Ringraziamo Rayhan Arif e Hassaan Shahawy per il lavoro della macchina fotografica, Tripti Gupta e Frederike Alwes per l&#39;assistenza affinando la tecnica di ablazione delle cellule, e membri del laboratorio Extavour per il feedback sui dati, video e manoscritto. Questo lavoro è stato in parte sostenuto dalla Harvard Stem Cell Institute (Seed numero di Grant SG-0057-10-00) Ellison Medical Foundation (New Scholar Award numero AG-NS-07010-10) alla CGE, e premi Harvard programma del college di ricerca per ARN.

Commenti che possono essere utili in esecuzione di alcuni passaggi sono indicati in corsivo. 1. Giorno 1: Preparazione dei Materiali <ol><li> Preparare i seguenti materiali (cfr. tabella dei Materiali e attrezzature): <ul><li> 15 cm e 22 cm pipette Pasteur </li><li> Diamante scriba </li><li> acqua di mare artificiale filtrata (salinità tra 0,0018-0,0020) contenente 1 mg / ml di amfotericina B (1:100 di una soluzione madre di 100 mg / ml), 100 unità / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina (1:50 di una soluzione madre contenente 5.000 unità / ml di penicillina e 5.000 mg / ml di streptomicina) </li><li> filtrata acqua di mare artificiale (salinità tra 0,0018-0,0020) senza additivi </li><li> un grande contenitore di plastica per le coppie abitative (di almeno 15 cm x 15 cm x 5 cm) </li><li> di piccole dimensioni (3 cm o 5 centimetri) piastre Petri rivestite con Sylgard </li><li> di piccole dimensioni (3 cm o 5 centimetri) piastre di Petri </li><li> un vetro d&#39;orologio o lastra di vetro multi-bene </li><li> Pinza (usiamo una pinza smussato derivati ​​from vecchio Dumont # 5 pinze accidentalmente danneggiati in altre procedure di laboratorio, che abbiamo riproposto utilizzando una pinza pietra per affilare ad assicurare che le estremità della pinza sono lisce, che entrambi i denti sono della stessa lunghezza, e che non hanno più punti taglienti. Pinza estremamente sottili, come i nuovi Dumont # 5 pinze, sono indesiderabili in quanto possono danneggiare gli embrioni e / o femmine). </li><li> una pipetta Pasteur con l&#39;estremità allargata (vedi punto 1.2) </li><li> uno strumento di recupero embrione costituito da un sottile filo di tungsteno curvo incorporato nella estremità sottile di una pipetta Pasteur (potrebbe essere sostituito da un&#39;alternativa attuare; vedere 1.3) </li><li> una pipetta bocca con una piccola apertura (vedi punto 1.4) </li><li> un ago di vetro fatto da un capillare di vetro tirato (vedi punto 1.5 che segue) </li></ul> Non ci sono materiali tossici per gli esseri umani sono utilizzati in questo protocollo. Tuttavia, i ricercatori dovrebbero assicurare che indossano guanti o altri indumenti protettivi, come richiesto dal guidel gestione del rischioines della loro istituzione. </li><li> Per rendere la pipetta Pasteur allargato, primo punteggio intorno una pipetta Pasteur 15 centimetri nel punto in cui la pipetta comincia a ridursi con un scribe diamante, avvolgere la regione segnato della pipetta in un asciugamano Kimwipe o carta per proteggere le dita, e poi accuratamente rompere la punta alla linea di frattura. Tenere l&#39;estremità rotto della pipetta su una fiamma del bruciatore Bunsen per alcuni secondi per smussare i bordi. L&#39;apertura dovrebbe essere leggermente più stretta della larghezza massima della pipetta. </li><li> Per rendere lo strumento di dissezione filo di tungsteno, inserire un filo di tungsteno nell&#39;estremità di un 15 centimetri pipetta Pasteur di vetro, premuto brevemente su un becco Bunsen per fondere il vetro, che fissa il filo in posizione. Usare pinze per curva dolcemente alla fine del filo a forma di uncino. Vedi Figura 3 per un esempio di una forma appropriata per questo strumento. </li><li> Per fare una piccola apertura per la pipetta bocca, tirare l&#39;estremità sottile di un 22 centimetri pipetta Pasteur in due parti over una fiamma, e rompere la punta del piede di biella. Inserire nell&#39;estremità del titolare pipetta bocca. </li><li> Effettuare l&#39;ago di vetro che verrà utilizzato per perforare i blastomeri di interesse durante la procedura di ablazione mediante estrattore ago. Un ago opportunamente sagomato è mostrato in Figura 4. Questo ago è stato tirato su un estrattore Sutter P97 ago utilizzando un programma con i parametri 2x (calore = 566, tirare = 100, velocità = 20 time = 250) + 1X (calore = 566, tirare = 100, velocità = 100, tempo = 250). Il programma e specifico strumento usato per fare l&#39;ago può variare, ma l&#39;ago deve avere un punto di fine, ma anche essere abbastanza robusto da non rompersi quando spinto contro il corion dell&#39;embrione. </li></ol> 2. 1 ° giorno: Coppie Gathering Parhyale affini <ol><li> Utilizzare la pipetta Pasteur ampliato (fase 1.2 di cui sopra) per raccogliere accoppiamento P. coppie hawaiensis dal grande contenitore di coltura, e trasferirli in un contenitore contenente separato cmagra acqua di mare artificiale. Non è necessario che questa acqua di mare filtrata. E &#39;meglio raccogliere le coppie di accoppiamento nel tardo pomeriggio e lasciare le coppie a temperatura ambiente (20-23 ° C) durante la notte, in modo che la mattina dopo, la maggior parte degli embrioni sono stati recentemente fecondato e depositato, e quindi a presto scissione fasi adatto per ablazione. Raccogliere almeno 20 coppie di accoppiamento per garantire che alcune femmine saranno portando primi scissione embrioni stadio la mattina seguente. </li></ol> 3. 2 ° giorno: Raduno Parhyale embrioni <ul><li> La mattina successiva, infondere acqua di mare artificiale filtrata (FASW) con CO 2. Alcune delle femmine avranno nuotato liberi dai loro maschi durante la notte; raccogliere queste femmine separati e anestetizzare in FASW / CO 2. I restanti maschi spaiati possono essere rimossi dal contenitore coppia di accoppiamento e restituito al grande cultura. Coppie di accoppiamento rimanenti possono essere salvati per la raccolta di embrioni tardinel corso della giornata o il giorno successivo. </li><li> Trasferire una singola femmina anestetizzato portando embrioni per un vetro da orologio in FASW / CO 2. Tutte le femmine separate probabilmente hanno depositato le uova, che sarà visibile ad occhio il rosa pallido o sferoidi viola attraverso le piastre coxal trasparenti delle femmine (Figura 1A). Per determinare se gli embrioni sono nelle fasi iniziali scissione e quindi adatto per blastomeri ablazione, il ricercatore dovrà rimuovere gli embrioni dal sacchetto covata ed esaminarli al microscopio. </li><li> Visualizzazione della procedura sotto un microscopio da dissezione, afferrare i piatti coxal lungo un lato del corpo con una pinza. Gli embrioni saranno visibili nel sacchetto covata ventrale tra questi piatti coxal (Figura 1B). </li><li> Inserire il sottile, strumento filo curvo (figura 3; precedente punto 1.3) nell&#39;estremità posteriore del sacchetto covata, e sollevare delicatamente il filo verso l&#39;estremità anteriore del sacchetto covata per separare la covatarivestimenti sacchetto (questi sono modificati appendici ventrali chiamati oostegites 30), aprendo il sacchetto ed allentando gli embrioni. Gli embrioni che si trovano entro la prima ora o così di essere licenziati sono tutti racchiusi all&#39;interno di una sottile membrana trasparente che sarà facilmente interrotto dallo strumento a filo; questa membrana scompare di circa 2-3 ore dopo la deposizione delle uova e gli embrioni non sono vincolati tra loro o alla femmina in alcun modo da questo punto in poi tutta l&#39;embriogenesi. Se i ricercatori trovano scomodo o difficile da manovrare l&#39;utensile filo curvo per rimuovere embrioni dal sacchetto covata, un&#39;alternativa implementare può essere utilizzato, purché i movimenti sono delicati e nessuna pressione duro viene applicato al embrioni o il sacchetto covata. Altri strumenti adeguati per rimuovere gli embrioni dal sacchetto covata includono pinze smussate o un capillare di vetro con un&#39;estremità sigillata e levigato. </li><li> Utilizzare un inalterata 15 centimetri pipetta Pasteur per svuotare l&#39;acqua attraverso il sacchetto covata aperta, spingendo fuori tegli embrioni, che dovrebbe depositarsi sul fondo del vetro da orologio. Trasferire la femmina per pulire FASW (senza CO 2) per permettere il recupero prima di reintrodurre lei alla cultura principale. Più femmine possono essere collocati nello stesso piatto di recupero, ma le femmine permettono di recuperare completamente prima di restituirli alla cultura principale, in quanto possono essere mangiati da altri animali se sono ancora parzialmente anestetizzati. </li><li> Utilizzare un inalterata 15 centimetri pipetta Pasteur per trasferire gli embrioni in una capsula di Petri con FASW pulito, e visualizzare al microscopio per determinare la loro fase embrionale. Embrioni distinti che sono alla terza fenditura (fase 4 5), che sono adatti per questa procedura. Dovrebbe inoltre essere possibile applicare questo protocollo per ogni fase scissione prima della formazione del disco di germi (stadi 7-8 MAGGIO). </li></ul> 4. 2 ° giorno: ablazione di singole cellule <ol><li> Riempire piastra di Petri Sylgard alberato con uno strato di FASW superficiale. Utilizzare un inalterata 15 centimetri Pasteur pipipetta per trasferire un singolo embrione alla piastra. </li><li> Utilizzando pinze smussato, inclinarsi leggermente l&#39;embrione per identificare la cella da asportare (Figure 2A e 2B). La linea germinale precursore g può essere identificato come il micromere più piccolo, che si trova sulla cima della più piccola Mav macromere. Inoltre, g non contattare direttamente la cellula en, che è il micromere direttamente di fronte, come le ml micromeri mesoderma precursori e la quota di mr margine di una cella nel centro dell&#39;embrione. Mr è il blastomere a destra di g, e ml è il micromere a fianco di g. Le macromeres sorella di mr, ml, e en sono i precursori ectoderma Er, El, e Ep, rispettivamente. </li><li> Con una pinza in left mano se il ricercatore è di mano destra (o la mano destra se il ricercatore è mancino), orientare l&#39;embrione con la cella di interesse a destra (oa sinistra se il ricercatore è mancino), e afferrare delicatamente l&#39;embrione tra le pinze per stabilizzarlo. </li><li> Utilizzando un ago tirato vetro (passo 1.5 sopra; la figura 4), ​​forare delicatamente la cella di interesse. Non inserire l&#39;ago troppo, in modo da non spingere l&#39;ago nelle celle vicine o sotto la cella di interesse. L&#39;ago ha solo per forare la membrana cellulare e corion sottostante, e non deve estendersi profondamente nella cella da asportare. </li><li> Sostituire l&#39;ago utilizzato per forare l&#39;embrione per la fine del vetro di una pipetta bocca con una bella tirata Pasteur puntale (precedente punto 1.4). Tenere la punta della pipetta vicino al foro creato nella cella di interesse, e applicare molto delicata aspirazione. </li><li> Molto premere delicatamente l&#39;embrione con le pinze. Dato che il contenuto del blastomera viene spinto fuori dal corion attraverso il foro creato nel passaggio 4.4, succhiare in pipetta bocca per consentire una visuale libera dell&#39;embrione. Se il foro è abbastanza grande, il nucleo della cellula perforato può essere visto emergere pure. Questo è un buon controllo per assicurarsi che tutto il contenuto della cella sono state rimosse e non possono essere rigenerata. </li><li> Osservare attentamente l&#39;embrione come blastomere di interesse viene rimosso. Il bordo della cella forato retrocederà verso il foro del corion, rendendo l&#39;intersezione delle celle sottostanti visibili. Continuare ad applicare la pressione fino a quando tutti blastomero di interesse è stato rimosso. Utilizzare pinze a rotolare l&#39;embrione da un lato all&#39;altro e confermare visivamente che tutto il blastomero di interesse è andato. </li><li> Utilizzando un inalterata 15 centimetri pipetta Pasteur, trasferire l&#39;embrione pulire FASW + (FASW + 1 mg / ml di amfotericina B, 100 unità / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina). </li><li> Sollevare embrioni blastomeri-ablazione a singoli pozzidi una piastra a 48 pozzetti pulita in FASW +, cambiando il 50% di antibiotico-FASW integrato + giornaliero. Nelle nostre mani embrioni sopravvivere e svilupparsi bene, anche a seguito di ablazione, in una gamma di temperature di 18-28 ° C. I ricercatori dovrebbero aumentare i loro embrioni a una temperatura per la quale hanno una superficie pulita (ma non necessariamente sterile) sul quale generare gli embrioni con il minimo disturbo. Per poter confrontare i tempi degli eventi di sviluppo in embrioni blastomeri-ablazione con controlli, rimandiamo il lettore alle informazioni dettagliate messa in scena dello sviluppo che è disponibile per gli embrioni sollevate a 18 º C 4, 25 º C 4, e 26 º C 5,6. </li></ol>

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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+Parhyale+hawaiensis+blastomeres+with+fluorescently+labeled+tracers.">Injection of Parhyale hawaiensis blastomeres with fluorescently labeled tracers.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li><li>Chaw, R., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+migration+of+cell+populations+in+the+early+gastrulation+of+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">Independent migration of cell populations in the early gastrulation of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 371, 94-109 (2012).</li><li>Schmitz, E. H., Harrison, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crustacea+Microscopic+Anatomy+of+Invertebrates.">Crustacea Microscopic Anatomy of Invertebrates.</a> Microscopic Anatomy of Invertebrates. 9, 443-528 (1992).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Descriviamo un protocollo per l&#39;ablazione manuale e rimozione fisica completa di singoli blastomeri dalle fasi iniziali della scissione del anfipode P. hawaiensis. Dimostriamo l&#39;uso di questo protocollo rimuovendo la singola linea germinale cellula precursore g da una fase embrionale di otto cellule, e dimostrare che l&#39;ablazione ha avuto successo, confermando l&#39;assenza di s &#39;g cellule figlie in embriogenesi più tardi. Questo protocollo può essere utilizzat...

Il Parhyale hawaiensis anfipode crostaceo è emerso negli ultimi dieci anni come organismo modello promettente con un grande potenziale per l&#39;uso in biologia dello sviluppo evolutivo di ricerca 1. Tra gli artropodi, la maggior parte dei sistemi modello sono insetti, e il più ampiamente studiati di questi è il moscerino della frutta Drosophila melanogaster. D. melanogaster è un membro dell&#39;ordine dei Ditteri insetti, e come tale visualizza molte caratteristiche embrionali derivate rispetto a quelli degli insetti basally ramificazione 2. Inoltre, gli insetti sono annidati all&#39;interno del subphylum Pancrustacea 3, il che significa che gli insetti hanno i loro parenti più stretti all&#39;interno del gruppo di lunga data &quot;naturale&quot; chiamato pancrustaceans, e che questo gruppo è parafiletico. Ciò suggerisce che oltre alla ramificazione basally modelli insetti, studi di altri crostacei sono necessari per ottenere una visione più ampia della storia evolutiva dei tratti di sviluppo unmeccanismi molecolari nd che sono stati così ben studiate in D. melanogaster. Tuttavia, poche crostacei sono stati ben stabiliti per analisi di laboratorio sperimentale di sviluppo. Il anfipode P. hawaiensis è altamente trattabile sistema modello di laboratorio, suscettibili di una serie di tecniche sperimentali. Anfipodi mostrano molte caratteristiche uniche nel loro superorder genitori Peracarida (tramogge spiaggia, scudi, e gamberetti così), e sono quindi pensati per essere relativamente derivato all&#39;interno di questo gruppo di crostacei. Tuttavia, la relativa facilità di manipolazione genetica embrionale e funzionale offerto da Parhyale rendono questo anfipode una preziosa aggiunta alla corrente inventario di organismi modello. Come un animale da laboratorio, P. hawaiensis offre molti vantaggi. Gli animali sono tolleranti ad una vasta gamma di temperature e salinità, e sopravvivono bene in grandi culture di acqua di mare artificiale 1. E &#39;facile distinguere between maschi e femmine sulla base di differenze morfologiche evidenti, più in particolare, i grandi, uncinate, appendici tronco anteriori che i maschi usano per afferrare le femmine durante l&#39;accoppiamento. Per il lavoro embrionale e dello sviluppo, P. hawaiensis ha diverse caratteristiche molto interessanti. Embriogenesi dura circa 10 giorni e il tempo per la maturità sessuale è di circa sei settimane a 28 ° C (ma si noti che Parhyale sopravvive bene a temperature che variano da circa il 20-30 º C, e che informazioni dettagliate messa in scena dello sviluppo è disponibile per gli embrioni sollevate a 18 º C 4 , 25 ° C 4, e 26 ° C 5,6). Adulti si accoppiano tutto l&#39;anno in laboratorio, in modo da embrioni sono disponibili in qualsiasi periodo dell&#39;anno. Le femmine depongono 2-20 (a seconda dell&#39;età delle donne) uova fecondate in un sacchetto covata ventrale che si trova tra le prime paia di zampe (Figure 1A e 1B), ed è possibile raccogliere questi embrionis molto presto nello sviluppo senza uccidere la femmina o danneggiare gli embrioni (Figura 1C). Gli embrioni sopravvivono in acqua di mare artificiale filtrata fino alla schiusa, possono essere fissati per l&#39;espressione genica o successiva analisi istologica 7, e una tabella dettagliata di gestione temporanea permette l&#39;identificazione precisa dei progressi attraverso lo sviluppo 5. Protocolli robusti sono stati utilizzati per effettuare analisi di espressione genica mediante ibridazione in situ 8-15 o immunoistochimica 4,16,17, knockdown funzionale mediante RNA interference 13,15 o Morpholinos 12, e la linea germinale stabile transgenesi 18. Utilizzando il sistema di transgenesi, espressione inducibile 14 e trappola enhancer 19 metodi possono anche essere usati per studiare la funzione del gene in P. hawaiensis. Mentre una sequenza del genoma a disposizione del pubblico non è al momento disponibile, un trascrittoma contenente le trascrizioni prodotta durante oogenesi e embriogenesi ha apen de novo assemblati e annotati 20, e depositati in un database consultabile 21, facilitando la scoperta del gene. In sintesi, P. hawaiensis è un organismo modello molto maneggevole adatto per molteplici approcci sperimentali e genetici per comprendere lo sviluppo. A differenza delle prime fratture sinciziale di D. melanogaster, P. embrioni hawaiensis fendere holoblastically segue fecondazione (Figura 2A). Lineage tracing analisi ha mostrato che dal terzo clivaggio, ciascuno dei terzi blastomeri scissione è specificamente destinata a dare origine ad uno dei tre strati germinali o la linea germinale 6 (Figura 2B). Questi dati, insieme ai dati di microarray 22, linea cellulare analisi 6,23, e gli esperimenti di isolamento blastomere 4 hanno suggerito che le potenzialità di sviluppo sono separate da almeno alcuni terzi blastomeri scissione di eredità asimmetrica del cell determinanti destino. Pertanto, in esperimenti blastomere ablazione in cui il precursore linea germinale (chiamato &quot;g&quot; nella linea cellulare nomenclatura Parhyale 6) è stato rimosso nella fase otto cellule, embrioni mancavano cellule germinali in successivi stadi di sviluppo 4, come indicato dall&#39;assenza di cellule esprimendo la proteina Vasa, che è un marker germinale nella maggior metazoi 24. Al contrario, somatiche esperimenti ablazione blastomeri hanno mostrato che P. embrioni hawaiensis possiedono anche notevoli capacità di regolamentazione, in modo tale che le sorti del mesoderma o ectoderma blastomeri precursori ablati allo stadio di otto cellule possono essere presi in consegna dai discendenti di alcuni dei restanti 25 blastomeri. Come regolativo sostituzione destino delle cellule può verificarsi, e il grado di autonomia adozione destino delle cellule somatiche da blastomeri, rimane sconosciuto. Sperimentali tecniche embriologiche come blastomere ablazione può essere utile a comprending l&#39;autonomia relativa e nonautonomy delle decisioni destino delle cellule 26,27 e sono quindi di interesse per lo studio di P. hawaiensis embriogenesi. Negli esperimenti che hanno dimostrato la sostituzione regolatore del ectodermici e mesodermici lignaggi, ablazione blastomeri è stata eseguita mediante iniezione 28 e la successiva eccitazione coloranti fototossiche 25. Mentre questa tecnica è efficace a uccidere il blastomeri (s) iniettato, non rimuove completamente il corpo cellula morta dall&#39;embrione. Inoltre, sono state osservate differenze tra i dati raccolti attraverso il lignaggio delle cellule agli stadi gastrulazione dell&#39;embriogenesi iniettando blastomeri con traccianti fluorescenti lignaggio 28,29, ei dati raccolti seguendo blastomeri imperturbati attraverso lo sviluppo degli stessi stadi embrionali 23. Completa rimozione fisica di blastomeri specifici può quindi essere un metodo preferito di ablazione per alcune applicazioni. Abbiamo già pubblicato i risultati della linea cellulare analisi degli embrioni in cui singole cellule sono state asportato manualmente 23. Tuttavia, le delicate operazioni necessarie per rimuovere i singoli blastomeri dai primi scissione embrioni fase non sono ancora state pienamente descritte. Qui vi presentiamo un protocollo per la raccolta di P. embrioni hawaiensis e ablazione manuale di un singolo blastomero da un embrione di otto cellule. L&#39;obiettivo di questo metodo è quello di ottenere la rimozione completa del corpo cellulare dall&#39;embrione, che permette l&#39;osservazione dei comportamenti cellulari e competenze destino cellulare delle restanti cellule durante l&#39;embriogenesi e sviluppo post-embrionale. Il nostro protocollo mostra rimozione del precursore g germinale (Figura 2C), ma può essere applicato a qualsiasi cella nella fase di otto cellule, o di blastomeri di scissione fasi precedenti. In linea di principio, questo protocollo potrebbe essere applicato a rimuovere le singole cellule da embrioni precoci fase scissione di Other holoblastically cleaving invertebrati marini.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1060">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">15 cm Pasteur pipette</td>
			<td style="width:164px;">Wheaton</td>
			<td style="width:123px;">53499-630</td>
			<td style="width:495px;">For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">22 cm Pasteur pipette</td>
			<td style="width:164px;">Wheaton</td>
			<td style="width:123px;">53499-632</td>
			<td style="width:495px;">For making mouth pipette tips. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">3 cm petri dishes</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">25382-334</td>
			<td style="width:495px;">Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">48-well plates</td>
			<td style="width:164px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:123px;">82051-004</td>
			<td style="width:495px;">For culturing embryos following ablation. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Bottle top filters 0.2 micron</td>
			<td style="width:164px;">Nalge Nunc International</td>
			<td style="width:123px;">28199-296</td>
			<td style="width:495px;">For creating FASW (See below) 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Bunsen burner</td>
			<td style="width:164px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">89038-530</td>
			<td style="width:495px;">For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Diamond scribe</td>
			<td style="width:164px;">Musco Sports Lighting</td>
			<td style="width:123px;">52865-005</td>
			<td style="width:495px;">For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:164px;">Forceps</td>
			<td style="width:164px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">11050-10</td>
			<td style="width:495px;">For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps - the tips can be at least as blunt as that in the forceps for which the catalogue number is listed here. 
			Fine Science Tools</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Fungizone-Amphotericin B</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">A2942</td>
			<td style="width:495px;">Add to FASW to a final concentration of 1mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. 
			Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Glass capillaries 4 inches long, 1/0.58 OD/ID (mm)</td>
			<td style="width:164px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:123px;">1B100-4</td>
			<td style="width:495px;">need to include glass capillary and needle puller machine? 
			World Precision Instruments</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Glass watchglass 300 mm diameter</td>
			<td style="width:164px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">70543-30</td>
			<td style="width:495px;">For use in removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. 
			Electron Microscopy Sciences</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW)</td>
			<td style="width:164px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:123px;">IS160</td>
			<td style="width:495px;">Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of X. 
			Aquatic EcoSystems</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW)</td>
			<td style="width:164px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:123px;">IS160</td>
			<td style="width:495px;">Use 0.2 micron filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (&#60; 250 ml) as needed. 
			Aquatic EcoSystems</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:164px;">Kimberly-Clark</td>
			<td style="width:123px;">21905-026</td>
			<td style="width:495px;">For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Mouth pipette adaptor</td>
			<td style="width:164px;">Drummond Labware</td>
			<td style="width:123px;">A5177-5EA</td>
			<td style="width:495px;">Insert the fine pulled pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure. 
			Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Mouth pipette tubing</td>
			<td style="width:164px;">Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">Z280356</td>
			<td style="width:495px;">Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure. 
			Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Needle Puller</td>
			<td style="width:164px;">Sutter Instrument Company</td>
			<td style="width:123px;">P97</td>
			<td style="width:495px;">For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated. 
			Sutter Instrument Company</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td style="width:164px;">Mediatech</td>
			<td style="width:123px;">45000-650</td>
			<td style="width:495px;">Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Rubber bulb</td>
			<td style="width:164px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">100488-418</td>
			<td style="width:495px;">For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Sylgard 184</td>
			<td style="width:164px;">K. R. Anderson, Inc.</td>
			<td style="width:123px;">NC9659604</td>
			<td style="width:495px;">Make up according to manufacturer&#39;s instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations. 
			Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Tungsten wire 0.004 inches diameter</td>
			<td style="width:164px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:123px;">719000</td>
			<td style="width:495px;">Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. 
			A-M Systems</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ablation of a single cell from eight-cell embryos of the amphipod crustacean parhyale hawaiensis

Il hawaiensis anfipode Parhyale è un piccolo crostaceo trovato in intercotidali habitat marini di tutto il mondo. Negli ultimi dieci anni, Parhyale è emerso come organismo modello promettente per studi di laboratorio di sviluppo, fornendo un confronto outgroup utile al ben studiato modello artropodi organismo Drosophila melanogaster. In contrasto con le fratture sinciziale di Drosophila, i primi divisioni di Parhyale sono holoblastic. Mappatura Fate utilizzando coloranti traccianti iniettati nel primi blastomeri hanno dimostrato che tutti e tre i foglietti embrionali e la linea germinale sono stabiliti dallo stadio di otto cellule. In questa fase, tre blastomeri predestinati per dare luogo alla ectoderma, tre sono destinata a dare origine al mesoderma, e gli altri due blastomeri sono rispettivamente i precursori della linea endoderma e germe. Tuttavia, gli esperimenti di ablazione blastomeri hanno dimostrato che gli embrioni Parhyale possiedono anche significativo capabiliti normativoes, in modo tale che i destini di blastomeri ablati allo stadio di otto cellule possono essere presi in consegna dai discendenti di alcuni dei restanti blastomeri. Blastomere ablazione è stato precedentemente descritto da uno dei due metodi: iniezione e successiva attivazione di coloranti fototossiche o ablazione manuale. Tuttavia, fotoablazione uccide blastomeri ma non rimuove il corpo cellulare morto dall&#39;embrione. Completa rimozione fisica di blastomeri specifici può quindi essere un metodo preferito di ablazione per alcune applicazioni. Qui vi presentiamo un protocollo per la rimozione manuale dei singoli blastomeri dalla fase di otto cellule di embrioni Parhyale, illustrando gli strumenti e le procedure manuali necessarie per la rimozione completa del corpo cellulare mantenendo vivo e intatto rimanenti blastomeri. Questo protocollo può essere applicato a qualsiasi cella Parhyale allo stadio di otto cellule, o blastomeri di altre fasi iniziali della scissione. Inoltre, in linea di principio questo protocollo possa essere applicabile ai primi di CleaVage embrioni stadio di altri invertebrati marini holoblastically fendendo.

Dopo il successo ablazione del singolo terzi scissione P. micromeri hawaiensis come descritto in questo protocollo, i restanti micromeri progressivamente spostano le loro posizioni leggermente in modo da occupare parzialmente lo spazio precedentemente occupato dal blastomero ablato. Per esempio, quando g viene rimosso, la vicina blastomeri mr e ML spostare leggermente e venire a condividere i bordi delle celle laterali che erano precedentemente in diretto contatto con ...

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Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

Il hawaiensis anfipode Parhyale è un organismo modello promettente per studi di embriologia crostacei e sviluppo artropodi comparativa e l&#39;evoluzione. Questo protocollo descrive un metodo per la rimozione manuale dei singoli blastomeri da embrioni precoci stadio di clivaggio Parhyale.

Ablazione di una singola cella da otto cellule embrioni dei crostacei anfipodi<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

The amphipod Parhyale hawaiensis is a small crustacean found in intertidal marine habitats worldwide. Over the past decade, Parhyale has emerged as a ...

ablation-single-cell-from-eight-cell-embryos-amphipod-crustacean

Research

JoVE Journal

Biology

Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

12.5K Views.  Harvard University.  Il hawaiensis anfipode Parhyale è un organismo modello promettente per studi di embriologia crostacei e sviluppo artropodi comparativa e l'evoluzione. Questo protocollo descrive un metodo per la rimozione manuale dei singoli blastomeri da embrioni precoci stadio di clivaggio Parhyale. 

Video: Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

Dissezione di organizzatore e Espianti Polo animali da embrioni di Xenopus laevis e montaggio di un saggio Adesione Cellulare

Ricerca

Biologia

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

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This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

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This video describes a simple, time-saving technique for automated tissue dissociation using the gentleMACS Dissociator to prepare single-cell suspensions of mouse splenocytes.

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Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

Ablazione laser del Pronephros Zebrafish allo Studio renale rigenerazione epiteliale

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Isolamento e purificazione di chinesina dal Drosophila Embrioni

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a critical yet enigmatic biological event that has been historically difficult to study due to technical and ethical limitations. Implantation is initiated by the development of the trophectoderm to early trophoblast and subsequent differentiation into distinct trophoblast sublineages. Aberrant early trophoblast differentiation may lead to implantation failure, placental pathologies, fetal abnormalities, and miscarriage. Recently, methods have been developed to allow human embryos to grow until day 13 post-fertilization in vitro in the absence of maternal tissues, a time-period that encompasses the implantation period in humans. This has given researchers the opportunity to investigate human implantation and recapitulate the dynamics of trophoblast differentiation during this critical period without confounding maternal influences and avoiding inherent obstacles to study early embryo differentiation events in vivo. To characterize different trophoblast sublineages during implantation, we have adopted existing two-dimensional (2D) extended culture methods and developed a procedure to enzymatically digest and isolate different types of trophoblast cells for downstream assays. Embryos cultured in 2D conditions have a relatively flattened morphology and may be suboptimal in modeling in vivo three-dimensional (3D) embryonic architectures. However, trophoblast differentiation seems to be less affected as demonstrated by anticipated morphology and gene expression changes over the course of extended culture. Different trophoblast sublineages, including cytotrophoblast, syncytiotrophoblast and migratory trophoblast can be separated by size, location, and temporal emergence, and used for further characterization or experimentation. Investigation of these early trophoblast cells may be instrumental in understanding human implantation, treating common placental pathologies, and mitigating the incidence of pregnancy loss.

Here, we describe a method for warming vitrified human blastocysts, culturing them through the implantation period in vitro, digesting them into single cells and collecting early trophoblast cells for further investigation.

Raccolta a cella singola di cellule di trofoblasto in peri-impianto Stadio Embrioni Umani

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a ...

Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The preparation of high-quality single-cell suspensions is essential for single-cell level studies such as single-cell RNA or genome sequencing. However, there is no ready-to-use protocol for aquaculture fish species, particularly for the intestine of tilapia. The effective dissociation enzymes vary depending on the tissue type. Therefore, optimizing the tissue dissociation protocol by selecting the appropriate enzyme or enzyme combination to obtain enough viable cells with minimum damage is essential. This study illustrates an optimized protocol to prepare a high-quality single-cell suspension from Nile tilapia intestine with an enzyme combination of collagenase/dispase. This combination is highly effective for dissociation with the utilization of bovine serum albumin and DNase to reduce cell aggregation after digestion. The cell output satisfies the requirements for single-cell sequencing, with 90% cell viability and a high cell concentration. This protocol can also be modified to prepare a single-cell suspension from the intestines of other fish species. This research provides an efficient reference protocol and reduces the need for additional trials in the preparation of single-cell suspensions for aquaculture fish species.

Here, we demonstrate the preparation of a high-quality single-cell suspension of tilapia intestine for single-cell sequencing.

Preparazione della sospensione unicellulare dall'intestino della tilapia del Nilo per il sequenziamento a singola cellula

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The ...

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, which is known as cellular heterogeneity. In recent years, single-cell and cell-type isolation combined with next-generation sequencing (NGS) techniques have become important tools for studying biological processes at single-cell resolution. However, isolating plant cells is relatively more difficult due to the presence of plant cell walls, which limits the application of single-cell approaches in plants. This protocol describes a robust procedure for fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based single-cell and cell-type isolation with plant cells, which is suitable for downstream multi-omics analysis and other studies. Using Arabidopsis root fluorescent marker lines, we demonstrate how particular cell types, such as xylem-pole pericycle cells, lateral root initial cells, lateral root cap cells, cortex cells, and endodermal cells, are isolated. Furthermore, an effective downstream transcriptome analysis method using Smart-seq2 is also provided. The cell isolation method and transcriptome analysis techniques can be adapted to other cell types and plant species and have broad application potential in plant science.

The feasibility and effectiveness of high-throughput scRNA-seq methods herald a single-cell era in plant research. Presented here is a robust and complete procedure for isolating specific Arabidopsis thaliana root cell types and subsequent transcriptome library construction and analysis.

Analisi dell'isolamento e del trascrittoma di tipi di cellule vegetali

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...