Agradecemos Rayhan Arif y Hassaan Shahawy para el trabajo de cámara, Tripti Gupta y Frederike Alwes asistencia refinar la técnica de ablación celular, y los miembros del laboratorio Extavour para la retroalimentación de los datos, video y manuscrito. Este trabajo ha sido parcialmente financiado por el Instituto de Células Madre de Harvard (Seed Grant número SG-0057-10-00) la Ellison Medical Foundation (Nueva Académico Premio número AG-NS-07010-10) a la CGE, y premios del programa de la universidad de Harvard para la Investigación ARN.

Los comentarios que pueden ser de ayuda en la ejecución de ciertas medidas se indican en cursiva. 1. Día 1: Preparación de Materiales <ol><li> Prepare los siguientes materiales (véase la Tabla de Materiales y Equipos): <ul><li> 15 cm y 22 cm pipetas Pasteur </li><li> Escribano Diamond </li><li> filtrada agua de mar artificial (salinidad entre 0,0018 a 0,0020) que contiene 1 mg / ml de anfotericina B (1:100 de una solución madre 100 mg / ml), 100 unidades / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina (01:50 de una solución madre que contiene 5.000 unidades / ml de penicilina y 5.000 mg / ml de estreptomicina) </li><li> filtra el agua de mar artificial (salinidad entre 0,0018 hasta 0,0020), sin aditivos </li><li> un gran recipiente de plástico para las parejas de vivienda (al menos 15 cm x 15 cm x 5 cm) </li><li> pequeñas (3 cm o 5 cm) placas de Petri revestidas con Sylgard </li><li> pequeñas (3 cm o 5 cm) placas de Petri </li><li> un vidrio de reloj o de vidrio placa de múltiples pocillos </li><li> fórceps (que usamos fórceps romos derivan from edad Dumont # 5 pinzas que fueron dañados accidentalmente en otros procedimientos de laboratorio, lo que hemos reutilizados mediante el uso de unas pinzas de afilar piedra para asegurar que los extremos de la pinza son suaves, que tanto los dientes tienen la misma longitud, y que ya no tienen puntas afiladas. Pinzas extremadamente finas, como las nuevas Dumont # 5 pinzas, no son deseables, ya que pueden dañar a los embriones y / o mujeres). </li><li> una pipeta Pasteur con el extremo ensanchado (véase el paso 1.2 más abajo) </li><li> una herramienta de recuperación de embriones que consiste de un alambre de tungsteno delgada, curvada encajada en el extremo fino de una pipeta Pasteur (podría ser sustituido por una alternativa implementar; ver 1.3 más abajo) </li><li> una pipeta de boca con una pequeña abertura (véase el paso 1.4 más abajo) </li><li> una aguja de cristal hecha a partir de un capilar de vidrio tirado (véase el paso 1.5) </li></ul> No hay materiales tóxicos para los seres humanos se utilizan en este protocolo. Sin embargo, los investigadores deben asegurarse de que usen guantes o el otro traje de protección como lo requiere la guidel gestión de riesgosines de su institución. </li><li> Para hacer la pipeta Pasteur ampliado, primera puntuación de alrededor de una pipeta Pasteur de 15 cm en el punto donde la pipeta comienza a reducir con una punta trazadora de diamante, envuelva la región de marcado de la pipeta en una toalla de papel Kimwipe o para proteger los dedos, y luego, con cuidado rompa la punta en la línea marcada. Sostenga el extremo roto de la pipeta de una llama de un mechero Bunsen durante varios segundos para suavizar los bordes. La abertura debe ser ligeramente más estrecho que la anchura máxima de la pipeta. </li><li> Para hacer que la herramienta de disección alambre de tungsteno, insertar un alambre de tungsteno en el extremo de un 15 cm pipeta Pasteur de vidrio y mantenga presionado brevemente sobre una llama de mechero Bunsen para fundir el vidrio, la fijación del cable en su lugar. El uso de fórceps a la curva suavemente el extremo del alambre en forma de gancho. Vea la Figura 3 para un ejemplo de una forma apropiada para esta herramienta. </li><li> Para hacer una pequeña abertura para la pipeta de boca, tire del extremo delgado de una pipeta Pasteur 22 cm en dos partes over una llama, y ​​rompa la punta del extremo pequeño. Insertar en el extremo del soporte de pipeta boca. </li><li> Hacer la aguja de vidrio que se utiliza para perforar los blastómeros de interés durante el procedimiento de ablación con un extractor de aguja. Una aguja de forma adecuada se muestra en la Figura 4. Esta aguja se puso una aguja extractora P97 Sutter utilizando un programa con parámetros 2x (calor = 566, tire = 100, velocidad = 20, tiempo = 250) + 1X (calor = 566, tire = 100, velocidad = 100, tiempo = 250). El programa y el instrumento específico usado para hacer que la aguja pueden variar, pero la aguja deben tener una punta fina, sin embargo, también ser lo suficientemente resistente para no romper cuando se empuja contra el corion del embrión. </li></ol> 2. Día 1: Encuentro Parejas Parhyale acoplamiento <ol><li> Use la pipeta Pasteur ampliado (paso 1.2) para recoger el apareamiento P. parejas hawaiensis del recipiente de cultivo grande, y transferirlos a un recipiente que contiene separada cinclinarse agua marina artificial. No es necesario que se va a filtrar esta agua de mar. Es mejor recolectar pares de apareamiento en la tarde por la tarde y salir a las parejas a temperatura ambiente (20-23 º C) durante la noche, para que a la mañana siguiente, la mayoría de los embriones se habrá recientemente fertilizado y depositado, por lo que el escote primeras etapas adecuado para la ablación. Reunir al menos 20 parejas de apareamiento para asegurar que algunas hembras se llevan embriones estadio de división temprana por la mañana siguiente. </li></ol> 3. Día 2: Reunión Parhyale embriones <ul><li> A la mañana siguiente, se filtró infundir agua de mar artificial (FASW) con CO 2. Algunas de las mujeres habrán nadado libres de sus hombres durante la noche; recoger estas mujeres separadas y anestesiar en FASW / CO 2. Los machos no apareados restantes se pueden sacar del contenedor de par de acoplamiento y se devuelven al cultivo grande. Apareamiento de pares restantes se pueden guardar para su posterior recogida de embrionesen el día o el día siguiente. </li><li> Transferir una sola hembra anestesiada llevar los embriones a un vidrio de reloj en FASW / CO 2. Todas las hembras separadas es probable que hayan depositado los huevos, que serán visibles por el ojo como de color rosa pálido o esferoides de color púrpura a través de las placas coxales transparentes de las hembras (Figura 1A). Para determinar si los embriones se encuentran en etapas tempranas de división y por lo tanto adecuado para la ablación de blastómeros, el investigador tendrá que eliminar los embriones de la bolsa de la cría y examinarlas bajo un microscopio. </li><li> Viendo el procedimiento bajo un microscopio de disección, sujete las placas coxales a lo largo de un lado del cuerpo con pinzas. Los embriones serán visibles en la bolsa ventral ventral entre estas placas coxales (fig. 1B). </li><li> Inserte la herramienta de alambre curvado delgado (Figura 3; paso 1.3 anterior) en el extremo posterior de la bolsa de la cría y levante suavemente el cable hacia el extremo anterior de la bolsa de la cría de separar a las críasrevestimientos de bolsa (éstos se modifican los apéndices ventrales llamados oostegites 30), la apertura de la bolsa y el aflojamiento de los embriones. Los embriones que se encuentran dentro de la primera hora o así de ser despedidos están todos encerrados dentro de una membrana muy delgada y transparente que fácilmente se pueden romper mediante la herramienta de alambre; esta membrana desaparece en aproximadamente 2-3 horas después de la puesta de huevos y embriones no están obligados entre sí o con la mujer de cualquier forma desde este punto en adelante toda la embriogénesis. Si los investigadores encuentran incómodo o difícil de maniobrar la herramienta de alambre curvado para eliminar los embriones de la bolsa de la cría, una alternativa implementar se puede utilizar, siempre y cuando los movimientos son suaves y sin presión dura se aplica a los embriones o la bolsa de la cría. Otras herramientas adecuadas para la eliminación de los embriones de la bolsa de la cría incluyen pinzas romas o un capilar de vidrio con un extremo sellado y alisado. </li><li> Utilice una pipeta de 15 cm inalterada Pasteur para eliminar el agua a través de la bolsa de la cría abierta, empujando hacia fuera tque los embriones, que debe depositarse en el fondo del vidrio de reloj. Traslado a la hembra para limpiar FASW (sin CO 2) para permitir la recuperación antes de su reintroducción a la cultura principal. Varias mujeres se pueden colocar en el mismo plato de recuperación, pero permiten que las mujeres se recuperen completamente antes de volver a la cultura principal, ya que pueden ser comidos por otros animales si están todavía parcialmente anestesiados. </li><li> Utilice una pipeta de 15 cm inalterada Pasteur transferir los embriones a una placa de Petri con FASW limpio, y ver bajo el microscopio para determinar su estado embrionario. Embriones separados que están en la tercera división (etapa 4 5), que son adecuados para este procedimiento. También debe ser posible aplicar este protocolo a cualquier estadio de división antes de la formación del disco germinal (etapas 7 a 8 mayo). </li></ul> 4. Día 2: La ablación de células individuales <ol><li> Rellene forradas en Sylgard placa de Petri con una capa superficial de FASW. Utilice un inalterada 15 cm pi Pasteurpipeta para transferir un único embrión a la placa. </li><li> Con unas pinzas romas, ruede suavemente el embrión para identificar la célula para extirpar (Figuras 2A y 2B). La línea germinal precursor g puede ser identificado como el micromere más pequeño, que se encuentra en la parte superior de los más pequeños Mav macrómero. Además, g no entra en contacto directamente la célula es, que es el micromere directamente a través de ella, como los micrómeros precursores mesodermo ml y cuota de mr un borde de la celda en el medio del embrión. Mr es el de blastómeros a la derecha de g, y ml es la micromere a la izquierda de g. Los macrómeros hermanas de mr, ml, y en son los precursores ectodermo Er, El y Ep respectivamente. </li><li> Con unas pinzas en la left mano si el investigador es diestro (o en la mano derecha si el investigador es zurdo), oriente el embrión con la célula de interés hacia la derecha (o hacia la izquierda si el investigador es zurdo), y agarrar suavemente el embrión entre los fórceps para estabilizarlo. </li><li> Usando una aguja tirado de vidrio (paso 1.5 anterior; Figura 4), ​​perfore suavemente la célula de interés. No inserte la aguja demasiado lejos, para no empujar la aguja en las células vecinas o por debajo de la célula de interés. La aguja sólo tiene que perforar el corion y la membrana celular subyacente, y no es necesario para extender profundamente en la célula para ser sometida a ablación. </li><li> Cambie la aguja utilizada para perforar el embrión para el final de cristal de una pipeta de boca con una fina tira de puntas de pipeta Pasteur (paso 1.4). Mantenga la punta de la pipeta cerca del agujero creado en la célula de interés, y aplicar succión muy suave. </li><li> Muy apretar suavemente el embrión con las pinzas. Como el contenido de la Blastomera es empujado fuera del corion por el agujero creado en el paso 4.4, chupan en la pipeta de boca para permitir una vista sin obstáculos del embrión. Si el agujero es lo suficientemente grande, el núcleo de la célula perforado puede ser visto a surgir también. Esta es una buena comprobación para asegurarse de que todo el contenido de la celda se han eliminado y no puede ser regenerada. </li><li> Observe cuidadosamente el embrión como se quita el blastómero de interés. El borde de la celda perforado se retroceder hacia el agujero en el corion, por lo que las intersecciones de las células subyacentes visibles. Continuar aplicando presión hasta que todo el blastómero de interés se ha eliminado. El uso de fórceps para rodar el embrión de un lado a otro y confirmar visualmente que todos los blastómeros de interés se ha ido. </li><li> El uso de un inalterada 15 cm pipeta Pasteur, transferir el embrión para limpiar FASW + (FASW + 1 mg / ml de anfotericina B, 100 unidades / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina). </li><li> Levante embriones blastómeros-ablación en pozos individualesde una placa de 48 pocillos limpia en FASW +, el cambio de 50% de FASW antibiótico-complementado + diaria. En nuestras manos embriones sobreviven y se desarrollan bien, incluso después de la ablación, en una gama de temperaturas de 18-28 º C. Los investigadores deben criar a sus embriones a una temperatura para los que tienen una superficie limpia (pero no necesariamente estéril) en el que criar a los embriones con el menor trastorno posible. Para poder comparar el calendario de eventos del desarrollo en embriones de blastómeros mediante ablación con controles, remitimos al lector a la información puesta en escena del desarrollo detallado que está disponible para los embriones planteadas a 18 º C 4, 25 º C 4, y 26 º C 5,6. </li></ol>

<ol>
	<li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3.">Chapter 3.</a> Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual Volume. , 373-404 .</li><li>Sander, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+insect+embryogenesis:+the+evolution+of+concepts+and+mechanisms.">Pattern formation in insect embryogenesis: the evolution of concepts and mechanisms.</a> Int. J.Insect Morphol. Embryol. 25, 349-367 (1997).</li><li>Regier, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthropod+relationships+revealed+by+phylogenomic+analysis+of+nuclear+protein-coding+sequences.">Arthropod relationships revealed by phylogenomic analysis of nuclear protein-coding sequences.</a> Nature. 463, 1079-1083 (2010).</li><li>Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+isolated+blastomeres+with+respect+to+germ+cell+formation+in+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">The fate of isolated blastomeres with respect to germ cell formation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 277, 387-402 (2005).</li><li>Browne, W. E., Price, A. L., Gerberding, M., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+in+the+amphipod+crustacean,+Parhyale+hawaiensis.">Stages of embryonic development in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis.</a> Genesis. 42, 124-149 (2005).</li><li>Gerberding, M., Browne, W. E., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+analysis+of+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis+reveals+an+early+restriction+of+cell+fates.">Cell lineage analysis of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis reveals an early restriction of cell fates.</a> Development. 129, 5789-5801 (2002).</li><li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+and+dissection+of+Parhyale+hawaiensis+embryos.">Fixation and dissection of Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li><li>Price, A. L., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+divergent+mechanisms+of+mesoderm+development+in+arthropods:+the+expression+of+Ph-twist+and+Ph-mef2+in+Parhyale+hawaiensis.">Investigating divergent mechanisms of mesoderm development in arthropods: the expression of Ph-twist and Ph-mef2 in Parhyale hawaiensis.</a> J. Exp. B. Dev. Evol. 310, 24-40 (2008).</li><li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+of+labeled+RNA+probes+to+fixed+Parhyale+hawaiensis+embryos.">In situ hybridization of labeled RNA probes to fixed Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li><li>Browne, W. W., Schmid, B. G. M., Wimmer, E. A., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+otd+orthologs+in+the+amphipod+crustacean,+Parhyale+hawaiensis.">Expression of otd orthologs in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Genes Evol. 216, 581-595 (2006).</li><li>Prpic, N. M., Telford, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+homothorax+and+extradenticle+mRNA+in+the+legs+of+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis:+evidence+for+a+reversal+of+gene+expression+regulation+in+the+pancrustacean+lineage.">Expression of homothorax and extradenticle mRNA in the legs of the crustacean Parhyale hawaiensis: evidence for a reversal of gene expression regulation in the pancrustacean lineage.</a> Dev. Genes Evol. 218, 333-339 (2008).</li><li>Kizil, G., Havemann, J., Gerberding, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cells+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis+depend+on+Vasa+protein+for+their+maintenance+but+not+for+their+formation.">Germ cells in the crustacean Parhyale hawaiensis depend on Vasa protein for their maintenance but not for their formation.</a> Dev. Biol. 327, 320-239 (2009).</li><li>Liubicich, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+Parhyale+Ultrabithorax+recapitulates+evolutionary+changes+in+crustacean+appendage+morphology.">Knockdown of Parhyale Ultrabithorax recapitulates evolutionary changes in crustacean appendage morphology.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13892-13896 (2009).</li><li>Pavlopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+evolution+of+appendage+specialization+by+Hox+gene+misexpression+in+an+emerging+model+crustacean.">Probing the evolution of appendage specialization by Hox gene misexpression in an emerging model crustacean.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13897-13902 (2009).</li><li>Vargas-Vila, M. A., Hannibal, R. L., Parchem, R. J., Liu, P. Z., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prominent+requirement+for+single-minded+and+the+ventral+midline+in+patterning+the+dorsoventral+axis+of+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">A prominent requirement for single-minded and the ventral midline in patterning the dorsoventral axis of the crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Development. 137, 3469-3476 (2010).</li><li>Simanton, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+arthropod+midline+netrin+accumulation+revealed+with+a+cross-reactive+antibody+provides+evidence+for+midline+cell+homology.">Conservation of arthropod midline netrin accumulation revealed with a cross-reactive antibody provides evidence for midline cell homology.</a> Evol. Dev. 11, 260-268 (2009).</li><li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+staining+of+Parhyale+hawaiensis+embryos.">Antibody staining of Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li><li>Pavlopoulos, A., Averof, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+genetic+transformation+for+comparative+developmental+studies+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">Establishing genetic transformation for comparative developmental studies in the crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7888-7893 (2005).</li><li>Kontarakis, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+strategy+for+gene+trapping+and+trap+conversion+in+emerging+model+organisms.">A versatile strategy for gene trapping and trap conversion in emerging model organisms.</a> Development. 138, 2625-2630 (2011).</li><li>Zeng, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+assembly+and+characterization+of+a+maternal+and+developmental+transcriptome+for+the+emerging+model+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">De novo assembly and characterization of a maternal and developmental transcriptome for the emerging model crustacean Parhyale hawaiensis.</a> BMC Genom. 12, 581 (2011).</li><li>Zeng, V., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASGARD:+an+open-access+database+of+annotated+transcriptomes+for+emerging+model+arthropod+species.">ASGARD: an open-access database of annotated transcriptomes for emerging model arthropod species.</a> Database. , (2012).</li><li>Nestorov, P., Battke, F., Levesque, M. P., Gerberding, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Maternal+Transcriptome+of+the+Crustacean+Parhyale+hawaiensis+Is+Inherited+Asymmetrically+to+Invariant+Cell+Lineages+of+the+Ectoderm+and+Mesoderm.">The Maternal Transcriptome of the Crustacean Parhyale hawaiensis Is Inherited Asymmetrically to Invariant Cell Lineages of the Ectoderm and Mesoderm.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li><li>Alwes, F., Hinchen, B., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+cell+lineage,+movement,+and+migration+from+germ+layer+specification+to+gastrulation+in+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">Patterns of cell lineage, movement, and migration from germ layer specification to gastrulation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 139, 110-123 (2011).</li><li>Ewen-Campen, B., Schwager, E. E., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+machinery+of+germ+line+specification.">The molecular machinery of germ line specification.</a> Mol. Reprod. Dev. 77, 3-18 (2010).</li><li>Price, A. L., Modrell, M. S., Hannibal, R. L., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesoderm+and+ectoderm+lineages+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis+display+intra-germ+layer+compensation.">Mesoderm and ectoderm lineages in the crustacean Parhyale hawaiensis display intra-germ layer compensation.</a> Dev. Biol. 341, 256-266 (2010).</li><li>Fraser, S. E., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+metamorphosis+of+experimental+embryology.">The molecular metamorphosis of experimental embryology.</a> Cell. 100, 41-55 (2000).</li><li>Olsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clash+of+traditions:+the+history+of+comparative+and+experimental+embryology+in+Sweden+as+exemplified+by+the+research+of+G&#246;sta+J&#228;gersten+and+Sven+H&#246;rstadius.">A clash of traditions: the history of comparative and experimental embryology in Sweden as exemplified by the research of G&#246;sta J&#228;gersten and Sven H&#246;rstadius.</a> Theory Biosci. 126, 117-129 (2007).</li><li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+Parhyale+hawaiensis+blastomeres+with+fluorescently+labeled+tracers.">Injection of Parhyale hawaiensis blastomeres with fluorescently labeled tracers.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li><li>Chaw, R., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+migration+of+cell+populations+in+the+early+gastrulation+of+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">Independent migration of cell populations in the early gastrulation of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 371, 94-109 (2012).</li><li>Schmitz, E. H., Harrison, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crustacea+Microscopic+Anatomy+of+Invertebrates.">Crustacea Microscopic Anatomy of Invertebrates.</a> Microscopic Anatomy of Invertebrates. 9, 443-528 (1992).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Se describe un protocolo para la ablación manual y eliminación física completa de blastómeros independientes de división etapas tempranas del anfípodo P. hawaiensis. Se demuestra el uso de este protocolo mediante la eliminación de la única línea germinal de células precursoras g de un embrión en su fase de ocho células, y demostrar que la ablación ha sido un éxito, al confirmar la ausencia de células hijas g &#39;s en la embriogénesis después. Este protocolo se...

El Parhyale hawaiensis crustáceo anfípodo ha surgido en la última década como un organismo modelo prometedor con un gran potencial para su uso en la investigación evolutiva biología del desarrollo 1. Entre los artrópodos, la mayoría de los sistemas de modelos son insectos, y las más estudiadas de ellas es la mosca de la fruta Drosophila melanogaster. D. melanogaster es un miembro de la orden de insectos Diptera, y, como tal, muestra muchas características embriológicas que se derivan con respecto a los de los insectos basalmente ramificación 2. Por otra parte, los insectos se anidan dentro del suborden Pancrustacea 3, lo que significa que los insectos tienen sus parientes más cercanos en el grupo desde hace mucho tiempo &quot;natural&quot; llamados pancrustaceans, y que este grupo es parafilético. Esto sugiere que además de ramificaciones basales modelos de insectos, se requieren estudios de otros crustáceos de obtener una visión más amplia del historia de la evolución de los rasgos del desarrollo de unamecanismos moleculares nd que han sido tan bien estudiados en D. melanogaster. Sin embargo, son muy pocos los crustáceos han sido bien establecidos para el análisis de laboratorio experimental de desarrollo. El anfípodo P. hawaiensis es un sistema de modelo de laboratorio altamente manejable, susceptible de una serie de técnicas experimentales. Anfípodos muestran muchas características únicas dentro de su superorder padre Peracarida (tolvas de playa, scuds, y camarones así), y por lo tanto se cree que están relativamente derivada dentro de este grupo de crustáceos. Sin embargo, la relativa facilidad de la manipulación genética embriológico y funcional que ofrece Parhyale hacen de este anfípodo una valiosa adición al inventario actual de organismos modelo. Como un animal de laboratorio, P. hawaiensis ofrece muchas ventajas. Los animales son tolerantes a una amplia gama de temperaturas y salinidades, y sobreviven bien en grandes cultivos de agua de mar artificial 1. Es fácil distinguir entrmachos y hembras een basadas en las diferencias morfológicas claras, sobre todo, los grandes en forma de gancho, el tronco, los apéndices anteriores que los machos usan para agarrar a la hembra durante el apareamiento. Para el trabajo y de desarrollo embriológico, P. hawaiensis tiene varias características muy atractivas. La embriogénesis dura aproximadamente 10 días y el tiempo hasta la madurez sexual es de aproximadamente seis semanas a 28 º C (pero tenga en cuenta que Parhyale sobrevive bien a temperaturas que van desde aproximadamente 20 a 30 º C, y que la informacion de puesta en escena de desarrollo está disponible para los embriones planteadas a 18 º C 4 , 25 º C 4, y 26 º C 5,6). Los adultos se aparean durante todo el año en el laboratorio, por lo que los embriones están disponibles en cualquier momento del año. Las hembras ponen 2-20 (dependiendo de la edad de las mujeres) huevos fertilizados en una bolsa de la cría ventral situado entre los primeros pares de patas (Figuras 1A y 1B), y es posible reunir estos embrións muy temprano en el desarrollo sin matar a la hembra o dañar los embriones (Figura 1C). Los embriones sobreviven en agua de mar artificial se filtra a través de la eclosión, se pueden fijar para la expresión génica o posterior análisis histológico 7, y una tabla de ensayo detallado permite la identificación precisa de los avances a través del desarrollo 5. Protocolos robustos se han utilizado para realizar el análisis de la expresión génica mediante hibridación in situ 8-15 o inmunotinción 4,16,17, desmontables funcional mediante ARN de interferencia 13,15 o morfolinos 12, y la línea germinal estable transgénesis 18. Usando el sistema de la transgénesis, la expresión inducible 14 y potenciador trampa 19 métodos también pueden utilizarse para investigar la función de genes en P. hawaiensis. Mientras que una secuencia del genoma a disposición del público no está disponible actualmente, un transcriptoma contiene transcripciones producido durante la ovogénesis y embriogénesis tiene abejan de novo montado y anotado 20, y depositado en una base de datos 21, facilitando el descubrimiento de genes. En suma, P. hawaiensis es un organismo modelo muy manejable adecuada para múltiples enfoques experimentales y genéticos para entender el desarrollo. A diferencia de las primeras divisiones sincitiales de D. melanogaster, P. embriones hawaiensis escinden holoblastically después de la fertilización (Figura 2A). Linaje análisis de rastreo ha demostrado que por tercera división, cada uno de los tercero blastómeros de escisión está destinado específicamente para dar lugar a una de las tres capas germinales o la línea germinal 6 (Figura 2B). Estos datos, junto con los datos de microarrays 22, linaje de células análisis 6,23, y los experimentos de aislamiento blastómeras 4 han sugerido que los potenciales de desarrollo son segregados por lo menos a algunos terceros blastómeras la escisión por la herencia asimétrica de cell determinantes destino. En consecuencia, en los experimentos de ablación de blastómeros en el que se eliminó el precursor de línea germinal (denominado &quot;g&quot; en la Parhyale linaje de células nomenclatura 6) en la etapa de ocho células, embriones carecían de células germinales en las etapas de desarrollo posteriores 4, como se indica por la ausencia de células que expresa la proteína Vasa, que es un marcador de la línea germinal en la mayoría de los metazoos 24. En contraste, los experimentos de ablación de blastómeros somáticas mostraron que P. embriones hawaiensis también poseen capacidades reguladoras importantes, que los destinos de mesodermo o ectodermo blastómeras precursoras ablación en la fase de ocho células pueden ser asumidas por los descendientes de algunos de los blastómeros restantes de 25. ¿Cómo puede ocurrir la sustitución del destino celular regulativo, y el grado de autonomía de adopción por el destino de las células somáticas blastómeras, sigue siendo desconocido. Técnicas embriológicas experimentales tales como la ablación de blastómeros pueden ser útiles en understanding la autonomía relativa y nonautonomy de las decisiones del destino celular 26,27 y por lo tanto son de interés en el estudio de P. embriogénesis hawaiensis. En los experimentos que demostraron reemplazo regulativa de ectodermo y mesodermo linajes, la ablación de blastómeros se realizó mediante inyección 28 y la posterior excitación de tintes fototóxicas 25. Si bien esta técnica es eficaz en matar el blastómero (s) se inyecta, no elimina completamente el cuerpo de células muertas del embrión. Además, se han observado diferencias entre los datos recogidos a través del linaje de células de las etapas de la embriogénesis gastrulación inyectando blastómeras con trazadores fluorescentes linaje 28,29, y los datos recogidos siguiendo blastómeras no perturbadas por medio del desarrollo de las mismas etapas embrionarias 23. Eliminación física completa de blastómeros específicos puede por lo tanto ser un método preferido de la ablación para algunas aplicaciones. Hemos publicado anteriormente los resultados de los análisis de linaje de células de embriones en los que las células individuales se ablated manualmente 23. Sin embargo, las operaciones delicadas requeridas para eliminar blastómeros individuales a partir de embriones de etapa de escisión primeros aún no se han descrito completamente. Aquí se presenta un protocolo para la recolección de P. embriones hawaiensis y ablación manual de una sola blastómeros de un embrión en su fase de ocho células. El objetivo de este método es para lograr la eliminación completa del cuerpo de la célula del embrión, lo que permite la observación de los comportamientos celulares y competencias destino celular de las células restantes durante la embriogénesis y el desarrollo de post-embrionario. Nuestro protocolo muestra la eliminación del precursor g línea germinal (Figura 2C), pero se puede aplicar a cualquier célula en la fase de ocho células, o para blastómeros de etapas de escisión anteriores. En principio, este protocolo se podría aplicar para eliminar las células individuales a partir de embriones en estadio de división primeros de Other escindir holoblastically invertebrados marinos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1060">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">15 cm Pasteur pipette</td>
			<td style="width:164px;">Wheaton</td>
			<td style="width:123px;">53499-630</td>
			<td style="width:495px;">For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">22 cm Pasteur pipette</td>
			<td style="width:164px;">Wheaton</td>
			<td style="width:123px;">53499-632</td>
			<td style="width:495px;">For making mouth pipette tips. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">3 cm petri dishes</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">25382-334</td>
			<td style="width:495px;">Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">48-well plates</td>
			<td style="width:164px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:123px;">82051-004</td>
			<td style="width:495px;">For culturing embryos following ablation. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Bottle top filters 0.2 micron</td>
			<td style="width:164px;">Nalge Nunc International</td>
			<td style="width:123px;">28199-296</td>
			<td style="width:495px;">For creating FASW (See below) 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Bunsen burner</td>
			<td style="width:164px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">89038-530</td>
			<td style="width:495px;">For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Diamond scribe</td>
			<td style="width:164px;">Musco Sports Lighting</td>
			<td style="width:123px;">52865-005</td>
			<td style="width:495px;">For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:164px;">Forceps</td>
			<td style="width:164px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">11050-10</td>
			<td style="width:495px;">For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps - the tips can be at least as blunt as that in the forceps for which the catalogue number is listed here. 
			Fine Science Tools</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Fungizone-Amphotericin B</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">A2942</td>
			<td style="width:495px;">Add to FASW to a final concentration of 1mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. 
			Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Glass capillaries 4 inches long, 1/0.58 OD/ID (mm)</td>
			<td style="width:164px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:123px;">1B100-4</td>
			<td style="width:495px;">need to include glass capillary and needle puller machine? 
			World Precision Instruments</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Glass watchglass 300 mm diameter</td>
			<td style="width:164px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">70543-30</td>
			<td style="width:495px;">For use in removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. 
			Electron Microscopy Sciences</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW)</td>
			<td style="width:164px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:123px;">IS160</td>
			<td style="width:495px;">Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of X. 
			Aquatic EcoSystems</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW)</td>
			<td style="width:164px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:123px;">IS160</td>
			<td style="width:495px;">Use 0.2 micron filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (&#60; 250 ml) as needed. 
			Aquatic EcoSystems</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:164px;">Kimberly-Clark</td>
			<td style="width:123px;">21905-026</td>
			<td style="width:495px;">For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Mouth pipette adaptor</td>
			<td style="width:164px;">Drummond Labware</td>
			<td style="width:123px;">A5177-5EA</td>
			<td style="width:495px;">Insert the fine pulled pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure. 
			Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Mouth pipette tubing</td>
			<td style="width:164px;">Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">Z280356</td>
			<td style="width:495px;">Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure. 
			Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Needle Puller</td>
			<td style="width:164px;">Sutter Instrument Company</td>
			<td style="width:123px;">P97</td>
			<td style="width:495px;">For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated. 
			Sutter Instrument Company</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td style="width:164px;">Mediatech</td>
			<td style="width:123px;">45000-650</td>
			<td style="width:495px;">Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Rubber bulb</td>
			<td style="width:164px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">100488-418</td>
			<td style="width:495px;">For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Sylgard 184</td>
			<td style="width:164px;">K. R. Anderson, Inc.</td>
			<td style="width:123px;">NC9659604</td>
			<td style="width:495px;">Make up according to manufacturer&#39;s instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations. 
			Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Tungsten wire 0.004 inches diameter</td>
			<td style="width:164px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:123px;">719000</td>
			<td style="width:495px;">Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. 
			A-M Systems</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ablation of a single cell from eight-cell embryos of the amphipod crustacean parhyale hawaiensis

El hawaiensis anfípodo Parhyale es un pequeño crustáceo que se encuentra en los hábitats marinos intermareales de todo el mundo. Durante la última década, Parhyale ha convertido en un organismo modelo prometedor para los estudios de laboratorio de desarrollo, proporcionando una comparación exogrupo útil al organismo bien estudiado modelo artrópodo Drosophila melanogaster. En contraste con las divisiones sincitiales de Drosophila, las primeras divisiones de Parhyale son holoblástica. Suerte de cartografía utilizando colorantes trazadores inyectados en primeros blastómeros han demostrado que las tres capas germinales y la línea germinal se establecen por la etapa de ocho células. En esta etapa, tres blastómeras están destinados a dar lugar a el ectodermo, tres están destinados a dar lugar al mesodermo, y los dos restantes blastómeros son los precursores de la línea de endodermo y el germen respectivamente. Sin embargo, los experimentos de ablación de blastómeros han demostrado que los embriones Parhyale también poseen capabiliti reglamentaria significativaes, de tal manera que el destino de los blastómeros ablación en la fase de ocho células pueden ser asumidas por los descendientes de algunos de los blastómeros restantes. La ablación de blastómeros ha sido previamente descrito por uno de dos métodos: la inyección y la posterior activación de colorantes fototóxicas o ablación manual. Sin embargo, fotoablación mata blastómeros, pero no elimina el cuerpo de células muertas del embrión. Eliminación física completa de blastómeros específicos puede por lo tanto ser un método preferido de la ablación para algunas aplicaciones. Aquí se presenta un protocolo para la extracción manual de blastómeros independientes, desde la fase de ocho células de embriones Parhyale, ilustrando los instrumentos y procedimientos manuales necesarias para la eliminación completa del cuerpo de la célula, manteniendo las restantes blastómeros vivo e intacto. Este protocolo se puede aplicar a cualquier célula Parhyale en la fase de ocho células, o para blastómeros de otras etapas de escisión temprana. Además, en principio, este protocolo podría ser aplicable a CLEA tempranaVåge embriones de otros invertebrados marinos holoblastically escisión.

Después de la ablación con éxito del single tercera hendidura P. micrómeros hawaiensis como se describe en este protocolo, los micrómeros restantes cambian gradualmente sus posiciones ligeramente con el fin de ocupar parcialmente el espacio anteriormente ocupado por la ablación de blastómeros. Por ejemplo, cuando se elimina g, la vecina blastómeras MR y ML cambiar ligeramente y llegar a compartir los bordes de las celdas laterales que antes estaban en contacto ...

Watch this Scientific Journal Video about Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis at JoVE.com

Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

El hawaiensis anfípodo Parhyale es un organismo modelo prometedor para los estudios de embriología y desarrollo de artrópodos crustáceos comparativa y evolución. Este protocolo describe un método para la extracción manual de blastómeros individuales a partir de embriones en estadio de división primeros de Parhyale.

Ablación de una sola célula de ocho células de embriones de los crustáceos anfípodos<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

The amphipod Parhyale hawaiensis is a small crustacean found in intertidal marine habitats worldwide. Over the past decade, Parhyale has emerged as a ...

ablation-single-cell-from-eight-cell-embryos-amphipod-crustacean

Research

JoVE Journal

Biology

Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

12.5K vistas.  Harvard University.  El hawaiensis anfípodo Parhyale es un organismo modelo prometedor para los estudios de embriología y desarrollo de artrópodos crustáceos comparativa y evolución. Este protocolo describe un método para la extracción manual de blastómeros individuales a partir de embriones en estadio de división primeros de Parhyale. 

Video: Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

La disección del Organizador y explantes Animal Polo de Xenopus laevis embriones y de la Asamblea de un ensayo de adhesión celular

Investigación

Biología

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Preparación de cultivos neuronales a partir de embriones de Drosophila Midgastrula Etapa

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual dissociations the gentleMACS Dissociator allows one to dissociate tissue very efficiently under controlled and reproducible conditions.  The gentleMACS Dissociator can optimally dissociate mouse spleen, combining timesaving and standardization with user-safety.

This video describes how to dissociate mouse spleens using the gentleMACS Dissociator, an automated bench-top device that can mechanically disrupt tissues using special tubes to produce viable cell suspensions. Following dissociation, spleens are filtered, centrifuged, and resuspended for further applications.

This video describes a simple, time-saving technique for automated tissue dissociation using the gentleMACS Dissociator to prepare single-cell suspensions of mouse splenocytes.

Preparación de una sola célula suspensiones de bazo de ratón con el disociador gentleMACS

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Single Cell Transfection in Chick Embryos

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a thorough analysis of the fates of single cells under normal and experimental conditions. To this end, transfection methods that target single progenitors are a prerequisite. We describe here a technically straightforward method for transfecting single cells in chicken tissues in-ovo, allowing reliable lineage tracing as well as genetic manipulation. Specific tissue domains are targeted within the somite or neural tube, and DNA is injected directly into the epithelium of interest, resulting in sporadic transfection of single cells. Using reporters, clonal populations may consequently be traced for up to three days, and behavior of genetically manipulated clonal populations can be compared with that of controls. This method takes advantage of the accessibility of the chick embryo along with emerging tools for genetic manipulation. We compare and discuss its advantages over the widely-used electroporation method, and possible applications and use in additional in-vivo models are also suggested. We advocate the use of this method as a significant addition and complement for existing lineage tracing and genetic interference tools.

Using fine tip micropipettes we inject plasmid DNA into subdomains of chicken somites or neural tubes. The concentration of the plasmid is adjusted to generate single transfected cells. We then allow the cells to develop into clonal populations.

Transfección de células individuales en embriones de pollo

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Cultivos de células primarias de Drosophila Gástrula embriones

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

La ablación con láser de la pronefros pez cebra para el Estudio de la regeneración epitelial renal

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Aislamiento y purificación de Kinesin desde Drosophila Los embriones

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

We describe here how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells, and provide some useful tips. We expect that this paper will help everyone to evaluate the degree of cellular coupling due to functional gap junctions. Everything described here could be, in principle, adapted to other fluorescent dyes with molecular weight below 1,000 Daltons.

La microinyección de una sola célula de Análisis de Comunicación Móvil

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a critical yet enigmatic biological event that has been historically difficult to study due to technical and ethical limitations. Implantation is initiated by the development of the trophectoderm to early trophoblast and subsequent differentiation into distinct trophoblast sublineages. Aberrant early trophoblast differentiation may lead to implantation failure, placental pathologies, fetal abnormalities, and miscarriage. Recently, methods have been developed to allow human embryos to grow until day 13 post-fertilization in vitro in the absence of maternal tissues, a time-period that encompasses the implantation period in humans. This has given researchers the opportunity to investigate human implantation and recapitulate the dynamics of trophoblast differentiation during this critical period without confounding maternal influences and avoiding inherent obstacles to study early embryo differentiation events in vivo. To characterize different trophoblast sublineages during implantation, we have adopted existing two-dimensional (2D) extended culture methods and developed a procedure to enzymatically digest and isolate different types of trophoblast cells for downstream assays. Embryos cultured in 2D conditions have a relatively flattened morphology and may be suboptimal in modeling in vivo three-dimensional (3D) embryonic architectures. However, trophoblast differentiation seems to be less affected as demonstrated by anticipated morphology and gene expression changes over the course of extended culture. Different trophoblast sublineages, including cytotrophoblast, syncytiotrophoblast and migratory trophoblast can be separated by size, location, and temporal emergence, and used for further characterization or experimentation. Investigation of these early trophoblast cells may be instrumental in understanding human implantation, treating common placental pathologies, and mitigating the incidence of pregnancy loss.

Here, we describe a method for warming vitrified human blastocysts, culturing them through the implantation period in vitro, digesting them into single cells and collecting early trophoblast cells for further investigation.

Colección de células únicas de células trofoblastas en embriones humanos en fase de implantación

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a ...

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen infection or challenge with pathogen-associated chemicals (pathogen-associated molecular patterns [PAMPs]), an array of immune responses, including a ROS burst, are quickly induced in plants, which is called PAMP-triggered immunity (PTI). A ROS burst is a hallmark PTI response, which is catalyzed by a group of plasma membrane-localized NADPH oxidases-the RBOH family proteins. The vast majority of ROS comprise hydrogen peroxide (H2O2), which can be easily and steadily detected by a luminol-based chemiluminescence method. Chemiluminescence is a photon-producing reaction in which luminol, or its derivative (such as L-012), undergoes a redox reaction with ROS under the action of a catalyst. This paper describes an optimized L-012-based chemiluminescence method to detect apoplast ROS production in real-time upon PAMP elicitation in rice tissues. The method is easy, steady, standardized, and highly reproducible under firmly controlled conditions.

Here, we describe a method for the real-time detection of apoplastic reactive oxygen species (ROS) production in rice tissues in pathogen-associated molecular pattern-triggered immune response. This method is simple, standardized, and generates highly reproducible results under controlled conditions.

Detección en tiempo real de la producción reactiva de especies de oxígeno en la respuesta inmune en el arroz con un ensayo de quimioluminiscencia

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...

Ablación de una sola célula de ocho células de embriones de los crustáceos anfípodos

Resumen

Explorar más videos

Capítulos en este video