso, vaya al paso 1.8. <ol><li> Mezclar 45 g de base de PDMS y 4,5 g de agente (10:1) curar de un kit de PDMS en un pequeño recipiente de plástico desechable y mezclarlos bien con una varilla de agitación de plástico. </li><li> Coloque el recipiente en un recipiente de vacío (por ejemplo, un desecador) durante 10 min para eliminar las burbujas. </li><li> Coloque el molde SU-8 en la parte inferior de un 150 mm de diámetro plato de plástico y se vierte lentamente la mezcla de PDMS en el molde. Tenga cuidado de no generar burbujas mientras se vierte el PDMS. </li><li> Curar el PDMS en un horno (o incubadora) a 650 ° C durante 4 h. </li><li> Retire el molde PDMS/SU-8 curado del horno y deje que se enfríe durante unos minutos. </li><li> Uso de una hoja de afeitar, cortar el PDMS curado a lo largo del borde del molde SU-8 y separarla de SU-8 molde. </li><li> Divida la losa PDMSen PDMS chips individuales utilizando una hoja de afeitar. </li><li> Usando una aguja de dispensación 21 G, hacer un agujero en el puerto de vacío (representado en la Figura 1A) del chip de PDMS. </li><li> Tome una aguja dispensadora 23 G y gire la punta de la aguja de su base un par de veces para romper la punta de la aguja fuera del cubo de bloqueo. </li><li> Inserte la punta de la aguja 23 G en un pequeño trozo de tubo de polietileno para que la tubería cubre al menos un milímetro de la aguja. A continuación, utilice una hoja de afeitar para cortar el exceso de tubo lejos de la aguja. Esto crea un anillo de plástico alrededor de un extremo de la aguja, lo que creará un sello cuando se inserta en el orificio de admisión de vacío. </li><li> Para el uso con un microscopio invertido (Figuras 1B y 2A-B): insertar la punta de la aguja 23 G en el orificio del puerto de vacío. Para el uso con un microscopio vertical (figuras 1C y 2C-D): meter un segundo agujero en el lado del chip de PDMS con un Pinturas de 21 Gnsing aguja; este agujero proporcionará acceso al primer orificio desde el lado. A continuación, inserte la punta de la aguja 23 G con anillo de tubo en el orificio lateral. Coloque un trozo de cinta de doble cara en la parte superior del chip PDMS para sellar el orificio superior (Figura 1C). </li><li> Tome un pedazo de tubo de polietileno que es de aproximadamente 20 cm de longitud. Conectar un lado de la tubería a la punta de la aguja que se inserta en el puerto de vacío. </li><li> Conectar el otro lado de la tubería a uno de los puertos de una válvula de 3 vías (ver &#39;3-manera llave de paso &#39;en la lista de materiales) </li><li> Acople una jeringa de 20 ml en una de dos puertos restantes. El último puerto está abierto al medio ambiente. </li></ol> 2. Usando la viruta Larva de imágenes en vivo <ol><li> Limpie el chip PDMS con cinta adhesiva transparente. Adjuntar un trozo de cinta adhesiva a la parte inferior de la viruta. Asegúrese de que la cinta está en contacto con toda la superficie de PDMS y, a continuación, pelar la cinta. </li><li> Repita el paso anterior 2-3x para asegurarse de quehay partículas o aceite (retenidas a partir de experimentos anteriores) en la superficie del chip de PDMS. Dado que el chip de PDMS es reutilizable, es muy importante para eliminar los residuos de aceite, ya que puede afectar a la adherencia de PDMS al vidrio y resultar en de sellado insuficiente. </li><li> Traslado temprano (es decir, búsqueda de alimento) larvas 3 º a una placa de Petri que contiene agua. (El tercer instar de larvas de etapa de alimentación 3 se encuentran en la comida, en lugar del lado del vial de cultivo). Bañe a las larvas en agua para eliminar el medio de cultivo. </li><li> Tome un cubreobjetos de vidrio limpio y coloque una pequeña gota de aceite Halocarbon 700 en su centro. </li><li> Con unas pinzas, pick suavemente hacia arriba un limpio, las primeras etapas 3 º estadio larva del agua (la larva debe ser ~ 3.5-4 mm de largo). Colocar el animal brevemente en un ligero limpie o toalla de papel para eliminar el exceso de agua y, a continuación, colóquelo en la gota de aceite. La caída debe ser lo suficientemente pequeño tal que la tráquea de las larvas no están recubiertos. Deje que el sta larvaY en la gota de aceite para 10 seg. </li><li> Retire la larva de la gota de aceite y luego se coloca en un portaobjetos de vidrio limpio. </li><li> Transfiera la larva a otro cubreobjetos de vidrio limpio. Este paso elimina el exceso de aceite. </li><li> Preste atención a la orientación larva. Para obtener imágenes de la médula espinal y los nervios segmentarios neural, la parte ventral de la larva debe sentarse en el cubreobjetos. Su lado dorsal, caracterizado por dos tubos traqueales longitudinales, debe estar hacia arriba. Nota: esta es la orientación de la larva prefiere naturalmente. </li><li> Coloque con cuidado el chip PDMS en la parte superior de la larva. La larva se debe alinear a medio centro de la microcámara, con su cola orientada hacia el orificio de vacío. Tenga cuidado de que la larva no toque los bordes de la cámara. Esto es especialmente importante para los terminales anterior y posterior de la tráquea. Nota: este paso se realiza mejor bajo un microscopio estereoscópico. </li><li> Empuje el chip PDMS contra el cubreobjetos de vidrio para lograr un buen sellado. Asegúrese de que la larva está completamentedelimitada por la microcámara cuando el chip PDMS está tocando el cubreobjetos de vidrio. </li><li> Cambie la válvula de 3 vías en tal forma que la jeringa puede aspirar aire de la microcámara de PDMS (a través de la tubería) para crear un vacío. </li><li> Con una mano, sujete firmemente el cubreobjetos chip de PDMS / vidrio. Use la otra mano para tirar el émbolo de la jeringa. Retirar 2-2,5 ml de aire, hasta sentir una resistencia en el mango de la jeringa, para crear el vacío. El vacío produce un sello hermético entre el chip de PDMS, aceite, y las interfaces de cubreobjetos y restringe la movilidad de la larva. </li><li> Cambie la válvula de apagado de tal manera que el chip de PDMS está aislado de la jeringa y del medio ambiente. Como resultado, un nivel de vacío relativamente estable se mantiene en la microcámara sin la necesidad para sujetar el émbolo de la jeringa. </li><li> Comprobar la larva bajo el estereoscopio para asegurarse de que todo el cuerpo del animal se coloca dentro de la microcámara, y que el animal es inmóvil. La tráquea debe ser visible. El resto de laChip de PDMS debe estar en contacto con el cubreobjetos. Nota: Vea las figuras 2E y 2F de ejemplos de animales correctamente inmovilizadas en el chip. Algunas orientaciones incorrectas se muestran en las Figuras 2G y 2H. </li><li> Coloque el chip larva (chip de PDMS + cubreobjetos de vidrio) en el microscopio. El chip de larva, el tubo y la jeringa se deben manejar con cuidado para evitar el desprendimiento de la viruta PDMS del cubreobjetos. Para un microscopio vertical, fije la parte &quot;superior&quot; del chip a la platina del microscopio con cinta de doble cara (Figura 1C). </li><li> Utilice un objetivo de gran aumento (inmersión en aceite, se recomienda 40-63X) para localizar la estructura (s) de los animales de interés y llevar a cabo la formación de imágenes. En algunos casos, puede ser necesario un aumento menor para identificar la región deseada para la formación de imágenes antes de cambiar a un aumento mayor. </li><li> Cuando se termina de formación de imágenes, liberar el vacío por conmutación de la válvula a la posiciónque está abierto al medio ambiente. </li><li> Desmonte el chip PDMS del cubreobjetos. La larva debe ser inmediatamente móviles. </li><li> Use unas pinzas para quitar la larva de la microcámara y suavemente coloque la larva en una placa de agar jugo de uva para la recuperación. </li></ol> 3. La inducción de una lesión por aplastamiento del nervio a los nervios de las larvas segmentarias <ol><li> Siga el paso 2.3 anterior para aislar principios etapas 3 º estadio las larvas del genotipo deseado. Tal como se describe en el paso 2.3 se bañan las larvas en el agua para retirar los alimentos. </li><li> Utilice una estación de anestesia estándar elevado de CO 2, con CO 2 pad mantiene bajo un microscopio estereoscópico de disección, para someter a las larvas. Las larvas se convierta inmóviles después de la colocación de CO 2 de la almohadilla durante 1-2 minutos. </li><li> Ahora coloque una sola larva anestesiado sobre una placa de agar jugo de uva bajo el microscopio estereoscópico. Gire la parte ventral de los animales hasta visualizar el cordón nervioso ventral y segmentaria nervios a través de la cutícula ( <strong&gt; Figura 3). Asegúrese de que la larva está completamente inmóviles. </li><li> Usando Dumostar número 5 fórceps, pellizcar los nervios segmentarios bien a través de la cutícula durante 5-10 segundos. Cuando esto se hace correctamente, la cutícula se mantiene intacto y la pared del cuerpo no se perfora. Nota: La lesión puede llevar a cabo en diferentes posiciones a lo largo del eje del cuerpo anterior-posterior, siempre y cuando el cable de nervio ventral, glándulas salivales, y los intestinos no están dañados. La ubicación lesión más eficaz es hacia el final del segmento abdominal 3 ª, como se muestra en la Figura 3D. Lesión en este consultorio daña los nervios y la mayoría es el más fácil de reproducir sin matar al animal. </li><li> Después de la lesión, gire el animal de manera que su cara ventral hacia abajo la placa de uva. Debe ser capaz de mover su cabeza y comer. Si la lesión se ha realizado correctamente, entonces se paralizó la mitad posterior de la larva. </li><li> Mantener a los animales heridos en la placa de agar jugo de uva a 25 y# 176; C durante el tiempo deseado de acuerdo con el objetivo experimental. Para motoneuronas, el muñón proximal comienza a brotar dentro de 8-10 horas de la lesión 14, y el muñón distal empieza a degenerar en 6-8 horas 15. Para neuronas sensoriales clase IV da, el muñón proximal comienza a brotar dentro de 4-6 horas, y el inicio muñón distal a degenerar en 3-4 horas después de la lesión. Nota: con los controladores adecuados Gal4 y reporteros fluorescentes, el surgimiento y la degeneración se puede observar en el chip de larva (por ejemplo, véase la Figura 6). </li></ol>

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Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

Realizar u obtener el chip larva: El chip larva se compone de un bloque de PDMS (denominado el &#39;chip de PDMS&#39;) unido a un cubreobjetos de vidrio. El protocolo en el paso 1 se describe el procedimiento para la elaboración y el uso de chips de larva, suponiendo un molde de SU-8 está disponible. El molde SU-8 está microfabricado por fotolitográficamente modelar un 140 m de espesor SU-8 capa de resina fotosensible en una oblea de silicio (para más detalles véase Ghannad-Rezaie et al. 12). A medida que la microfabricación del molde SU-8 requiere el acceso a un equipo especializado, le recomendamos que ordene desde una instalación de microfabricación (por ejemplo. La instalación LNF en la Universidad de Michigan 14), o de una fundición enviándoles el diseño de chips que se proporciona como un archivo adicional. Si uno desea cambiar el diseño del chip de PDMS (por ejemplo, para su uso con larvas de diferentes tamaños), un software de CAD que se encarga de archivos DXF (por ejemplo, AutoCAD) se puede utilizar. Una SU-8 moho también puede ser hecho en casa siguiendo las instrucciones de Mondal et al. 27 Muchos lectores les puede resultar conveniente para simplemente obtener un chip PDMS muestra para probar la técnica antes de fabricar sus propios chips. Esto se hará libremente disponibles bajo petición. El uso del microfluidos &#39;chips larva&#39; para imágenes en vivo: El método de inmovilización en el chip larva evita el uso de anestésicos, y en su lugar implica la presión, a través de la aplicación de un vacío, para restringir el movimiento del animal. Mientras que los animales pueden sobrevivir a la inmovilización en el chip para múltiples hora 12, un período de inmovilización más corta (5-15 min) se recomienda. Este es el tiempo suficiente para obtener imágenes de muchos eventos celulares de interés, incluyendo cambios en el calcio intracelular, o transporte axonal rápido. Este es también el tiempo suficiente para que las manipulaciones deseadas en los animales vivos, como el láser basado en la microcirugía, fotoblanqueo y photoconversión. Para estudiar eventos longitudinalmente más de un período de tiempo más largo en un solo animal, los animales pueden ser colocados en el chip y la imagen varias veces, separadas por períodos de descanso. Placas de agar zumo de uva son ideales para el descanso entre sesiones de formación de imágenes, ya que proporcionan una fuente de alimento fácil y humedad. Varias sesiones de proyección de imagen sí afectan la supervivencia larvaria hasta cierto punto, ya que cada sesión tiene cierto riesgo de dañar el animal (véase la parte 2 en la solución de problemas, más adelante). Los animales pueden ser reflejados de manera rutinaria&gt; 5 veces en el transcurso de dos días con una tasa de supervivencia mayor que 50%. Dado que los animales no son anestesiados, que están sanos y móviles inmediatamente después de la liberación del vacío en el chip. No hay por tanto necesidad de tiempo de recuperación entre las sesiones de formación de imágenes, por lo que la separación de tiempo entre las sesiones es flexible y se puede ajustar a los objetivos del experimento. Solución de problemas: La técnica más común esdemanda a con chip de larva y soluciones recomendadas son las siguientes: (1) El animal se está moviendo demasiado. El exceso de movilidad puede interferir con los objetivos de formación de imágenes. Las razones más comunes para esto en el chip de la larva son: a) el animal es demasiado pequeño para el chip, o b) se ve comprometida la presión de vacío aplicada durante la etapa de inmovilización. El chip larva se describe en este protocolo está diseñado para etapas temprana larvas 3 rd. El tamaño óptimo para el animal es de 3.5-4 mm de largo (a lo largo del eje anteroposterior). Para asegurarse de que la presión de vacío es suficiente, tire las jeringas 2-2,5 ml, o hasta que se sienta resistencia en el mango. Una indicación de que el vacío está trabajando es que las pequeñas burbujas en el canal de perímetro se pueden ver se mueve lentamente hacia la fuente de vacío. Otra indicación es que el cubreobjetos siempre debe viajar con el chip cuando el chip se levanta desde la parte superior (y este es el método recomendado para el transporte de la cámarauna vez que las larvas se coloca y el vacío es en). El vacío puede verse comprometida si hay grietas en los tubos, o si hay aceite en el tubo. Esto puede ser fácilmente dirigida mediante la sustitución de la 23 G dispensación punta de la aguja y tubo de polietileno-50 (de los pasos 1.6 a 1.14). (2) El animal muere después de la impresión en el chip. El procedimiento está destinado a causar el mínimo estrés en el animal, y los animales de tipo salvaje genotipo tienen una tasa de supervivencia&gt; 90%, incluso después de una hora de la inmovilización en el chip 12. Dado que algunos genotipos pueden ser menos resistentes a la tensión del chip, compruebe primero que los animales de tipo salvaje (por ejemplo, Canton S) sobreviven a la técnica de inmovilización. a) La causa más común de la letalidad es el posicionamiento correctos de la larva (véanse las Figuras 2G-H). Si partes de la cutícula, la cabeza o la tráquea no son del todo dentro de la cámara, entonces pueden ser dañados durante la inmovilización, y unalarva que es demasiado grande para el chip (&gt; 4 mm) es menos probabilidades de sobrevivir. b) Una causa menos común para la letalidad es el uso de un exceso de presión o de vacío cuando se carga el chip. Cuando se coloca correctamente en el chip, la presión generada por el vacío es bien tolerado. Sin embargo una presión excesiva, ya sea desde el vacío o en la etapa inicial de la colocación del animal puede ser un problema. Lo mejor es aprender el grado de presión que se necesita empíricamente mediante ensayos con larvas de tipo salvaje del tamaño correcto. c) Si demasiado Halocarbono cubre la tráquea del animal, el animal puede potencialmente tener problemas con la supervivencia a largo plazo. El aceite desempeña varias funciones importantes en el chip: es importante para la creación del vacío, la óptica durante la proyección de imagen, y contrarresta la desecación en el chip. Sin embargo excesiva de aceite debe ser evitado. (Esto también puede conducir a aceite en el tubo y la jeringa, comprometer el vacío). Las capas de protocolo sugerido sólo el lado ventral de la larva con aceite, entonces Removes exceso de aceite de la colocación de la larva en un cubreobjetos limpio antes de ser transferido a la cubreobjetos final para obtención de imágenes. d) fototoxicidad puede ser experimentado de la sesión de imágenes. Al igual que con cualquier aplicación de imagen en vivo, es ideal para utilizar tiempos de exposición cortos con baja intensidad de luz láser, que se logra mejor usando una cámara de alta sensibilidad o detector. Trate de minimizar la iluminación con luz UV, incluyendo la luz de amplio espectro creado por las fuentes de luz de mercurio. Otras cuestiones y direcciones futuras: Dado que este método no utiliza anestesia, el corazón del animal sigue latiendo. Esto crea una cierta movilidad inevitable, que afecta a la imagen en algunos lugares más que otros. Los ejemplos aquí presentados demuestran que el cable ventral del nervio, nervios segmentarios, y la pared del cuerpo se pueden obtener imágenes fácilmente sin la interferencia de los latidos del corazón. En los casos en que el latido del corazón afecta de formación de imágenes, los movimientos regulares a veces pueden ser corregidos para conen el software de análisis (por ejemplo, el estabilizador de imagen plug-in para ImageJ). Esto funciona bien cuando uno de los objetos se están moviendo en una escala de tiempo rápida (por ejemplo, ~ 1 m / seg para el transporte axonal rápido) o en una escala de tiempo muy lento (minutos a horas). Sin embargo, cuando el objeto (s) de interés se mueven con una gama de velocidades y direcciones, puede ser más difícil de corregir para los movimientos inducidos por los latidos del corazón. Otra cuestión es ligera variabilidad en la óptica de animal a animal, o entre múltiples sesiones de formación de imágenes del mismo animal en el chip. El más profundo es el objeto de interés es dentro del animal, la mayor esta variación será. Nervios segmentarios y el cordón nervioso ventral son normalmente demasiado profundo dentro de entonces los animales en ser fotografiado en un microscopio regular. Sin embargo la presión leve con experiencia en el chip de la larva empuja estas estructuras muy cerca de la cutícula y cubreobjetos. La distancia exacta de estas estructuras del cubreobjetos tendrá pequeñas variaciones de trIAL a juicio. La variación de los objetos de cerca de la cutícula, tales como los cuerpos celulares de las neuronas sensoriales, es menor. Por tanto, es importante, en particular para la toma de mediciones de intensidad, de utilizar un gran número de animales y ensayos independientes para dar cuenta de la variabilidad en la óptica. Si bien los ejemplos que se muestran aquí se han centrado en los procesos dentro de las neuronas, el enfoque debe ser susceptibles de obtener imágenes de cualquier estructura en el animal que puede ser interpuesto dentro de la profundidad de enfoque del objetivo del microscopio. Esto incluye la cutícula, músculos de la pared corporal, y sus NMJs. Tráquea en el lado ventral del animal y potencialmente partes del tracto digestivo también pueden obtenerse imágenes. El animal también puede ser colocado con el lado dorsal hacia el cubreobjetos para imágenes a corto plazo de las estructuras cerca de la superficie dorsal. La capacidad de estructuras de la imagen profundo dentro del animal está limitada por la distancia de trabajo del objetivo del microscopio utilizado. Estructuras tales como imdiscos aginal son inaccesibles para gran aumento (por ejemplo, 40X) objetivos. Los chips larva descritos en este protocolo se han diseñado para las larvas en la fase temprana º estadio 3 (que varían en tamaño desde 3,5 hasta 4 mm). Sin embargo, muchas preguntas interesantes requieren de imágenes en diferentes etapas larvales. Virutas más pequeñas para dar cabida a 2 ª instar larvas, o los chips más grandes para dar cabida a finales de los estadios 3 rd pueden ser fácilmente diseñados utilizando el mismo principio. (Figura 1 contiene un archivo DXF fácilmente modificable para la fabricación de moldes de silicona con tamaños de cámara alterados). El principio simple de la junta reversible, incluso se podría aplicar a otros organismos, tales como C. elegans o el pez cebra, con la variante principal que es el tamaño de la cámara. Una dirección futura útil es diseñar un chip que puede inmovilizar a muchos animales a la vez, a utilizar para fines de selección. Sin embargo, para esto, el diseño tendría que ser significativamente diferentedesde el dispositivo actual, en que los problemas de posicionamiento del animal en el chip tiene que ser tratado de forma independiente para cada animal. El ensayo de aplastamiento del nervio para el estudio de las respuestas de lesiones en los nervios periféricos de larvas: El ensayo de aplastamiento del nervio descrito aquí para los nervios segmentarios larvas es un método simple para la introducción de una lesión en axones periféricos en Drosophila. Las ventajas de este método incluyen: a) que es simple de llevar a cabo con herramientas estándar que se encuentran en un laboratorio de Drosophila (una fuente de CO y fórceps estereomicroscopio 2), b) puede llevarse a cabo rápidamente para muchos animales, por lo que el análisis bioquímico de cordones nerviosos después de la lesión factible 14; c) las respuestas moleculares y celulares a esta lesión son altamente reproducibles 14,15,28 y se pueden utilizar para descubrir los procesos que también son importantes en las neuronas de vertebrados 29,30. Métodos alternativos para lesionar neuronas es focusa láser de alta potencia, por ejemplo un UV pulsada o láser de femtosegundo, para cortar un axón mediante microcirugía láser 17,31-33. El chip larva es un método ideal para el posicionamiento del animal para tales microcirugía. Sin embargo, debido a las diferencias de menor importancia en la óptica entre los ensayos, expuestos anteriormente, el método basado en láser puede ser más difícil de reproducir en las larvas, en particular en los nervios segmentarios de larvas. Además, la lesión axonal láser basado requiere más tiempo para posicionar cada animal, por lo tanto, es más difícil de llevar a cabo a gran escala (con un gran número de animales). Solución de problemas: El problema técnico más comúnmente encontrado en el aplastamiento del nervio es la muerte por daños en los órganos internos. Al llevar a cabo la aglomeración, es importante no pellizcar el cable ventral de nervios, glándulas salivales, o los intestinos. También es importante no perforar la cutícula. Estas cuestiones son mejor evitar poniendo los fórceps en un ángulo de 45 º respecto a la superfi cutículaE (véase la Figura 3). La calidad de las pinzas tiene un gran impacto sobre la eficacia de la aglomeración y la supervivencia después. Recomendamos número Dumostar 5 fórceps. Para conservar su nitidez, las pinzas se deben manejar con cuidado, no se utilizan para otros fines, y reemplazados una vez que se conviertan en roma o doblada. El tamaño del animal también puede influir en la eficacia de la aglomeración. Los animales pequeños (de menos de 3 mm de longitud) son mucho menos propensos a sobrevivir a la lesión. Con animales de gran tamaño, (deambular 3 estadios rd), es más difícil localizar los nervios y evitar daño a las glándulas salivales mayores y los intestinos, y hay menos tiempo para estudiar las respuestas de lesiones antes de la fase de pupa. El aplastamiento del nervio se lleva a cabo con mayor eficacia en el estadio las larvas 3 de principios (que son ~ 3-4.5 mm de longitud a lo largo del eje anteroposterior). La fuente de alimento que el animal se eleva sobre puede afectar a lafuerza de la cutícula y la supervivencia después de la aglomeración. Se recomienda para criar animales en los alimentos elaborados a partir de una receta estándar de levadura-glucosa. El mejor método para aprender a hacer la aglomeración eficaz es practicar en muchos animales, primero con el objetivo principal de lograr la supervivencia (y no la fase de pupa) 24 horas después de la aglomeración. Los principiantes suelen tener una baja tasa de supervivencia (por ejemplo, 10%), pero una vez que se aprende la técnica, las tasas de supervivencia pueden alcanzar ~ 90%. Otras cuestiones y direcciones futuras: El ensayo de aplastamiento proporciona un método potente para estudiar el surgimiento de axón proximal al sitio de la lesión y la degeneración de los axones y sinapsis distales al sitio de la lesión. Si bien las tasas de degeneración varían entre diferentes tipos de neuronas, que son altamente reproducibles dentro de un tipo de neurona dada, proporcionando testimonio de la reproducibilidad del ensayo de lesión. En contraste, la &#39;regenerativa&#39; brotaciónrespuesta observada en los axones proximales es más difícil de estudiar. Todos los axones en el nervio segmentaria inician extensa brotación cerca del sitio de la lesión (por ejemplo, ver la Figura 6 y la Figura 3). Sin embargo, el grado de germinación puede variar de una neurona a otra, y es difícil de cuantificar. Un grado y la variabilidad similar en la brotación se pueden observar después de las lesiones más focales de motoneuronas individuales en los nervios segmentarios introducidas por el uso de un UV láser de colorante pulsado. Interpretamos que la direccionalidad nondiscriminate del brote se debe a la ausencia de señales de orientación en los nervios segmentarios. En contraste, los axones de las neuronas sensoriales lesionados por láser cerca de sus cuerpos celulares se someten a un nuevo crecimiento axonal en la misma dirección que el axón perdido 34. Los axones en esta región del animal están probablemente expuestos a la información posicional más específico para la orientación de los axones en regeneración. El ambiente dentro de los nervios segmentarios es poco probable que tenga mucho resemblance con el medio ambiente que los axones originalmente navegado durante su orientación en el embrión, por lo tanto, no se espera que tenga información para guiar los axones en regeneración. Otra limitación para el estudio de la regeneración utilizando el ensayo de aplastamiento del nervio segmentario es que los axones sensoriales y motoneuronas lesionadas tienen todavía una distancia considerable para cubrir (0,25-1 mm) para alcanzar su objetivo, y un marco de tiempo limitado (&lt;3 días) antes de que las experimenta con animales pupación. Un estudio reciente ha identificado una manipulación genética del receptor de la hormona prothoraciotropic que triplica la duración de la fase larvaria 3 º estadio 35. Esta manipulación se extenderá el plazo para el estudio de la recuperación y la degeneración de las neuronas después de la lesión de manera significativa, a 9 en lugar de 3 días. Esto puede ser lo suficientemente largo para observar los nuevos eventos, como la reconexión de un axón lesionado con su objetivo postsináptica, especialmente si la lesión es inducida cerca del final sináptica.

La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, ha sido utilizada como organismo modelo para los más de 100 años, y ha demostrado ser fundamental en la definición de señalización fundamentales y las vías de desarrollo que se conservan desde los invertebrados a humano. Imágenes en vivo es un enfoque importante para el estudio de los mecanismos celulares y el plan corporal simple y cutícula translúcida de la larva de Drosophila hace que sea un atractivo sistema de imágenes en vivo, sobre todo porque hay muchas herramientas genéticas disponibles para la expresión de proteínas fluorescente etiquetados en tipos celulares específicos. Un reto importante para las técnicas de imagen en vivo es inmovilizar de forma no invasiva y la posición de un animal para la microscopía. Enfoques de inmovilización convencionales incluyen la disección 1,2 o el uso de cloroformo, tanto de los que matan el animal. Los anestésicos éter 4 y isofluorano 5-8 también se han utilizado. Los anestésicos proporcionan muchas ventajas, Sino que también inhiben la actividad de los nervios y de la fisiología importantes (incluyendo los latidos del corazón) 9-11, por lo tanto, puede afectar el proceso de estudio y crear estrés en el animal. También hay preocupaciones sobre la seguridad humana para trabajar con éter y isofluorano. Hemos desarrollado un método libre de drogas para inmovilizar las larvas de Drosophila en un único dispositivo de microfluidos PDMS capa, lo que llamamos el &quot;chip de larva &#39;12. Este protocolo se describe cómo obtener o hacer que el chip de larva, y la forma de utilizarlo para imágenes en vivo en las primeras etapas larvas 3 rd. El chip se compone de una microcámara ajustada al cuerpo, que, tras la aplicación de un vacío a través de una jeringa, inmoviliza el animal a través de la fuerza mecánica suave. El método de inmovilización trae estructuras ventrales como el cordón nervioso, los nervios segmentarios, y músculos de la pared del cuerpo, en las proximidades de un cubreobjetos de vidrio. Esto permite una alta resolución de imágenes de este tipo de estructuras con alta aper numéricatura (alta magnificación) objetivos. Ventajas del chip larva sobre otras técnicas convencionales incluyen las siguientes: (i) El uso del chip de larva reemplaza el uso de productos químicos, lo que permite formación de imágenes in vivo de animales no anestesiados. (Ii) Las larvas se recuperan inmediatamente después de la liberación desde el chip (en contraste con un período de recuperación de 2 h para isofluorano 8,13). Esto permite obtener imágenes en escalas de tiempo amplios, que van desde milisegundos a minutos, a horas y días. (Iii) El uso de PDMS, que es un material permeable a los gases, permite la difusión continua de oxígeno / aire desde el medio ambiente en el cuerpo larva. (Iv) El chip es fácil y seguro de usar, y (v) es reutilizable, y puede ser fabricado a un costo mínimo. Además de las instrucciones para el uso del chip de la larva, este protocolo proporcionará varios ejemplos de su uso para estudiar eventos neuronales en 3 ª estadio las larvas. Estos incluyen imágenes en vivo de Axonal transporte, respuestas de calcio a una lesión, y los estudios de lapso de tiempo del tráfico de proteínas de calidad fotográfica convertible a largas distancias y escalas de tiempo. Otra aplicación del chip es para estudiar las respuestas neuronales a la lesión axonal. Para ello un procedimiento adicional se describe (en la parte 3) por herir a los axones en nervios periféricos por un aplastamiento del nervio segmental. Este sencillo ensayo se puede realizar tanto rápidamente y de manera reproducible en un estereomicroscopio de disección estándar, que permite para muchos animales para ser procesados ​​al mismo tiempo. Las respuestas celulares a la lesión pueden ser estudiados mediante imágenes en directo en el chip de larva.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1170">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:259px;">0.5 mm Polyethylene tubing</td>
			<td style="width:171px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:291px;">14-170-11B</td>
			<td style="width:449px;">Polyethylene tubing, I.D. = 0.023&#8217;&#8217;, O.D. = 0.038&#8217;&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">1 mm Polyurethane tubing</td>
			<td style="width:171px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:291px;">BB521-63</td>
			<td style="width:449px;">Polyurethane tubing, I.D. = 0.063&#8217;&#8217;,&#160; O.D. = 0.125&#8217;&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">barb to barb connector</td>
			<td style="width:171px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:291px;">732-8300</td>
			<td style="width:449px;">0.8 mm barb to barb connector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">3-way stopcock valve</td>
			<td style="width:171px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:291px;">732-8104</td>
			<td style="width:449px;">Screw on valve for the syringe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Syringe (20 ml)</td>
			<td style="width:171px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:291px;">14-817-33</td>
			<td style="width:449px;">Screw on 20 ml syringe for&#160; generating vacuum</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:259px;">Dispensing needles, 23 G (.4mm I.D., .6mm O.D.)</td>
			<td style="width:171px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:291px;">75165A684</td>
			<td style="width:449px;">Needle for outlet connection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:259px;">Dispensing needles, 21 G, (.6mm I.D.,&#160; .8mm O.D.)</td>
			<td style="width:171px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:291px;"><a href="http://www.mcmaster.com/#75165A679" title="Close">75165A679</a></td>
			<td style="width:449px;">Needle for outlet connection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Halocarbon oil</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:291px;">H8898</td>
			<td style="width:449px;">Halocarbon oil 700</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Dumostar Number 5 Forceps</td>
			<td style="width:171px;">Roboz</td>
			<td style="width:291px;">RS-498</td>
			<td style="width:449px;">For nerve crush</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:259px;">PDMS Kit (Base and curing agent)</td>
			<td style="width:171px;">Ellsworth</td>
			<td style="width:291px;">184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td style="width:449px;">Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant 0.5 kg Kit Clear</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;">Glass Coverslips</td>
			<td style="width:171px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:291px;">12-544-C</td>
			<td style="width:449px;">24 x 40 mm (thickness according to recommendation for your microscope objective)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Disposable Plastic Cup (9 oz.)</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
			<td style="width:449px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Plastic coffee stirrer stick</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
			<td style="width:449px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Razor Blade</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
			<td style="width:449px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Grape juice agar plates</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
			<td style="width:449px;"><a href="http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925">See http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925 for recipe</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in drosophila larvae

Imágenes en vivo es una técnica importante para el estudio de los procesos biológicos celulares, sin embargo esto puede ser difícil en los animales vivos. La cutícula translúcida de la larva de Drosophila lo convierte en un organismo modelo atractivo para los estudios de imagen en vivo. Sin embargo, un importante reto para las técnicas de imagen en vivo es inmovilizar de forma no invasiva y la posición de un animal en el microscopio. Este protocolo presenta un método simple y fácil de usar para la inmovilización y proyección de imagen larvas de Drosophila en un polidimetilsiloxano (PDMS) dispositivo de microfluidos, lo que llamamos el &quot;chip de larva. El chip de la larva se compone de una microcámara de PDMS ajustada al cuerpo que está conectado a un cubreobjetos de vidrio delgada, que, tras la aplicación de un vacío a través de una jeringa, inmoviliza el animal y trae estructuras ventrales tales como el cordón nervioso, los nervios segmentarios, y el cuerpo músculos de la pared y muy próximo a la cubreobjetos. Esto permite la formación de imágenes de alta resolución, y lo más importante, evita el uso de anesthetics y productos químicos, lo que facilita el estudio de una amplia gama de procesos fisiológicos. Desde larvas recuperar fácilmente de la inmovilización, que pueden ser sometidos fácilmente a múltiples sesiones de formación de imágenes. Esto permite que los estudios longitudinales sobre los cursos de tiempo que van desde horas hasta días. Este protocolo describe paso a paso cómo preparar el chip y la forma de utilizar el chip para imágenes en directo de eventos neuronales en 3 º estadio las larvas. Estos eventos incluyen el rápido transporte de orgánulos en los axones, las respuestas de calcio a una lesión, y los estudios de lapso de tiempo del tráfico de proteínas de calidad fotográfica convertible a largas distancias y escalas de tiempo. Otra aplicación del chip es estudiar regenerativa y respuestas degenerativos de lesión axonal, por lo que la segunda parte de este protocolo describe un procedimiento nuevo y sencillo por herir a los axones en nervios periféricos por un aplastamiento del nervio segmental.

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Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Larvas de Drosophila son un sistema modelo atractivo para imágenes en vivo debido a su cutícula translúcida y la genética de gran alcance. Este protocolo describe cómo utilizar un dispositivo de PDMS de una sola capa, llamada el &#39;chip de larva&#39; para imágenes en vivo de procesos celulares dentro de las neuronas de 3 º estadio las larvas de Drosophila.

El uso de chips de microfluídica para imágenes en vivo y de estudio de las respuestas de lesiones en<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

15.4K vistas.  University of Michigan.  Larvas de Drosophila son un sistema modelo atractivo para imágenes en vivo debido a su cutícula translúcida y la genética de gran alcance. Este protocolo describe cómo utilizar un dispositivo de PDMS de una sola capa, llamada el 'chip de larva' para imágenes en vivo de procesos celulares dentro de las neuronas de 3 º estadio las larvas de Drosophila. 