نشكر الريحان وعارف حسان الشهاوى للعمل الكاميرا، Tripti غوبتا وFrederike Alwes للحصول على المساعدة صقل تقنية الاجتثاث الخلية، وأعضاء المختبر Extavour لردود الفعل على البيانات والفيديو والمخطوطة. وأيد هذا العمل جزئيا من قبل معهد الخلايا الجذعية في جامعة هارفارد (البذور غرانت عدد SG-0057-10-00) مؤسسة إليسون الطبية (جديد الباحث جائزة عدد AG-NS-07010-10) لفريق الخبراء الاستشاري، وجوائز برنامج بحوث كلية هارفارد ل ARN.

يشار إلى التعليقات التي قد تكون مفيدة في تنفيذ بعض الخطوات بخط مائل. 1. اليوم 1: إعداد مواد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المواد التالية (انظر الجدول المواد والمعدات): <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 15 سم و 22 سم ماصات باستور </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماس الكاتب </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية مياه البحر الاصطناعي (الملوحة بين 0،0018-0،0020) تحتوي على 1 ملغ / مل الامفوتريسين B (1:100 من محلول المخزون 100 ملغ / مل)، و 100 وحدة / مل البنسلين و 100 ملغ / مل الستربتوميسين (1:50 من محلول المخزون تحتوي على 5،000 وحدة / مل من البنسلين و 5،000 ملغ / مل من الستربتوميسين) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية مياه البحر الاصطناعي (الملوحة بين 0،0018-0،0020) دون إضافات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حاوية بلاستيكية كبيرة للأزواج الإسكان (لا يقل عن 15 سم x 15 سم x 5 سم) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (3 سم أو 5 سم) أطباق بتري صغيرة تصطف مع Sylgard </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (3 سم أو 5 سم) أطباق بتري الصغيرة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على زجاجة ساعة أو الزجاج لوحة متعددة جيدا </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المستمدة ملقط (نستخدم ملقط حادة جيئة وذهابام القديم دومون # 5 ملقط التي تضررت بطريق الخطأ في الإجراءات المختبرية الأخرى، والتي قمنا أغراض أخرى باستخدام ملقط شحذ الحجر للتأكد من أن طرفي ملقط وسلاسة، أن كلا من أسنان هي طول نفس، وأنه لم يعد لديهم نقطة حادة. ملقط غرامة للغاية، مثل دومون # 5 جديدة ملقط، غير مرغوب فيها لأنها قد تجرح الأجنة و / أو الإناث.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة باستور مع نهاية اتسعت (انظر الخطوة 1.2 أدناه) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداة استرجاع الجنين يتكون من رقيقة، سلك التنغستن منحني جزءا لا يتجزأ في نهاية رقيقة من ماصة باستور (يمكن الاستعاضة عن بديل تنفيذ، وانظر 1.3 أدناه) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة الفم مع فتحة صغيرة (انظر الخطوة 1.4 أدناه) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبرة الزجاج مصنوعة من الزجاج الشعرية سحبت (انظر الخطوة 1.5 أدناه) </li></ul> لا تستخدم مواد سامة للإنسان في هذا البروتوكول. ومع ذلك، يجب على الباحثين التأكد من أنها ارتداء القفازات أو الملابس الواقية الأخرى كما هو مطلوب من قبل جويدل إدارة المخاطرإيناس مؤسستهم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجعل باستور ماصة اتسعت، والنتيجة الأولى حول ماصة باستير 15 سم عند النقطة التي يبدأ ماصة لتضييق مع الكاتب الماس، والتفاف المنطقة وسجل من ماصة في Kimwipe أو منشفة ورقية لحماية الأصابع، ثم بعناية كسر قبالة الطرف في سطر النتيجة. عقد نهاية كسر من ماصة على لهب الموقد بنسن لعدة ثوان لضمان سلاسة حواف. وينبغي أن يكون افتتاح أضيق قليلا من أقصى عرض لها ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجعل التنغستن أداة تشريح الأسلاك، سلك التنغستن إدراج في نهاية 15 سم الزجاج ماصة باستور، وعقد لفترة وجيزة على لهب الموقد بنسن لإذابة الزجاج، وتحديد السلك في المكان. استخدام ملقط لمنحنى بلطف نهاية السلك في شكل مدمن مخدرات. انظر الشكل 3 للحصول على مثال لشكل مناسبة لهذه الأداة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجعل فتحة صغيرة للماصة الفم، وسحب نهاية رقيقة من 22 سم ماصة باستير إلى قسمين اوفإيه لهب، وقطع غيض من نهاية صغيرة. تضاف إلى نهاية حامل ماصة الفم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل إبرة الزجاج التي سيتم استخدامها لثقب عن Blastomeres من الفائدة أثناء إجراء الاجتثاث باستخدام مجتذب الإبرة. يظهر على شكل إبرة مناسبة في الشكل 4. تم سحب هذه الإبرة على ساحبة سوتر P97 إبرة باستخدام البرنامج مع المعلمات 2X (الحرارة = 566، وسحب = 100، السرعة = 20، والوقت = 250) + 1X (الحرارة = 566، وسحب = 100، السرعة = 100، الوقت = 250). برنامج محدد وأداة تستخدم لجعل إبرة يمكن أن تختلف، ولكن يجب أن يكون إبرة نقطة غرامة، ولكن أيضا يكون قوي بما فيه الكفاية على عدم كسر عندما دفعت ضد المشيماء الجنين. </li></ol> 2. يوم 1: الأزواج التجمع Parhyale التزاوج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ماصة باستير اتسعت (الخطوة 1.2 أعلاه) لجمع التزاوج P. الأزواج hawaiensis من الحاوية ثقافة كبيرة، ونقلها إلى وعاء يحتوي ج منفصلةالعجاف مياه البحر الاصطناعي. فإنه ليس من الضروري أن مياه البحر هذه تتم تصفيته. فمن الأفضل لجمع أزواج التزاوج في فترة ما بعد الظهر في وقت لاحق وترك الأزواج في درجة حرارة الغرفة (20-23 درجة مئوية) بين عشية وضحاها، لذلك ان في صباح اليوم التالي، سيكون قد تم إخصابها معظم الأجنة وأودعت مؤخرا، وبالتالي في أوائل مراحل الانقسام مناسبة ل الاجتثاث. جمع ما لا يقل عن 20 أزواج التزاوج لضمان أن بعض الإناث سيتم تنفيذ المرحلة المبكرة الانقسام الأجنة من صباح اليوم التالي. </li></ol> 3. يوم 2: التجمع Parhyale الأجنة <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في صباح اليوم التالي، ولبث تصفية مياه البحر الاصطناعي (FASW) مع CO 2. سيكون قد سبح بعض الإناث خالية من الذكور أثناء الليل؛ جمع هذه الإناث وفصل تخدير لهم في FASW / CO 2. ويمكن إزالة ما تبقى من الذكور المفردة من الحاوية الزوج التزاوج، وعاد إلى ثقافة كبيرة. يمكن حفظ أزواج التزاوج المتبقية لجمع الجنين في وقت لاحقفي اليوم أو في اليوم التالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الإناث الخدر واحدة تحمل أجنة إلى الزجاج ووتش في FASW / CO 2. ومن المرجح أن تودع جميع الإناث فصل البيض، والتي سوف تكون مرئية بالعين كما وردي شاحب أو الأرجواني الكروية من خلال لوحات وركي شفافة من الإناث (الشكل 1A). لتحديد ما إذا كانت الأجنة في مراحل الانقسام في وقت مبكر، وبالتالي مناسبة لقسيم أرومي الاجتثاث، فإن الباحث لديك لإزالة الأجنة من الحقيبة الحضنة ويفحصها تحت المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عرض إجراء تشريح تحت المجهر، فهم لوحات وركي على طول جانب واحد من الجسم مع ملقط. سوف الأجنة تكون مرئية في الحقيبة الحضنة بطني بين هذه اللوحات وركي (الشكل 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج رقيقة، والأسلاك منحني أداة (الشكل 3، خطوة 1.3 أعلاه) في نهاية الخلفي من الحقيبة الحضنة، ورفع بلطف السلك في نهاية الأمامي من الحقيبة الحضنة لفصل الحضنةفرش الحقيبة (هذه الزوائد البطنية يتم تعديل دعا oostegites 30)، وفتح الحقيبة وتخفيف الأجنة. الأجنة التي هي في غضون الساعة الأولى أو نحو ذلك من التي تزرع يتم تضمين كل ذلك ضمن رقيقة جدا، وغشاء شفاف من شأنها أن تتعطل بسهولة بواسطة أداة الأسلاك؛ يختفي هذا الغشاء قبل ما يقرب من 2-3 ساعة بعد وضع البيض، والأجنة ليست ملزمة إلى بعضها البعض أو إلى الأنثى بأي شكل من الأشكال من هذه النقطة فصاعدا طوال مرحلة التطور الجنيني. إذا كان العثور الباحثون انه غير مريح أو صعبة للمناورة الأداة الأسلاك المنحنية لإزالة الأجنة من الحقيبة الحضنة، بديلا تنفيذ يمكن استخدامها، طالما أن الحركات هي لطيف ويتم تطبيق أي ضغط قاس على الأجنة أو الحقيبة الحضنة. غيرها من الأدوات المناسبة لإزالة الأجنة من الحقيبة الحضنة تشمل ملقط اضعافها أو الزجاج الشعرية مع نهاية مختومة وممهدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام دون تغيير 15 سم باستور ماصة لطرد المياه من خلال الحقيبة الحضنة فتح، ودفع خارج رانه الأجنة، والتي ينبغي أن تستقر في الجزء السفلي من الزجاج ووتش. نقل الإناث لتنظيف FASW (دون CO 2) للسماح الانتعاش قبل إعادة تقديم لها لثقافة الرئيسي. يمكن وضعها الإناث متعددة في طبق الانتعاش نفسه، ولكن تسمح الإناث حتى يتعافى تماما قبل إعادتهم إلى الثقافة الرئيسية، لأنها قد يؤكل من قبل الحيوانات الأخرى لا تزال في حالة تخدير جزئي فيها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام دون تغيير 15 سم باستور ماصة لنقل الأجنة إلى طبق بتري مع FASW نظيفة، وعرض تحت المجهر لتحديد مراحلها الجنينية. الأجنة المنفصلة التي هي في الانقسام الثالث (المرحلة 4 5)، والتي هي مناسبة لهذا الإجراء. كما ينبغي أن يكون من الممكن تطبيق هذا البروتوكول إلى أي مرحلة الانقسام قبل تشكيل القرص الجرثومية (مراحل 07-08 مايو). </li></ul> 4. يوم 2: الذوبان خلايا واحدة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء Sylgard مبطنة طبق بيتري مع طبقة ضحلة من FASW. استخدام دون تغيير 15 سم باستور بيpette لنقل الجنين واحدة على لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط حادة، ولفة بلطف الجنين لتحديد الخلية أن يكون ذاب (أرقام 2A و 2B). مقدمة ز خط الجرثومية يمكن حصرها في أصغر قسيم مكروي، الذي يجلس على رأس أصغر قسيم كبروي MÁV. بالإضافة إلى ذلك، لا ز الاتصال مباشرة الخلية أون، والذي هو قسيم مكروي مباشرة عبر من ذلك، كما مل micromeres الأديم المتوسط ​​السلائف وحصة السيد حدود الخلية في المنتصف من الجنين. السيد هو قسيم أرومي على يمين غرام، و مل هو قسيم مكروي على يسار ز. وmacromeres شقيقة السيد، مل، وحمام هي السلائف الأديم الظاهر ايه، ش، والجيش الشعبي على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع ملقط في LEFر اليد إذا كان الباحث هو اليد اليمنى (أو في اليد اليمنى إذا أعسر الباحث)، توجيه الجنين مع الخلية التي تهم الحق (أو إلى اليسار إذا أعسر الباحث)، و فهم بلطف الجنين بين ملقط لتثبيته. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام إبرة سحب الزجاج (الخطوة 1.5 أعلاه؛ الشكل 4)، ثقب بلطف الخلية من الفائدة. لا يدخل الإبرة بعيدا جدا، حتى لا تدفع الإبرة في الخلايا المجاورة أو أسفل الخلية من الفائدة. الإبرة لديه فقط لثقب المشيماء وغشاء الخلية الأساسية، وليس بحاجة لتمديد عميقا في الخلية أن يكون ذاب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبادل إبرة تستخدم لثقب الجنين في نهاية كوب من ماصة الفم مع غرامة سحبت ماصة باستير طرف (الخطوة 1.4 أعلاه). عقد غيض من ماصة على مقربة من الحفرة التي تم إنشاؤها في الخلية من الفائدة، وتطبيق الشفط لطيف جدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جدا الضغط بلطف الجنين مع ملقط. كما محتوى الأرومةودفعت مجرد الخروج من المشيمه من خلال ثقب بإنشائه في الخطوة 4.4، أمتص له في ماصة الفم للسماح مشهدا من الجنين. إذا كانت حفرة كبيرة بما فيه الكفاية، ونواة الخلية ثقب يمكن أن ينظر إليها في الظهور أيضا. هذا هو الاختيار الجيد للتأكد من تم إزالة محتويات الخلية بأكملها ولا يمكن تجديدها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة بعناية الجنين كما يتم إزالة قسيم أرومي من الفائدة. والحدود من الخلية بثقب تنحسر نحو ثقب في المشيمه، مما يجعل من التقاطعات من الخلايا الكامنة مرئية. مواصلة الضغط حتى يتم إزالة كافة قسيم أرومي من الفائدة. استخدام ملقط للفة الجنين من جانب إلى آخر وتأكيد بصريا أن كل قسيم أرومي من الفائدة هو ذهب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام دون تغيير 15 سم باستور ماصة، ونقل الجنين لتنظيف FASW + (FASW + 1 ملغ / مل الامفوتريسين B، و 100 وحدة / مل البنسلين و 100 ملغ / مل الستربتوميسين). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع الأجنة ذاب قسيم أرومي في الآبار الفرديةنظيفة لوحة 48 جيدا في FASW +، وتغيير 50٪ من المضادات الحيوية تستكمل FASW + اليومية. في أيدينا الأجنة البقاء والتطور بشكل جيد، حتى بعد الاجتثاث، في مجموعة من درجات الحرارة 18-28 درجة مئوية. يجب على الباحثين جمع الأجنة بهم عند درجة حرارة التي لديهم سطح نظيف (ولكن ليس بالضرورة العقيمة) الذي رفع الأجنة مع الحد الأدنى من الإزعاج. لتكون قادرة على المقارنة بين توقيت الأحداث التنموية في الأجنة ذاب قسيم أرومي مع الضوابط، ونحن إحالة القارئ إلى المعلومات التدريج التنموية التفصيلية التي يتوفر الأجنة التي أثيرت في 18 º C 4، 25 º C 4، و 26 º C 5،6. </li></ol>

<ol>
	<li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3.">Chapter 3.</a> Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual Volume. , 373-404 .</li><li>Sander, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+insect+embryogenesis:+the+evolution+of+concepts+and+mechanisms.">Pattern formation in insect embryogenesis: the evolution of concepts and mechanisms.</a> Int. J.Insect Morphol. Embryol. 25, 349-367 (1997).</li><li>Regier, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthropod+relationships+revealed+by+phylogenomic+analysis+of+nuclear+protein-coding+sequences.">Arthropod relationships revealed by phylogenomic analysis of nuclear protein-coding sequences.</a> Nature. 463, 1079-1083 (2010).</li><li>Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+isolated+blastomeres+with+respect+to+germ+cell+formation+in+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">The fate of isolated blastomeres with respect to germ cell formation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 277, 387-402 (2005).</li><li>Browne, W. E., Price, A. L., Gerberding, M., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+in+the+amphipod+crustacean,+Parhyale+hawaiensis.">Stages of embryonic development in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis.</a> Genesis. 42, 124-149 (2005).</li><li>Gerberding, M., Browne, W. E., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+analysis+of+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis+reveals+an+early+restriction+of+cell+fates.">Cell lineage analysis of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis reveals an early restriction of cell fates.</a> Development. 129, 5789-5801 (2002).</li><li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+and+dissection+of+Parhyale+hawaiensis+embryos.">Fixation and dissection of Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li><li>Price, A. L., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+divergent+mechanisms+of+mesoderm+development+in+arthropods:+the+expression+of+Ph-twist+and+Ph-mef2+in+Parhyale+hawaiensis.">Investigating divergent mechanisms of mesoderm development in arthropods: the expression of Ph-twist and Ph-mef2 in Parhyale hawaiensis.</a> J. Exp. B. Dev. Evol. 310, 24-40 (2008).</li><li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+of+labeled+RNA+probes+to+fixed+Parhyale+hawaiensis+embryos.">In situ hybridization of labeled RNA probes to fixed Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li><li>Browne, W. W., Schmid, B. G. M., Wimmer, E. A., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+otd+orthologs+in+the+amphipod+crustacean,+Parhyale+hawaiensis.">Expression of otd orthologs in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Genes Evol. 216, 581-595 (2006).</li><li>Prpic, N. M., Telford, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+homothorax+and+extradenticle+mRNA+in+the+legs+of+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis:+evidence+for+a+reversal+of+gene+expression+regulation+in+the+pancrustacean+lineage.">Expression of homothorax and extradenticle mRNA in the legs of the crustacean Parhyale hawaiensis: evidence for a reversal of gene expression regulation in the pancrustacean lineage.</a> Dev. Genes Evol. 218, 333-339 (2008).</li><li>Kizil, G., Havemann, J., Gerberding, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cells+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis+depend+on+Vasa+protein+for+their+maintenance+but+not+for+their+formation.">Germ cells in the crustacean Parhyale hawaiensis depend on Vasa protein for their maintenance but not for their formation.</a> Dev. Biol. 327, 320-239 (2009).</li><li>Liubicich, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+Parhyale+Ultrabithorax+recapitulates+evolutionary+changes+in+crustacean+appendage+morphology.">Knockdown of Parhyale Ultrabithorax recapitulates evolutionary changes in crustacean appendage morphology.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13892-13896 (2009).</li><li>Pavlopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+evolution+of+appendage+specialization+by+Hox+gene+misexpression+in+an+emerging+model+crustacean.">Probing the evolution of appendage specialization by Hox gene misexpression in an emerging model crustacean.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13897-13902 (2009).</li><li>Vargas-Vila, M. A., Hannibal, R. L., Parchem, R. J., Liu, P. Z., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prominent+requirement+for+single-minded+and+the+ventral+midline+in+patterning+the+dorsoventral+axis+of+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">A prominent requirement for single-minded and the ventral midline in patterning the dorsoventral axis of the crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Development. 137, 3469-3476 (2010).</li><li>Simanton, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+arthropod+midline+netrin+accumulation+revealed+with+a+cross-reactive+antibody+provides+evidence+for+midline+cell+homology.">Conservation of arthropod midline netrin accumulation revealed with a cross-reactive antibody provides evidence for midline cell homology.</a> Evol. Dev. 11, 260-268 (2009).</li><li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+staining+of+Parhyale+hawaiensis+embryos.">Antibody staining of Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li><li>Pavlopoulos, A., Averof, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+genetic+transformation+for+comparative+developmental+studies+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">Establishing genetic transformation for comparative developmental studies in the crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7888-7893 (2005).</li><li>Kontarakis, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+strategy+for+gene+trapping+and+trap+conversion+in+emerging+model+organisms.">A versatile strategy for gene trapping and trap conversion in emerging model organisms.</a> Development. 138, 2625-2630 (2011).</li><li>Zeng, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+assembly+and+characterization+of+a+maternal+and+developmental+transcriptome+for+the+emerging+model+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">De novo assembly and characterization of a maternal and developmental transcriptome for the emerging model crustacean Parhyale hawaiensis.</a> BMC Genom. 12, 581 (2011).</li><li>Zeng, V., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASGARD:+an+open-access+database+of+annotated+transcriptomes+for+emerging+model+arthropod+species.">ASGARD: an open-access database of annotated transcriptomes for emerging model arthropod species.</a> Database. , (2012).</li><li>Nestorov, P., Battke, F., Levesque, M. P., Gerberding, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Maternal+Transcriptome+of+the+Crustacean+Parhyale+hawaiensis+Is+Inherited+Asymmetrically+to+Invariant+Cell+Lineages+of+the+Ectoderm+and+Mesoderm.">The Maternal Transcriptome of the Crustacean Parhyale hawaiensis Is Inherited Asymmetrically to Invariant Cell Lineages of the Ectoderm and Mesoderm.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li><li>Alwes, F., Hinchen, B., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+cell+lineage,+movement,+and+migration+from+germ+layer+specification+to+gastrulation+in+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">Patterns of cell lineage, movement, and migration from germ layer specification to gastrulation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 139, 110-123 (2011).</li><li>Ewen-Campen, B., Schwager, E. E., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+machinery+of+germ+line+specification.">The molecular machinery of germ line specification.</a> Mol. Reprod. Dev. 77, 3-18 (2010).</li><li>Price, A. L., Modrell, M. S., Hannibal, R. L., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesoderm+and+ectoderm+lineages+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis+display+intra-germ+layer+compensation.">Mesoderm and ectoderm lineages in the crustacean Parhyale hawaiensis display intra-germ layer compensation.</a> Dev. Biol. 341, 256-266 (2010).</li><li>Fraser, S. E., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+metamorphosis+of+experimental+embryology.">The molecular metamorphosis of experimental embryology.</a> Cell. 100, 41-55 (2000).</li><li>Olsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clash+of+traditions:+the+history+of+comparative+and+experimental+embryology+in+Sweden+as+exemplified+by+the+research+of+G&#246;sta+J&#228;gersten+and+Sven+H&#246;rstadius.">A clash of traditions: the history of comparative and experimental embryology in Sweden as exemplified by the research of G&#246;sta J&#228;gersten and Sven H&#246;rstadius.</a> Theory Biosci. 126, 117-129 (2007).</li><li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+Parhyale+hawaiensis+blastomeres+with+fluorescently+labeled+tracers.">Injection of Parhyale hawaiensis blastomeres with fluorescently labeled tracers.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li><li>Chaw, R., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+migration+of+cell+populations+in+the+early+gastrulation+of+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">Independent migration of cell populations in the early gastrulation of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 371, 94-109 (2012).</li><li>Schmitz, E. H., Harrison, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crustacea+Microscopic+Anatomy+of+Invertebrates.">Crustacea Microscopic Anatomy of Invertebrates.</a> Microscopic Anatomy of Invertebrates. 9, 443-528 (1992).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

نحن تصف بروتوكول للالاجتثاث دليل والإزالة المادية كاملة من واحد عن Blastomeres من مراحل الانقسام في وقت مبكر من amphipod P. hawaiensis. ونحن لشرح استخدام هذا البروتوكول عن طريق إزالة واحدة خط الجرثومية الخلية السلائف ز من ثماني خلايا مرحلة الجنين، وتبين أن الاجتثاث ق?...

برزت Parhyale hawaiensis amphipod القشريات على مدى العقد الماضي كنموذج كائن واعدة مع إمكانات كبيرة لاستخدامها في البحوث التطورية البيولوجيا التطورية 1. بين المفصليات، معظم أنظمة النموذج هي الحشرات، ودرس على نطاق واسع معظم هذه هي ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة السوداء البطن. D. البطن هو عضو من ذوات الجناحين أجل الحشرات، وعلى هذا النحو يعرض العديد من الميزات الجنينية التي يتم اشتقاق فيما يتعلق بتلك المتفرعة من باسالي الحشرات 2. علاوة على ذلك، يتم تداخل الحشرات داخل شعيبة Pancrustacea 3، وهذا يعني أن الحشرات لها أقرب أقربائهم داخل الجماعة منذ فترة طويلة &quot;طبيعية&quot; ودعا pancrustaceans، وأن هذه المجموعة هي paraphyletic. وهذا يشير إلى أنه بالإضافة إلى المتفرعة باسالي نماذج الحشرات، وهناك حاجة لدراسات أخرى لمن القشريات اكتساب نظرة اوسع من التاريخ التطوري للالصفات التنموية والآليات الجزيئية الثانية التي تم دراستها بشكل جيد في D. البطن. ومع ذلك، عدد قليل جدا من القشريات تم راسخة لتحليل المختبر التجريبي للتنمية. وamphipod P. hawaiensis هو نظام نموذجي مختبر لين العريكة للغاية، قابلة لمجموعة من التقنيات التجريبية. عرض مزدوجات الأرجل العديد من المزايا الفريدة داخل فوق رتبة الأم Peracarida (النطاط الشاطئ، وصواريخ سكود، والجمبري جيدا)، ولذلك يعتقد أن تستمد نسبيا ضمن هذه المجموعة من القشريات. ومع ذلك، فإن السهولة النسبية في التلاعب الجيني الجنينية والوظيفية التي توفرها Parhyale جعل هذا amphipod إضافة قيمة إلى المخزون الحالي للكائنات النموذج. كحيوان المختبر، P. hawaiensis توفر العديد من المزايا. الحيوانات متسامحون إلى مجموعة واسعة من درجات الحرارة والملوحة، والبقاء على قيد الحياة بشكل جيد في الثقافات كبيرة من مياه البحر الاصطناعي 1. فمن السهل أن نميز betwالذكور والإناث التابعين على أساس الاختلافات الشكلية واضحة، وعلى الأخص، وكبيرة، مدمن مخدرات، والزوائد الجذع الأمامي أن الذكور استخدامها لفهم الإناث أثناء التزاوج. للعمل الجنينية والتنموية، P. hawaiensis لديها العديد من الميزات جذابة جدا. مرحلة التطور الجنيني تستغرق حوالي 10 يوما والوقت لمرحلة النضج الجنسي ما يقرب من ستة أسابيع عند 28 º C (لكن لاحظ أن Parhyale ينجو جيدا في درجات حرارة تتراوح من حوالي 20-30 º C، وأن معلومات مفصلة التدريج التنموية متاح للأجنة التي أثيرت في 18 º C 4 ، 25 º C 4، و 26 º C 5،6). البالغين تتزاوج على مدار السنة في المختبر، لذلك هي الأجنة متوفرة في أي وقت من السنة. وضع الإناث 2-20 (اعتمادا على عمر الأنثى) البويضات المخصبة في الحقيبة الحضنة بطني الواقعة بين أول عدة أزواج من الأرجل (أرقام 1A و 1B)، وأنه من الممكن لجمع هذه الأجنةق في التنمية في وقت مبكر جدا من دون قتل الأنثى أو إتلاف الأجنة (الشكل 1C). الأجنة البقاء على قيد الحياة في تصفية مياه البحر الاصطناعي حتى الفقس، يمكن ان تكون ثابتة للالتعبير الجيني لاحقة أو التحليل النسيجي 7، ويسمح جدول التدريج مفصلة التحديد الدقيق للتقدم من خلال التنمية 5. وقد استخدمت بروتوكولات قوية لإجراء تحليل التعبير الجيني عن طريق الموقع التهجين أو المناعية 8-15 4،16،17 في، ضربة قاضية الوظيفية التي تدخل الحمض النووي الريبي 13،15 أو 12 morpholinos، ومستقرة خط نقل الجينات الجرثومية 18. باستخدام نظام نقل الجينات والتعبير ومحرض 14 فخ محسن ويمكن أيضا أن تستخدم أساليب 19 للتحقيق وظيفة الجين في P. hawaiensis. في حين أن تسلسل الجينوم للجمهور غير متوفر حاليا، والتي تحتوي على Transcriptome على النصوص التي تنتج أثناء التطور الجنيني وoogenesis والنحلن دي نوفو تجميعها والمشروح 20، وأودعت في قاعدة بيانات يمكن البحث 21، وتسهيل اكتشاف الجينات. باختصار، P. hawaiensis هو كائن نموذج لين العريكة للغاية ومناسبة لمناهج تجريبية وراثية متعددة لفهم التنمية. على عكس الانقسامات المخلوي في وقت مبكر من D. البطن، P. الأجنة hawaiensis يلتصق holoblastically بعد الإخصاب (الشكل 2A). وقد أظهرت نسب تحليل تتبع ذلك عن طريق الانقسام الثالث، والحظ كل من انشقاق عن Blastomeres الثالث على وجه التحديد أن تؤدي إلى واحدة من الطبقات الجرثومية الثلاث أو خط الجرثومية 6 (الشكل 2B). هذه البيانات، جنبا إلى جنب مع بيانات ميكروأري 22، نسب خلية يحلل 6،23، ولقد اقترح التجارب قسيم أرومي العزلة 4 أن الإمكانيات التنموية هي منفصلة على الأقل بعض انشقاق عن Blastomeres الثالث بالميراث غير المتماثلة من سلل المحددات مصير. وفقا لذلك، في التجارب قسيم أرومي الاجتثاث التي تمت إزالة السلائف خط الجرثومية (وهو ما يسمى &quot;ز&quot; في Parhyale النسب الخلية التسميات 6) في مرحلة الخلية الثمانية، تفتقر الأجنة الخلايا الجرثومية في المراحل التنموية في وقت لاحق 4، كما يدل على ذلك عدم وجود خلايا معربا عن البروتين فاسا، الذي هو علامة خط الجرثومية في معظم metazoans 24. في المقابل، أظهرت التجارب الجسدية الاجتثاث قسيم أرومي أن P. الأجنة hawaiensis أيضا تمتلك قدرات تنظيمية كبيرة، مثل أن مصير الأديم المتوسط ​​أو الأديم الظاهر عن Blastomeres السلائف ذاب في مرحلة الثمانية خلايا يمكن الاستيلاء عليها من قبل أحفاد بعض عن Blastomeres المتبقية 25. كيف يمكن أن يحدث التنظيمية استبدال مصير الخلية، ومدى الحكم الذاتي اعتماد مصير خلية جسدية من قبل عن Blastomeres، ما زال مجهولا. تقنيات الجنينية التجريبية مثل قسيم أرومي الاجتثاث يمكن أن تكون مفيدة في فهمهاقرع الاستقلالية النسبية وnonautonomy القرارات مصير الخلية 26،27، وبالتالي فهي ذات أهمية في دراسة P. hawaiensis مرحلة التطور الجنيني. في التجارب التي أثبتت استبدال التنظيمية من الأدمة وأرومية متوسطة الأنساب، تم تنفيذ الاجتثاث قسيم أرومي عن طريق الحقن 28 و الإثارة اللاحقة من الأصباغ الضوئية 25. في حين أن هذا الأسلوب هو فعالة في قتل قسيم أرومي حقن (ق)، فإنه لا إزالة خلايا الجسم الميتة من الجنين. بالإضافة إلى ذلك، لوحظت اختلافات بين البيانات التي تجمع من خلال النسب الخلية إلى مراحل تكون المعيدة من التطور الجنيني عن طريق حقن عن Blastomeres مع استشفاف النسب الفلورسنت 28،29، والبيانات التي جمعتها التالية عن Blastomeres رابط الجأش من خلال تطوير نفس المراحل الجنينية 23. ولذلك قد الإزالة المادية كاملة من عن Blastomeres محددة يكون الأسلوب المفضل الاجتثاث عن بعض التطبيقات. نشرنا سابقا نتائج النسب خلية تحليل الأجنة في الخلايا التي تم واحد ذاب 23 يدويا. ومع ذلك، فإن عمليات حساسة المطلوبة لإزالة واحدة من أوائل عن Blastomeres الانقسام الأجنة المرحلة لم يتم وصفها بشكل كامل. هنا نقدم بروتوكول لجمع P. الأجنة hawaiensis والاجتثاث دليل لقسيم أرومي واحد من ثمانية خلايا الجنين المرحلة. الهدف من هذا الأسلوب هو تحقيق الإزالة الكاملة للجسم خلية من الجنين، مما يتيح مراقبة السلوكيات الخلوية والكفاءات مصير خلية من الخلايا المتبقية خلال مرحلة التطور الجنيني والتنمية في مرحلة ما بعد الجنينية. يظهر لدينا بروتوكول إزالة السلائف ز خط الجرثومية (الشكل 2C)، ولكن يمكن تطبيقها على أي خلية في المرحلة ثماني خلايا، أو عن Blastomeres من مراحل الانقسام في وقت سابق. من حيث المبدأ، يمكن تطبيق هذا البروتوكول لإزالة الخلايا واحد من أوائل الأجنة مرحلة الانقسام من آلات موسيقية أخرىص الشق holoblastically اللافقاريات البحرية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1060">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">15 cm Pasteur pipette</td>
			<td style="width:164px;">Wheaton</td>
			<td style="width:123px;">53499-630</td>
			<td style="width:495px;">For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">22 cm Pasteur pipette</td>
			<td style="width:164px;">Wheaton</td>
			<td style="width:123px;">53499-632</td>
			<td style="width:495px;">For making mouth pipette tips. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">3 cm petri dishes</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">25382-334</td>
			<td style="width:495px;">Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">48-well plates</td>
			<td style="width:164px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:123px;">82051-004</td>
			<td style="width:495px;">For culturing embryos following ablation. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Bottle top filters 0.2 micron</td>
			<td style="width:164px;">Nalge Nunc International</td>
			<td style="width:123px;">28199-296</td>
			<td style="width:495px;">For creating FASW (See below) 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Bunsen burner</td>
			<td style="width:164px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">89038-530</td>
			<td style="width:495px;">For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Diamond scribe</td>
			<td style="width:164px;">Musco Sports Lighting</td>
			<td style="width:123px;">52865-005</td>
			<td style="width:495px;">For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:164px;">Forceps</td>
			<td style="width:164px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">11050-10</td>
			<td style="width:495px;">For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps - the tips can be at least as blunt as that in the forceps for which the catalogue number is listed here. 
			Fine Science Tools</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Fungizone-Amphotericin B</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">A2942</td>
			<td style="width:495px;">Add to FASW to a final concentration of 1mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. 
			Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Glass capillaries 4 inches long, 1/0.58 OD/ID (mm)</td>
			<td style="width:164px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:123px;">1B100-4</td>
			<td style="width:495px;">need to include glass capillary and needle puller machine? 
			World Precision Instruments</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Glass watchglass 300 mm diameter</td>
			<td style="width:164px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">70543-30</td>
			<td style="width:495px;">For use in removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. 
			Electron Microscopy Sciences</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW)</td>
			<td style="width:164px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:123px;">IS160</td>
			<td style="width:495px;">Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of X. 
			Aquatic EcoSystems</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW)</td>
			<td style="width:164px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:123px;">IS160</td>
			<td style="width:495px;">Use 0.2 micron filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (&#60; 250 ml) as needed. 
			Aquatic EcoSystems</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:164px;">Kimberly-Clark</td>
			<td style="width:123px;">21905-026</td>
			<td style="width:495px;">For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Mouth pipette adaptor</td>
			<td style="width:164px;">Drummond Labware</td>
			<td style="width:123px;">A5177-5EA</td>
			<td style="width:495px;">Insert the fine pulled pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure. 
			Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Mouth pipette tubing</td>
			<td style="width:164px;">Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">Z280356</td>
			<td style="width:495px;">Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure. 
			Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Needle Puller</td>
			<td style="width:164px;">Sutter Instrument Company</td>
			<td style="width:123px;">P97</td>
			<td style="width:495px;">For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated. 
			Sutter Instrument Company</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td style="width:164px;">Mediatech</td>
			<td style="width:123px;">45000-650</td>
			<td style="width:495px;">Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Rubber bulb</td>
			<td style="width:164px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">100488-418</td>
			<td style="width:495px;">For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Sylgard 184</td>
			<td style="width:164px;">K. R. Anderson, Inc.</td>
			<td style="width:123px;">NC9659604</td>
			<td style="width:495px;">Make up according to manufacturer&#39;s instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations. 
			Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Tungsten wire 0.004 inches diameter</td>
			<td style="width:164px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:123px;">719000</td>
			<td style="width:495px;">Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. 
			A-M Systems</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ablation of a single cell from eight-cell embryos of the amphipod crustacean parhyale hawaiensis

وhawaiensis amphipod Parhyale هو القشريات الصغيرة وجدت في الموائل البحرية المد والجزر في جميع أنحاء العالم. على مدى العقد الماضي، برز Parhyale كما كائن نموذج واعد للدراسات المختبرية للتنمية، وتوفير المقارنة outgroup مفيدة للمدروسة نموذج المفصلية الحي ذبابة الفاكهة السوداء البطن. وعلى النقيض من الانشقاقات المخلوي من ذبابة الفاكهة، والانشقاقات في وقت مبكر من Parhyale هي شمولي التنسج. تعيين مصير باستخدام الأصباغ التتبع حقنها في وقت مبكر عن Blastomeres أظهرت أن وضعت كل الطبقات الجرثومية الثلاث وخط الجرثومية التي كتبها المرحلة ثمانية الخلايا. في هذه المرحلة، والحظ ثلاثة عن Blastomeres أن تؤدي إلى الأديم الظاهر، ومقدر لثلاثة تؤدي إلى الأديم المتوسط، وعن Blastomeres المتبقيين هي السلائف من الأديم الباطن والجرثومية خط على التوالي. ومع ذلك، فقد أظهرت التجارب الاجتثاث قسيم أرومي أن الأجنة Parhyale أيضا تمتلك قابليات تنظيمية كبيرةوفاق، مثل أن مصائر عن Blastomeres ذاب في مرحلة ثماني خلايا يمكن الاستيلاء عليها من قبل أحفاد بعض عن Blastomeres المتبقية. وقد سبق وصفها قسيم أرومي الاجتثاث من جانب واحد من طريقتين: حقن وتفعيل لاحقة من الأصباغ الضوئية أو الاجتثاث اليدوي. ومع ذلك، جذ بالضوء يقتل عن Blastomeres ولكنه لا يزيل خلايا الجسم الميتة من الجنين. ولذلك قد الإزالة المادية كاملة من عن Blastomeres محددة يكون الأسلوب المفضل الاجتثاث عن بعض التطبيقات. هنا نقدم بروتوكول للالإزالة اليدوية للعن Blastomeres واحدة من مرحلة الثمانية خلايا الأجنة Parhyale، مما يدل على الأدوات والإجراءات اليدوية اللازمة لإزالة كاملة من خلايا الجسم مع الحفاظ على ما تبقى على قيد الحياة عن Blastomeres وسليمة. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول إلى أي خلية Parhyale في مرحلة الثمانية خلايا، أو عن Blastomeres الأخرى مراحل الانقسام في وقت مبكر. بالإضافة إلى ذلك، من حيث المبدأ هذا البروتوكول يمكن أن تطبق على الحريه في وقت مبكرvage الأجنة مرحلة أخرى اللافقاريات البحرية الشق holoblastically.

التالية الاجتثاث ناجحة من الانقسام ثالث واحد P. micromeres hawaiensis كما هو موضح في هذا البروتوكول، وmicromeres المتبقية التحول تدريجيا مواقعها قليلا وذلك لتحتل جزئيا المساحة المحتلة سابقا من قبل قسيم أرومي ذاب. على سبيل المثال، عندما تتم إزالة غرام، المجاورة ع...

Watch this Scientific Journal Video about Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis at JoVE.com

Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

وhawaiensis amphipod Parhyale هو كائن نموذج واعد للدراسات علم الأجنة القشريات والتنمية المفصلية المقارن والتطور. يصف هذا البروتوكول وسيلة لإزالة دليل عن Blastomeres احد من بداية مرحلة الانقسام الأجنة من Parhyale.

الاجتثاث من خلية واحدة من خلايا الأجنة ثمانية من القشريات Amphipod<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

The amphipod Parhyale hawaiensis is a small crustacean found in intertidal marine habitats worldwide. Over the past decade, Parhyale has emerged as a ...

ablation-single-cell-from-eight-cell-embryos-amphipod-crustacean

Research

JoVE Journal

Biology

Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

12.5K Views.  Harvard University.  وhawaiensis amphipod Parhyale هو كائن نموذج واعد للدراسات علم الأجنة القشريات والتنمية المفصلية المقارن والتطور. يصف هذا البروتوكول وسيلة لإزالة دليل عن Blastomeres احد من بداية مرحلة الانقسام الأجنة من Parhyale. 

Video: Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

تشريح المنظم وExplants القطب الحيواني من أجنة القيطم المورق وجمعية خلية الفحص الالتصاق

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

التحضير للثقافات متعلق بالخلايا العصبية من أجنة ذبابة الفاكهة المرحلة Midgastrula

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual dissociations the gentleMACS Dissociator allows one to dissociate tissue very efficiently under controlled and reproducible conditions.  The gentleMACS Dissociator can optimally dissociate mouse spleen, combining timesaving and standardization with user-safety.

This video describes how to dissociate mouse spleens using the gentleMACS Dissociator, an automated bench-top device that can mechanically disrupt tissues using special tubes to produce viable cell suspensions. Following dissociation, spleens are filtered, centrifuged, and resuspended for further applications.

This video describes a simple, time-saving technique for automated tissue dissociation using the gentleMACS Dissociator to prepare single-cell suspensions of mouse splenocytes.

إعداد وحيدة الخلية معلقات من الطحال ماوس مع Dissociator gentleMACS

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Single Cell Transfection in Chick Embryos

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a thorough analysis of the fates of single cells under normal and experimental conditions. To this end, transfection methods that target single progenitors are a prerequisite. We describe here a technically straightforward method for transfecting single cells in chicken tissues in-ovo, allowing reliable lineage tracing as well as genetic manipulation. Specific tissue domains are targeted within the somite or neural tube, and DNA is injected directly into the epithelium of interest, resulting in sporadic transfection of single cells. Using reporters, clonal populations may consequently be traced for up to three days, and behavior of genetically manipulated clonal populations can be compared with that of controls. This method takes advantage of the accessibility of the chick embryo along with emerging tools for genetic manipulation. We compare and discuss its advantages over the widely-used electroporation method, and possible applications and use in additional in-vivo models are also suggested. We advocate the use of this method as a significant addition and complement for existing lineage tracing and genetic interference tools.

Using fine tip micropipettes we inject plasmid DNA into subdomains of chicken somites or neural tubes. The concentration of the plasmid is adjusted to generate single transfected cells. We then allow the cells to develop into clonal populations.

وحيد الخلية في الأجنة ترنسفكأيشن الفرخ

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

الخلية الأولية من الثقافات ذبابة الفاكهة الأجنة المعيدة

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

تذرية الليزر للاسماك الزرد سليفة الكلوة لدراسة التجديد طلائي الكلوي

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

العزلة وتنقية كينيسين من ذبابة الفاكهة الأجنة

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

We describe here how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells, and provide some useful tips. We expect that this paper will help everyone to evaluate the degree of cellular coupling due to functional gap junctions. Everything described here could be, in principle, adapted to other fluorescent dyes with molecular weight below 1,000 Daltons.

حقن مكروي وحيدة الخلية لتحليل الاتصالات خلية

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a critical yet enigmatic biological event that has been historically difficult to study due to technical and ethical limitations. Implantation is initiated by the development of the trophectoderm to early trophoblast and subsequent differentiation into distinct trophoblast sublineages. Aberrant early trophoblast differentiation may lead to implantation failure, placental pathologies, fetal abnormalities, and miscarriage. Recently, methods have been developed to allow human embryos to grow until day 13 post-fertilization in vitro in the absence of maternal tissues, a time-period that encompasses the implantation period in humans. This has given researchers the opportunity to investigate human implantation and recapitulate the dynamics of trophoblast differentiation during this critical period without confounding maternal influences and avoiding inherent obstacles to study early embryo differentiation events in vivo. To characterize different trophoblast sublineages during implantation, we have adopted existing two-dimensional (2D) extended culture methods and developed a procedure to enzymatically digest and isolate different types of trophoblast cells for downstream assays. Embryos cultured in 2D conditions have a relatively flattened morphology and may be suboptimal in modeling in vivo three-dimensional (3D) embryonic architectures. However, trophoblast differentiation seems to be less affected as demonstrated by anticipated morphology and gene expression changes over the course of extended culture. Different trophoblast sublineages, including cytotrophoblast, syncytiotrophoblast and migratory trophoblast can be separated by size, location, and temporal emergence, and used for further characterization or experimentation. Investigation of these early trophoblast cells may be instrumental in understanding human implantation, treating common placental pathologies, and mitigating the incidence of pregnancy loss.

Here, we describe a method for warming vitrified human blastocysts, culturing them through the implantation period in vitro, digesting them into single cells and collecting early trophoblast cells for further investigation.

مجموعة خلايا واحدة من الخلايا الأرومية الترونفوبلاست في مرحلة زرع الأجنة البشرية

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a ...

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen infection or challenge with pathogen-associated chemicals (pathogen-associated molecular patterns [PAMPs]), an array of immune responses, including a ROS burst, are quickly induced in plants, which is called PAMP-triggered immunity (PTI). A ROS burst is a hallmark PTI response, which is catalyzed by a group of plasma membrane-localized NADPH oxidases-the RBOH family proteins. The vast majority of ROS comprise hydrogen peroxide (H2O2), which can be easily and steadily detected by a luminol-based chemiluminescence method. Chemiluminescence is a photon-producing reaction in which luminol, or its derivative (such as L-012), undergoes a redox reaction with ROS under the action of a catalyst. This paper describes an optimized L-012-based chemiluminescence method to detect apoplast ROS production in real-time upon PAMP elicitation in rice tissues. The method is easy, steady, standardized, and highly reproducible under firmly controlled conditions.

Here, we describe a method for the real-time detection of apoplastic reactive oxygen species (ROS) production in rice tissues in pathogen-associated molecular pattern-triggered immune response. This method is simple, standardized, and generates highly reproducible results under controlled conditions.

الكشف في الوقت الحقيقي عن إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في الاستجابة المناعية في الأرز باستخدام مقايسة التلألؤ الكيميائي

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...

الاجتثاث من خلية واحدة من خلايا الأجنة ثمانية من القشريات Amphipod

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video