Nous remercions Rayhan Arif et Hassaan Shahawy pour le travail de la caméra, Tripti Gupta et Frederike Alwes à l&#39;aide d&#39;affiner la technique d&#39;ablation de la cellule, et les membres du laboratoire Extavour pour les informations sur les données, la vidéo et manuscrit. Ce travail a été partiellement financé par l&#39;Institut des cellules souches de Harvard (semences nombre de Grant SG-0057-10-00) de la Fondation Ellison médical (New Scholar nombre Award AG-NS-07010-10) à la CGE, et bourses de recherche du Collège Harvard ARN.

Les commentaires qui pourraient être utiles dans l&#39;exécution de certaines mesures sont indiquées en italique. Une. Jour 1: Préparation des matériaux <ol><li> Préparer les documents suivants (voir le tableau des matériaux et de l&#39;équipement): <ul><li> 15 cm et 22 cm de pipettes Pasteur </li><li> Diamant scribe </li><li> eau de mer artificielle filtrée (salinité entre 0,0018 à 0,0020) contenant 1 mg / ml d&#39;amphotéricine B (1:100 d&#39;une solution stock de 100 mg / ml), 100 unités / ml de pénicilline et 100 mg / ml de streptomycine (1h50 d&#39;une solution mère contenant 5000 unités / ml de pénicilline et 5,000 mg / ml de streptomycine) </li><li> Filtre à eau de mer artificielle (salinité entre 0,0018 à 0,0020) sans additifs </li><li> un récipient en matière plastique à grande pour les couples de logement (au moins 15 cm x 15 cm x 5 cm) </li><li> petits (3 ou 5 cm) des boîtes de Pétri bordées de Sylgard </li><li> petits (3 ou 5 cm) des boîtes de Pétri </li><li> un verre de montre ou de verre plaque multi-puits </li><li> forceps (nous utilisons le forceps émoussé dérivés vientm old Dumont # 5 pinces qui ont été accidentellement endommagés dans d&#39;autres procédures de laboratoire, que nous avons réutilisés en utilisant une pince à aiguiser pierre à faire en sorte que les extrémités de la pince sont lisses, que les deux dents sont de même longueur, et qu&#39;elles n&#39;ont plus pointes. Pinces très fines, comme les nouveaux Dumont # 5 forceps, sont indésirables car ils peuvent blesser les embryons et / ou des femmes.) </li><li> pipette Pasteur avec fin élargi (étape 1.2 dessous) </li><li> un outil de recherche sur l&#39;embryon constitué d&#39;un mince fil de tungstène courbe intégré dans l&#39;extrémité mince d&#39;une pipette Pasteur (peut être remplacé par un autre de mettre en œuvre, voir 1.3 ci-dessous) </li><li> une pipette de bouche avec une petite ouverture (voir l&#39;étape 1.4 ci-dessous) </li><li> une aiguille de verre fabriqué à partir d&#39;un capillaire en verre tiré (voir étape 1.5 ci-dessous) </li></ul> Pas de substances toxiques pour les êtres humains sont utilisés dans ce protocole. Cependant, les chercheurs doivent s&#39;assurer qu&#39;ils portent des gants ou autres vêtements de protection comme l&#39;exige la guidel de gestion des risquesines de leur institution. </li><li> Pour faire la pipette élargi Pasteur, premier score autour d&#39;une pipette 15 cm de Pasteur à l&#39;endroit où la pipette commence à se rétrécir avec une pointe en diamant, envelopper la région a reçu de la pipette dans une serviette Kimwipe ou papier pour protéger les doigts, puis soigneusement rompre la pointe sur la ligne de score. Tenez l&#39;extrémité cassée de la pipette sur une flamme du brûleur Bunsen pendant plusieurs secondes pour lisser les bords. L&#39;ouverture doit être légèrement plus étroite que la largeur maximale de la pipette. </li><li> Pour rendre l&#39;outil de dissection de fil de tungstène, insérer un fil de tungstène dans l&#39;extrémité d&#39;un 15 cm pipette Pasteur en verre, et maintenez brièvement sur flamme d&#39;un brûleur Bunsen pour faire fondre le verre, fixant le fil en place. Utilisez une pince à courbe doucement l&#39;extrémité du fil en forme de crochet. Voir Figure 3 pour un exemple d&#39;une forme appropriée pour cet outil. </li><li> Pour faire une petite ouverture pour la bouche pipette, tirez l&#39;extrémité mince d&#39;une pipette Pasteur 22 cm en deux vo pièceser une flamme, et rompre la pointe de la petite extrémité. Insérer dans l&#39;extrémité du porte-pipette de la bouche. </li><li> Ajoutez l&#39;aiguille de verre qui sera utilisé pour perforer les blastomères d&#39;intérêt au cours de la procédure d&#39;ablation à l&#39;aide d&#39;un extracteur d&#39;aiguille. Une aiguille de forme appropriée est représentée sur la Figure 4. Cette aiguille a été tiré sur un extracteur d&#39;aiguilles Sutter P97 utilisant un programme avec des paramètres 2x (chaleur = 566, tirez = 100, vitesse = 20, temps = 250) + 1X (chaleur = 566, tirez = 100, vitesse = 100, temps = 250). Le programme et l&#39;instrument spécifique utilisé pour faire l&#39;aiguille peuvent varier, mais l&#39;aiguille doivent avoir une pointe fine, mais aussi être suffisamment solide pour ne pas casser lorsqu&#39;il est poussé contre le chorion de l&#39;embryon. </li></ol> 2. Jour 1: Couples Rassemblement Parhyale accouplement <ol><li> Utilisez la pipette Pasteur élargi (étape 1.2 ci-dessus) pour recueillir l&#39;accouplement P. couples hawaiensis du grand récipient de culture, et les transférer dans un récipient contenant séparé cpencher en eau de mer artificielle. Il n&#39;est pas nécessaire que cette eau de mer filtrée. Il est préférable de recueillir des paires de contact dans l&#39;après-midi plus tard et de laisser les couples à la température ambiante (20-23 º C) pendant la nuit, de sorte que le lendemain matin, la plupart des embryons aura été récemment fécondé et déposé, et donc au début du clivage des stades appropriés pour ablation. Recueillir au moins 20 paires de contact pour s&#39;assurer que certaines femmes seront munis embryons au stade de clivage début le lendemain matin. </li></ol> 3. Jour 2: Rassemblement Parhyale embryons <ul><li> Le lendemain matin, infuser l&#39;eau de mer artificielle filtrée (FASW) de CO 2. Certaines des femmes auront nagé sans leurs hommes pendant la nuit, de recueillir ces femmes séparées et anesthésier les dans FASW / CO 2. Les mâles non appariés restants peuvent être retirés à partir du récipient d&#39;accouplement paire et retournés à la grande culture. Couples reproducteurs restants peuvent être enregistrés pour la collecte des embryons plus tarddans la journée ou le lendemain. </li><li> Transférer une seule femelle anesthésié portant des embryons à un verre de montre dans FASW / CO 2. Toutes les femmes séparées auront probablement déposé des œufs, qui sera visible à l&#39;oeil nu comme rose pâle ou sphéroïdes pourpre à travers les plaques coxales transparentes des femmes (figure 1A). Pour déterminer si les embryons sont à des stades précoces de clivage et donc approprié pour blastomère ablation, le chercheur devra éliminer les embryons de la poche incubatrice et les examiner sous un microscope. </li><li> Affichage de la procédure sous un microscope de dissection, saisir les plaques coxales long d&#39;un côté du corps avec des pinces. Les embryons seront visibles dans la poche incubatrice ventrale entre ces plaques coxales (figure 1B). </li><li> Insérez l&#39;outil de fil mince, courbe (Figure 3; étape 1.3 ci-dessus) dans l&#39;extrémité postérieure de la poche incubatrice, et soulevez doucement le fil vers l&#39;extrémité antérieure de la poche incubatrice de séparer le couvainrevêtements de poche (ceux-ci sont modifiés appendices ventraux appelés oostégites 30), l&#39;ouverture de la poche et desserrer les embryons. Les embryons qui sont dans la première heure ou d&#39;être mis sont tous enfermés dans une membrane transparente très mince qui sera facilement être perturbé par l&#39;outil de fil; cette membrane disparaît d&#39;environ 2-3 heures après la ponte, et les embryons ne sont pas liés à l&#39;autre ou à la femelle en aucune façon partir de ce point tout au long de l&#39;embryogenèse. Si les chercheurs trouvent gênant ou difficile à manoeuvrer l&#39;outil métallique courbé pour éliminer les embryons de la poche incubatrice, une alternative mise en œuvre peut être utilisé, à condition que les mouvements sont doux et pas de pression sévère est appliquée sur les embryons ou la poche incubatrice. Autres outils appropriés pour éliminer les embryons de la poche incubatrice comprennent forceps émoussé ou un capillaire de verre scellée à une extrémité et lissée. </li><li> Utilisez une pipette 15 cm inchangé Pasteur à injecter de l&#39;eau à travers la poche de couvée ouvert, poussant til embryons, ce qui devrait se déposer au fond du verre de la montre. Transférer la femelle pour nettoyer FASW (sans CO 2) pour permettre la récupération avant sa réintroduction à la culture principale. Femelles multiples peuvent être placés dans le même bac de récupération, mais permettent femmes à se remettre complètement avant de les renvoyer à la culture principale, comme ils peuvent être mangés par d&#39;autres animaux si elles sont encore partiellement anesthésiés. </li><li> Utilisez une pipette 15 cm inchangé Pasteur pour transférer les embryons dans une boîte de Pétri avec FASW propre, et voir au microscope afin de déterminer leur stade embryonnaire. Embryons qui sont séparés lors de la troisième clivage (étape 4 de 5), qui sont appropriés pour cette procédure. Il devrait également être possible d&#39;appliquer ce protocole à n&#39;importe quel stade de clivage avant la formation de disque embryonnaire (stades 7 au 8 mai). </li></ul> 4. Jour 2: Ablation cellules isolées <ol><li> Remplissez boîte de Pétri Sylgard doublée d&#39;une couche superficielle de FASW. Utilisez une inchangée 15 cm pi Pasteurpette de transférer un seul embryon à la plaque. </li><li> En utilisant une pince émoussée, rouler doucement l&#39;embryon d&#39;identifier la cellule à l&#39;ablation (Figures 2A et 2B). Le précurseur g de la lignée germinale peut être identifié comme le plus petit micromere, qui se trouve au sommet de la plus petite Mav de macromere. En outre, g ne touche pas directement la cellule en, qui est le micromere directement en face de lui, comme les micromères précurseurs de mésoderme ml et la part de mr une bordure de cellule dans le milieu de l&#39;embryon. Mr le blastomère à droite de g, et ml est la micromere à la gauche de g. Les macromères sœurs de mr, ml, et en sont les précurseurs de l&#39;ectoderme Er, El, et Ep respectivement. </li><li> Avec des pinces dans le left la main si le chercheur est droitier (ou dans la main droite si le chercheur est gaucher), orienter l&#39;embryon avec la cellule d&#39;intérêt vers la droite (ou à gauche si le chercheur est gaucher), et saisir doucement l&#39;embryon entre la pince pour le stabiliser. </li><li> En utilisant une aiguille tirée de verre (de l&#39;étape 1.5 ci-dessus, la figure 4), la perforation doucement la cellule d&#39;intérêt. Ne pas insérer l&#39;aiguille trop loin, afin de ne pas pousser l&#39;aiguille dans les cellules voisines ou en dessous de la cellule d&#39;intérêt. L&#39;aiguille n&#39;a plus qu&#39;à percer le chorion et la membrane de la cellule sous-jacente, et n&#39;a pas besoin de s&#39;étendre profondément dans la cellule à ablater. </li><li> Échanger l&#39;aiguille utilisée pour percer l&#39;embryon pour la fin de verre d&#39;une pipette de bouche avec une amende tiré pointe de la pipette Pasteur (étape 1.4 ci-dessus). Maintenez la pointe de la pipette à proximité du trou créé dans la cellule d&#39;intérêt, et appliquer une aspiration très doux. </li><li> Très presser doucement l&#39;embryon avec la pince. Comme le contenu du blastosimple est poussé hors du chorion par le trou créé à l&#39;étape 4.4, sucer dans la bouche pipette pour permettre une vue dégagée de l&#39;embryon. Si le trou est suffisamment grand, le noyau de la cellule perforé peut être vu à émerger aussi bien. C&#39;est un bon contrôle pour s&#39;assurer que le contenu des cellules entières ont été supprimés et ne peuvent pas être régénérée. </li><li> Observer attentivement l&#39;embryon comme le blastomère d&#39;intérêt est retiré. La bordure de la cellule perforé va reculer vers le trou dans le chorion, ce qui rend les intersections des cellules sous-jacentes visibles. Continuer à appliquer une pression jusqu&#39;à ce que tout le blastomère d&#39;intérêt a été éliminée. Utilisez une pince à rouler l&#39;embryon de gauche à droite et de confirmer visuellement que toutes les blastomère d&#39;intérêt est allé. </li><li> Utilisation d&#39;un non modifiée 15 cm pipette Pasteur, transférer l&#39;embryon pour nettoyer FASW + (FASW + 1 mg / ml d&#39;amphotéricine B, 100 unités / ml de pénicilline et 100 mg / ml de streptomycine). </li><li> Soulever des embryons de blastomères-ablation dans des puits individuelsd&#39;une assiette propre de 48 puits dans FASW +, changer 50% de FASW aux antibiotiques complété + quotidien. Dans nos mains embryons survivent et se développent bien, même après l&#39;ablation, à une gamme de températures de 18 à 28 º C. Les chercheurs devraient élever leurs embryons à une température pour laquelle ils ont une surface propre (mais pas nécessairement stérile) sur lequel élever les embryons avec une perturbation minimale. Pour être en mesure de comparer le calendrier des événements de développement dans des embryons de blastomères-ablation avec des contrôles, nous renvoyons le lecteur à l&#39;information de la mise en scène de développement détaillé est disponible pour les embryons soulevées à 18 º C 4, 25 º C 4, et 26 º C 5,6. </li></ol>

<ol>
	<li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3.">Chapter 3.</a> Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual Volume. , 373-404 .</li><li>Sander, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+insect+embryogenesis:+the+evolution+of+concepts+and+mechanisms.">Pattern formation in insect embryogenesis: the evolution of concepts and mechanisms.</a> Int. J.Insect Morphol. Embryol. 25, 349-367 (1997).</li><li>Regier, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthropod+relationships+revealed+by+phylogenomic+analysis+of+nuclear+protein-coding+sequences.">Arthropod relationships revealed by phylogenomic analysis of nuclear protein-coding sequences.</a> Nature. 463, 1079-1083 (2010).</li><li>Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+isolated+blastomeres+with+respect+to+germ+cell+formation+in+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">The fate of isolated blastomeres with respect to germ cell formation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 277, 387-402 (2005).</li><li>Browne, W. E., Price, A. L., Gerberding, M., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+in+the+amphipod+crustacean,+Parhyale+hawaiensis.">Stages of embryonic development in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis.</a> Genesis. 42, 124-149 (2005).</li><li>Gerberding, M., Browne, W. E., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+analysis+of+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis+reveals+an+early+restriction+of+cell+fates.">Cell lineage analysis of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis reveals an early restriction of cell fates.</a> Development. 129, 5789-5801 (2002).</li><li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+and+dissection+of+Parhyale+hawaiensis+embryos.">Fixation and dissection of Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li><li>Price, A. L., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+divergent+mechanisms+of+mesoderm+development+in+arthropods:+the+expression+of+Ph-twist+and+Ph-mef2+in+Parhyale+hawaiensis.">Investigating divergent mechanisms of mesoderm development in arthropods: the expression of Ph-twist and Ph-mef2 in Parhyale hawaiensis.</a> J. Exp. B. Dev. Evol. 310, 24-40 (2008).</li><li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+of+labeled+RNA+probes+to+fixed+Parhyale+hawaiensis+embryos.">In situ hybridization of labeled RNA probes to fixed Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li><li>Browne, W. W., Schmid, B. G. M., Wimmer, E. A., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+otd+orthologs+in+the+amphipod+crustacean,+Parhyale+hawaiensis.">Expression of otd orthologs in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Genes Evol. 216, 581-595 (2006).</li><li>Prpic, N. M., Telford, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+homothorax+and+extradenticle+mRNA+in+the+legs+of+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis:+evidence+for+a+reversal+of+gene+expression+regulation+in+the+pancrustacean+lineage.">Expression of homothorax and extradenticle mRNA in the legs of the crustacean Parhyale hawaiensis: evidence for a reversal of gene expression regulation in the pancrustacean lineage.</a> Dev. Genes Evol. 218, 333-339 (2008).</li><li>Kizil, G., Havemann, J., Gerberding, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cells+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis+depend+on+Vasa+protein+for+their+maintenance+but+not+for+their+formation.">Germ cells in the crustacean Parhyale hawaiensis depend on Vasa protein for their maintenance but not for their formation.</a> Dev. Biol. 327, 320-239 (2009).</li><li>Liubicich, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+Parhyale+Ultrabithorax+recapitulates+evolutionary+changes+in+crustacean+appendage+morphology.">Knockdown of Parhyale Ultrabithorax recapitulates evolutionary changes in crustacean appendage morphology.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13892-13896 (2009).</li><li>Pavlopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+evolution+of+appendage+specialization+by+Hox+gene+misexpression+in+an+emerging+model+crustacean.">Probing the evolution of appendage specialization by Hox gene misexpression in an emerging model crustacean.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13897-13902 (2009).</li><li>Vargas-Vila, M. A., Hannibal, R. L., Parchem, R. J., Liu, P. Z., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prominent+requirement+for+single-minded+and+the+ventral+midline+in+patterning+the+dorsoventral+axis+of+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">A prominent requirement for single-minded and the ventral midline in patterning the dorsoventral axis of the crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Development. 137, 3469-3476 (2010).</li><li>Simanton, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+arthropod+midline+netrin+accumulation+revealed+with+a+cross-reactive+antibody+provides+evidence+for+midline+cell+homology.">Conservation of arthropod midline netrin accumulation revealed with a cross-reactive antibody provides evidence for midline cell homology.</a> Evol. Dev. 11, 260-268 (2009).</li><li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+staining+of+Parhyale+hawaiensis+embryos.">Antibody staining of Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li><li>Pavlopoulos, A., Averof, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+genetic+transformation+for+comparative+developmental+studies+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">Establishing genetic transformation for comparative developmental studies in the crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7888-7893 (2005).</li><li>Kontarakis, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+strategy+for+gene+trapping+and+trap+conversion+in+emerging+model+organisms.">A versatile strategy for gene trapping and trap conversion in emerging model organisms.</a> Development. 138, 2625-2630 (2011).</li><li>Zeng, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+assembly+and+characterization+of+a+maternal+and+developmental+transcriptome+for+the+emerging+model+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">De novo assembly and characterization of a maternal and developmental transcriptome for the emerging model crustacean Parhyale hawaiensis.</a> BMC Genom. 12, 581 (2011).</li><li>Zeng, V., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASGARD:+an+open-access+database+of+annotated+transcriptomes+for+emerging+model+arthropod+species.">ASGARD: an open-access database of annotated transcriptomes for emerging model arthropod species.</a> Database. , (2012).</li><li>Nestorov, P., Battke, F., Levesque, M. P., Gerberding, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Maternal+Transcriptome+of+the+Crustacean+Parhyale+hawaiensis+Is+Inherited+Asymmetrically+to+Invariant+Cell+Lineages+of+the+Ectoderm+and+Mesoderm.">The Maternal Transcriptome of the Crustacean Parhyale hawaiensis Is Inherited Asymmetrically to Invariant Cell Lineages of the Ectoderm and Mesoderm.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li><li>Alwes, F., Hinchen, B., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+cell+lineage,+movement,+and+migration+from+germ+layer+specification+to+gastrulation+in+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">Patterns of cell lineage, movement, and migration from germ layer specification to gastrulation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 139, 110-123 (2011).</li><li>Ewen-Campen, B., Schwager, E. E., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+machinery+of+germ+line+specification.">The molecular machinery of germ line specification.</a> Mol. Reprod. Dev. 77, 3-18 (2010).</li><li>Price, A. L., Modrell, M. S., Hannibal, R. L., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesoderm+and+ectoderm+lineages+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis+display+intra-germ+layer+compensation.">Mesoderm and ectoderm lineages in the crustacean Parhyale hawaiensis display intra-germ layer compensation.</a> Dev. Biol. 341, 256-266 (2010).</li><li>Fraser, S. E., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+metamorphosis+of+experimental+embryology.">The molecular metamorphosis of experimental embryology.</a> Cell. 100, 41-55 (2000).</li><li>Olsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clash+of+traditions:+the+history+of+comparative+and+experimental+embryology+in+Sweden+as+exemplified+by+the+research+of+G&#246;sta+J&#228;gersten+and+Sven+H&#246;rstadius.">A clash of traditions: the history of comparative and experimental embryology in Sweden as exemplified by the research of G&#246;sta J&#228;gersten and Sven H&#246;rstadius.</a> Theory Biosci. 126, 117-129 (2007).</li><li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+Parhyale+hawaiensis+blastomeres+with+fluorescently+labeled+tracers.">Injection of Parhyale hawaiensis blastomeres with fluorescently labeled tracers.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li><li>Chaw, R., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+migration+of+cell+populations+in+the+early+gastrulation+of+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">Independent migration of cell populations in the early gastrulation of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 371, 94-109 (2012).</li><li>Schmitz, E. H., Harrison, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crustacea+Microscopic+Anatomy+of+Invertebrates.">Crustacea Microscopic Anatomy of Invertebrates.</a> Microscopic Anatomy of Invertebrates. 9, 443-528 (1992).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Nous décrivons un protocole pour l&#39;ablation d&#39;emploi et l&#39;élimination physique complète de blastomères simples à partir des stades de clivage début de l&#39;amphipode P. hawaiensis. Nous démontrons l&#39;utilisation de ce protocole en supprimant la seule ligne de cellules germinales précurseur g à partir d&#39;un embryon au stade de huit cellules, et montrons que l&#39;ablation a été un succès en confirmant l&#39;absence de cellules filles de g dans l&#3...

Le Parhyale hawaiensis amphipode crustacé a émergé au cours de la dernière décennie comme un organisme modèle prometteur avec un grand potentiel pour une utilisation dans la recherche en biologie évolutive du développement 1. Parmi les arthropodes, la plupart des systèmes modèles sont des insectes, et la plus étudiée de ces derniers est la mouche Drosophila melanogaster. D. melanogaster est un membre de l&#39;ordre des insectes diptères, et que ces affiche de nombreuses caractéristiques embryologiques qui sont dérivées par rapport à ceux des insectes ramification basale 2. En outre, les insectes sont imbriqués dans le sous-embranchement Pancrustacea 3, ce qui signifie que les insectes ont leurs plus proches parents dans le groupe de longue date &quot;naturel&quot; appelé pancrustaceans, et que ce groupe est paraphylétique. Cela suggère que, en plus de ramification basale modèles d&#39;insectes, les études d&#39;autres crustacés sont nécessaires pour avoir une vue plus large de l&#39;histoire de l&#39;évolution des traits développement d&#39;unmécanismes moléculaires nd qui ont été si bien étudiés dans D. melanogaster. Cependant, très peu de crustacés ont été bien établies pour l&#39;analyse de laboratoire expérimental de développement. L&#39;amphipode P. hawaiensis est un système de modèle de laboratoire très docile, prête à une gamme de techniques expérimentales. Amphipodes affichent de nombreuses fonctionnalités uniques dans leur superorder mère Peracarida (trémies de plage, gammares, et crevettes ainsi), et sont donc censés être relativement dérivé dans ce groupe de crustacés. Néanmoins, la relative facilité de manipulation génétique embryonnaire et fonctionnel offert par Parhyale faire cet amphipode un ajout précieux à l&#39;inventaire actuel des organismes modèles. Comme un animal de laboratoire, P. hawaiensis offre de nombreux avantages. Les animaux sont tolérantes à un large éventail de températures et de salinité, et survivent bien dans les grandes cultures de l&#39;eau de mer artificielle 1. Il est facile de distinguer entrhommes et les femmes een basées sur les différences morphologiques évidentes, plus particulièrement, les grands crochets, les appendices du tronc antérieures que les hommes utilisent pour saisir les femelles pendant l&#39;accouplement. Pour les travaux embryologique et développement, P. hawaiensis a plusieurs caractéristiques très attrayantes. Embryogenèse dure environ dix jours et le temps de la maturité sexuelle est d&#39;environ six semaines à 28 ° C (mais notez que Parhyale survit bien à des températures allant d&#39;environ 20-30 ° C, et que la stadification de développement détaillé est disponible pour les embryons soulevées à 18 º C 4 , 25 ° C 4, et 26 ° C 5,6). Les adultes s&#39;accouplent toute l&#39;année dans le laboratoire, si des embryons sont disponibles à tout moment de l&#39;année. Les femelles pondent 2-20 (en fonction de l&#39;âge des femmes) œufs fécondés dans une poche incubatrice ventrale située entre les premières paires de pattes (figures 1A et 1B), et il est possible de rassembler ces embryonss très tôt dans le développement sans tuer la femelle ou d&#39;endommager les embryons (figure 1C). Les embryons survivent dans l&#39;eau filtrée de mer artificielle jusqu&#39;à l&#39;éclosion, peuvent être fixés pour l&#39;expression du gène ultérieur ou l&#39;analyse histologique 7, et une table de transfert détaillée permet une identification précise des progrès grâce au développement 5. Protocoles robustes ont été utilisés pour effectuer l&#39;analyse de l&#39;expression des gènes par hybridation in situ 8-15 ou immunomarquage 4,16,17 dans, knockdown fonctionnelle par interférence ARN 13,15 ou morpholinos 12, et la lignée germinale stable transgénèse 18. Utilisation du système de transgenèse, une expression inductible 14 et l&#39;amplificateur piège 19 méthodes peuvent également être utilisées pour étudier la fonction de gènes dans P. hawaiensis. Bien que la séquence du génome accessible au public n&#39;est actuellement pas disponible, un transcriptome contenant des transcriptions produites au cours de l&#39;ovogenèse et de l&#39;embryogenèse a abeillen de novo assemblées et annotées 20, et déposés dans une base de données consultable 21, ce qui facilite la découverte de gènes. En somme, P. hawaiensis est un organisme modèle très maniable adapté à de multiples approches expérimentales et génétiques à la compréhension du développement. Contrairement aux clivages syncytial début de D. melanogaster, P. embryons de hawaiensis clivent holoblastically après la fécondation (figure 2A). analyse traçage de Lineage a montré que par la troisième clivage, chacune des tiers blastomères de clivage est particulièrement malheureuse pour donner naissance à l&#39;un des trois feuillets embryonnaires ou la lignée germinale 6 (figure 2B). Ces données, ainsi que les données de puces à ADN 22, analyses lignée cellulaire 6,23, et les expériences d&#39;isolement de blastomère 4 ont suggéré que les potentiels de développement sont séparés à au moins certains tiers clivage blastomères par héritage asymétrique de cell déterminants du devenir. En conséquence, dans des expériences blastomère d&#39;ablation, dans lequel le précurseur de la lignée germinale (appelée &quot;g&quot; dans le Parhyale lignée cellulaire nomenclature 6) a été éliminé à l&#39;étape de cellule huit, les embryons n&#39;avaient pas les cellules germinales à des stades de développement ultérieurs 4, comme indiqué par l&#39;absence de cellules exprimer la protéine Vasa, qui est un marqueur de la lignée germinale dans la plupart des métazoaires 24. En revanche, les expériences somatiques d&#39;ablation blastomères ont montré que P. embryons de hawaiensis possèdent également des capacités réglementaires importantes, telles que les sorts de mésoderme ou ectoderme blastomères précurseurs ablation au stade de huit cellules peuvent être prises en charge par les descendants de certains des blastomères restants 25. Comment réglementaire remplacement du destin cellulaire peut se produire, et la mesure de l&#39;adoption autonome du destin cellulaire par blastomères somatiques, reste inconnu. Techniques embryologiques expérimentales telles que blastomère ablation peuvent être utiles dans compréding l&#39;autonomie relative et nonautonomy des décisions du destin cellulaire 26,27 et sont donc d&#39;un intérêt dans l&#39;étude de P. hawaiensis embryogenèse. Dans les expériences qui ont démontré le remplacement de régulation de l&#39;ectoderme et mésoderme lignées, ablation blastomère a été réalisée par injection 28 et excitation ultérieure de colorants phototoxiques 25. Bien que cette technique est efficace pour tuer le blastomère (s) injecté, il ne supprime pas complètement le corps de cellules mortes de l&#39;embryon. En outre, des différences ont été observées entre les données de la lignée de cellules recueillies jusqu&#39;aux stades de l&#39;embryogenèse de gastrulation par injection blastomères avec des traceurs de la lignée fluorescentes 28,29, et les données recueillies par la suite blastomères perturbés par le développement des mêmes stades embryonnaires 23. Élimination physique complète des blastomères spécifiques peut donc être un procédé préféré d&#39;ablation pour certaines applications. Nous avons déjà publié les résultats de la lignée cellulaire analyse des embryons dont les cellules simples ont été soumises à une ablation manuellement 23. Toutefois, les opérations délicates nécessaires pour éliminer blastomères simples à partir d&#39;embryons de stade de clivage début n&#39;ont pas encore été entièrement décrit. Nous présentons ici un protocole de collecte de P. embryons de hawaiensis et ablation manuelle d&#39;un seul blastomère d&#39;un embryon au stade de huit cellules. Le but de cette méthode est de parvenir à l&#39;élimination complète du corps de la cellule de l&#39;embryon, permettant l&#39;observation des comportements cellulaires et les compétences du destin cellulaire des cellules restantes au cours de l&#39;embryogenèse et le développement post-embryonnaire. Notre protocole montre l&#39;enlèvement du précurseur g de la lignée germinale (figure 2C), mais peut être appliquée à n&#39;importe quelle cellule au stade huit cellules, ou à des blastomères étapes de clivage précédents. En principe, ce protocole pourrait être appliquée pour éliminer les cellules individuelles à partir d&#39;embryons à un stade préliminaire de clivage d&#39;Other clivage holoblastically invertébrés marins.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1060">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">15 cm Pasteur pipette</td>
			<td style="width:164px;">Wheaton</td>
			<td style="width:123px;">53499-630</td>
			<td style="width:495px;">For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">22 cm Pasteur pipette</td>
			<td style="width:164px;">Wheaton</td>
			<td style="width:123px;">53499-632</td>
			<td style="width:495px;">For making mouth pipette tips. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">3 cm petri dishes</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">25382-334</td>
			<td style="width:495px;">Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">48-well plates</td>
			<td style="width:164px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:123px;">82051-004</td>
			<td style="width:495px;">For culturing embryos following ablation. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Bottle top filters 0.2 micron</td>
			<td style="width:164px;">Nalge Nunc International</td>
			<td style="width:123px;">28199-296</td>
			<td style="width:495px;">For creating FASW (See below) 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Bunsen burner</td>
			<td style="width:164px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">89038-530</td>
			<td style="width:495px;">For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Diamond scribe</td>
			<td style="width:164px;">Musco Sports Lighting</td>
			<td style="width:123px;">52865-005</td>
			<td style="width:495px;">For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:164px;">Forceps</td>
			<td style="width:164px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">11050-10</td>
			<td style="width:495px;">For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps - the tips can be at least as blunt as that in the forceps for which the catalogue number is listed here. 
			Fine Science Tools</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Fungizone-Amphotericin B</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">A2942</td>
			<td style="width:495px;">Add to FASW to a final concentration of 1mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. 
			Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Glass capillaries 4 inches long, 1/0.58 OD/ID (mm)</td>
			<td style="width:164px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:123px;">1B100-4</td>
			<td style="width:495px;">need to include glass capillary and needle puller machine? 
			World Precision Instruments</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Glass watchglass 300 mm diameter</td>
			<td style="width:164px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">70543-30</td>
			<td style="width:495px;">For use in removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. 
			Electron Microscopy Sciences</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW)</td>
			<td style="width:164px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:123px;">IS160</td>
			<td style="width:495px;">Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of X. 
			Aquatic EcoSystems</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW)</td>
			<td style="width:164px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:123px;">IS160</td>
			<td style="width:495px;">Use 0.2 micron filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (&#60; 250 ml) as needed. 
			Aquatic EcoSystems</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:164px;">Kimberly-Clark</td>
			<td style="width:123px;">21905-026</td>
			<td style="width:495px;">For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Mouth pipette adaptor</td>
			<td style="width:164px;">Drummond Labware</td>
			<td style="width:123px;">A5177-5EA</td>
			<td style="width:495px;">Insert the fine pulled pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure. 
			Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Mouth pipette tubing</td>
			<td style="width:164px;">Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">Z280356</td>
			<td style="width:495px;">Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure. 
			Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Needle Puller</td>
			<td style="width:164px;">Sutter Instrument Company</td>
			<td style="width:123px;">P97</td>
			<td style="width:495px;">For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated. 
			Sutter Instrument Company</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td style="width:164px;">Mediatech</td>
			<td style="width:123px;">45000-650</td>
			<td style="width:495px;">Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Rubber bulb</td>
			<td style="width:164px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">100488-418</td>
			<td style="width:495px;">For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Sylgard 184</td>
			<td style="width:164px;">K. R. Anderson, Inc.</td>
			<td style="width:123px;">NC9659604</td>
			<td style="width:495px;">Make up according to manufacturer&#39;s instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations. 
			Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Tungsten wire 0.004 inches diameter</td>
			<td style="width:164px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:123px;">719000</td>
			<td style="width:495px;">Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. 
			A-M Systems</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ablation of a single cell from eight-cell embryos of the amphipod crustacean parhyale hawaiensis

Le hawaiensis amphipode Parhyale est un petit crustacé trouvé dans les habitats marins intertidaux à travers le monde. Au cours de la dernière décennie, Parhyale a émergé comme un organisme modèle prometteur pour les études de laboratoire de développement, fournissant une comparaison de outgroup utile pour le modèle d&#39;arthropodes bien étudié organisme Drosophila melanogaster. Contrairement aux clivages syncytial de drosophile, les premiers clivages sont des Parhyale holoblastique. cartographie destin utilisant des colorants traceurs injectés dans blastomères précoces ont montré que les trois feuillets embryonnaires et la lignée germinale sont établis par le stade de huit cellules. A ce stade, trois blastomères sont condamnées à donner naissance à l&#39;ectoderme, trois sont condamnés à donner lieu à l&#39;mésoderme, et les deux blastomères restants sont les précurseurs de la ligne de l&#39;endoderme et le germe respectivement. Cependant, les expériences d&#39;ablation blastomères ont montré que les embryons Parhyale possèdent également capabiliti réglementaire importantees, de sorte que les sorts de blastomères ablation au stade de huit cellules peuvent être prises en charge par les descendants de certains des blastomères restants. Blastomere ablation a été précédemment décrit par l&#39;une des deux méthodes: l&#39;injection et l&#39;activation subséquente de colorants phototoxiques ou ablation manuel. Cependant, photoablation tue blastomères mais ne supprime pas le corps de cellules mortes de l&#39;embryon. Élimination physique complète des blastomères spécifiques peut donc être un procédé préféré d&#39;ablation pour certaines applications. Nous présentons ici un protocole pour l&#39;enlèvement manuel de blastomères simples de la scène à huit cellules d&#39;embryons Parhyale, illustrant les instruments et les procédures manuelles nécessaires à la suppression complète du corps de la cellule tout en gardant les blastomères restants vivant et intact. Ce protocole peut être appliqué à n&#39;importe quelle cellule Parhyale au stade huit cellules, ou à d&#39;autres stades de blastomères de clivage précoce. De plus, en principe, ce protocole pourrait être applicable à CLEA tôtembryons au stade Våge d&#39;autres invertébrés marins clivage holoblastically.

Après ablation réussie de seul troisième clivage P. micromères de hawaiensis comme décrit dans ce protocole, les micromères restants passent progressivement leurs positions légèrement de manière à occuper partiellement l&#39;espace précédemment occupé par le blastomère ablation. Par exemple, lorsque g est retiré, le voisin blastomères MR et ML décaler légèrement et venez partager les bordures de cellules latérales qui étaient auparavant en contact ...

Watch this Scientific Journal Video about Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis at JoVE.com

Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

Le hawaiensis amphipode Parhyale est un organisme modèle prometteur pour l&#39;étude de l&#39;embryologie crustacé et le développement des arthropodes et l&#39;évolution comparatives. Ce protocole décrit une méthode de suppression manuelle de blastomères simples à partir d&#39;embryons à un stade préliminaire de clivage de Parhyale.

Ablation d&#39;une cellule unique de huit cellules d&#39;embryons de crustacés amphipodes les<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

The amphipod Parhyale hawaiensis is a small crustacean found in intertidal marine habitats worldwide. Over the past decade, Parhyale has emerged as a ...

ablation-single-cell-from-eight-cell-embryos-amphipod-crustacean

Research

JoVE Journal

Biology

Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

12.5K vues.  Harvard University.  Le hawaiensis amphipode Parhyale est un organisme modèle prometteur pour l'étude de l'embryologie crustacé et le développement des arthropodes et l'évolution comparatives. Ce protocole décrit une méthode de suppression manuelle de blastomères simples à partir d'embryons à un stade préliminaire de clivage de Parhyale. 

Vidéo: Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

Dissection de l&#39;organisateur et explants pôle animal à partir d&#39;embryons de Xenopus laevis et de l&#39;Assemblée d&#39;un test d&#39;adhésion cellulaire

Recherche

Biologie

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Préparation des cultures de neurones d&#39;embryons de drosophile Midgastrula scène

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual dissociations the gentleMACS Dissociator allows one to dissociate tissue very efficiently under controlled and reproducible conditions.  The gentleMACS Dissociator can optimally dissociate mouse spleen, combining timesaving and standardization with user-safety.

This video describes how to dissociate mouse spleens using the gentleMACS Dissociator, an automated bench-top device that can mechanically disrupt tissues using special tubes to produce viable cell suspensions. Following dissociation, spleens are filtered, centrifuged, and resuspended for further applications.

This video describes a simple, time-saving technique for automated tissue dissociation using the gentleMACS Dissociator to prepare single-cell suspensions of mouse splenocytes.

Préparation des suspensions unicellulaires à partir de rate de souris avec le dissociateur gentleMACS

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Single Cell Transfection in Chick Embryos

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a thorough analysis of the fates of single cells under normal and experimental conditions. To this end, transfection methods that target single progenitors are a prerequisite. We describe here a technically straightforward method for transfecting single cells in chicken tissues in-ovo, allowing reliable lineage tracing as well as genetic manipulation. Specific tissue domains are targeted within the somite or neural tube, and DNA is injected directly into the epithelium of interest, resulting in sporadic transfection of single cells. Using reporters, clonal populations may consequently be traced for up to three days, and behavior of genetically manipulated clonal populations can be compared with that of controls. This method takes advantage of the accessibility of the chick embryo along with emerging tools for genetic manipulation. We compare and discuss its advantages over the widely-used electroporation method, and possible applications and use in additional in-vivo models are also suggested. We advocate the use of this method as a significant addition and complement for existing lineage tracing and genetic interference tools.

Using fine tip micropipettes we inject plasmid DNA into subdomains of chicken somites or neural tubes. The concentration of the plasmid is adjusted to generate single transfected cells. We then allow the cells to develop into clonal populations.

La transfection seule cellule dans des embryons de poulet

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Cultures de cellules primaires à partir Drosophile Embryons Gastrula

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

Laser Ablation de l&#39;pronéphros Zebrafish d&#39;étude rénale régénération épithéliale

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Isolement et purification de la kinésine de Drosophila Embryons

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a critical yet enigmatic biological event that has been historically difficult to study due to technical and ethical limitations. Implantation is initiated by the development of the trophectoderm to early trophoblast and subsequent differentiation into distinct trophoblast sublineages. Aberrant early trophoblast differentiation may lead to implantation failure, placental pathologies, fetal abnormalities, and miscarriage. Recently, methods have been developed to allow human embryos to grow until day 13 post-fertilization in vitro in the absence of maternal tissues, a time-period that encompasses the implantation period in humans. This has given researchers the opportunity to investigate human implantation and recapitulate the dynamics of trophoblast differentiation during this critical period without confounding maternal influences and avoiding inherent obstacles to study early embryo differentiation events in vivo. To characterize different trophoblast sublineages during implantation, we have adopted existing two-dimensional (2D) extended culture methods and developed a procedure to enzymatically digest and isolate different types of trophoblast cells for downstream assays. Embryos cultured in 2D conditions have a relatively flattened morphology and may be suboptimal in modeling in vivo three-dimensional (3D) embryonic architectures. However, trophoblast differentiation seems to be less affected as demonstrated by anticipated morphology and gene expression changes over the course of extended culture. Different trophoblast sublineages, including cytotrophoblast, syncytiotrophoblast and migratory trophoblast can be separated by size, location, and temporal emergence, and used for further characterization or experimentation. Investigation of these early trophoblast cells may be instrumental in understanding human implantation, treating common placental pathologies, and mitigating the incidence of pregnancy loss.

Here, we describe a method for warming vitrified human blastocysts, culturing them through the implantation period in vitro, digesting them into single cells and collecting early trophoblast cells for further investigation.

Collection à cellule unique de cellules trophoblastiques dans les embryons humains de stade de péri-implantation

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a ...

Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The preparation of high-quality single-cell suspensions is essential for single-cell level studies such as single-cell RNA or genome sequencing. However, there is no ready-to-use protocol for aquaculture fish species, particularly for the intestine of tilapia. The effective dissociation enzymes vary depending on the tissue type. Therefore, optimizing the tissue dissociation protocol by selecting the appropriate enzyme or enzyme combination to obtain enough viable cells with minimum damage is essential. This study illustrates an optimized protocol to prepare a high-quality single-cell suspension from Nile tilapia intestine with an enzyme combination of collagenase/dispase. This combination is highly effective for dissociation with the utilization of bovine serum albumin and DNase to reduce cell aggregation after digestion. The cell output satisfies the requirements for single-cell sequencing, with 90% cell viability and a high cell concentration. This protocol can also be modified to prepare a single-cell suspension from the intestines of other fish species. This research provides an efficient reference protocol and reduces the need for additional trials in the preparation of single-cell suspensions for aquaculture fish species.

Here, we demonstrate the preparation of a high-quality single-cell suspension of tilapia intestine for single-cell sequencing.

Préparation de suspension unicellulaire de l’intestin de tilapia du Nil pour séquençage unicellulaire

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The ...

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, which is known as cellular heterogeneity. In recent years, single-cell and cell-type isolation combined with next-generation sequencing (NGS) techniques have become important tools for studying biological processes at single-cell resolution. However, isolating plant cells is relatively more difficult due to the presence of plant cell walls, which limits the application of single-cell approaches in plants. This protocol describes a robust procedure for fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based single-cell and cell-type isolation with plant cells, which is suitable for downstream multi-omics analysis and other studies. Using Arabidopsis root fluorescent marker lines, we demonstrate how particular cell types, such as xylem-pole pericycle cells, lateral root initial cells, lateral root cap cells, cortex cells, and endodermal cells, are isolated. Furthermore, an effective downstream transcriptome analysis method using Smart-seq2 is also provided. The cell isolation method and transcriptome analysis techniques can be adapted to other cell types and plant species and have broad application potential in plant science.

The feasibility and effectiveness of high-throughput scRNA-seq methods herald a single-cell era in plant research. Presented here is a robust and complete procedure for isolating specific Arabidopsis thaliana root cell types and subsequent transcriptome library construction and analysis.

Isolement et analyse transcriptome de types de cellules végétales

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...