Damos las gracias a Geoff Daniels para la asistencia técnica. Este trabajo fue financiado por R01 AI067946 a JSO

1. Cubreobjetos capa con anticuerpos <ol><li> Precaliente (a 37 ° C) 30 ml de RPMI 10% FCS medios y 1 ml de BD Cytofix / Cytoperm. </li><li> Preparar una solución de 5 g / ml de anticuerpo purificado en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Para la activación de la línea celular NK92, el uso de anti-CD18 y anti-NKp30 se recomienda. <ol><li> Marque una moneda de diez centavos aproximadamente círculo de tamaño para cada condición en un cubreobjetos # 1.5 utilizando un lápiz PAP. Para un experimento de doble color, debe haber cuatro condiciones: no teñidas, doble manchadas, y dos condiciones de colores individuales. Dispensar 200 l de solución de anticuerpo en cada región y se incuba a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Lavar cubreobjetos sumergiendo suavemente cada uno en 50 ml de PBS en un tubo cónico de 50 ml a temperatura ambiente. El lavado debe ocurrir inmediatamente antes de la adición de las células y se debe tener cuidado para evitar la desecación de anticuerpos en el cubreobjetos. </li></ol></li></ol> 2. Activar las células NK en la cubiertaresbalones; Fijar y permeabilizar <ol><li> Aislar 5 x 10 5 células por NK92 condición. Centrifugar y decantar el sobrenadante. Lavar una vez con 10 ml de medio precalentado desde el paso 1.1. Centrifugar y decantar el sobrenadante. <ol><li> Resuspender las células en medios precalentadas desde el paso 1.1 a una concentración de 2,5 x 10 6 / ml. </li><li> Decantar suavemente 200 l para el centro de la región creado en la sección 1.2.1. Incubar a 37 ° C durante 20 min a 5% de CO 2. (Nota: esta vez se puede ampliar o disminuir dependiendo de la función biológica de interés para Nokia gránulo de células polarización, 20 min es suficiente.). </li></ol></li><li> Después de la incubación de las células, lavar suavemente cubreobjetos mediante la inmersión de cada uno en 50 ml de temperatura ambiente PBS en un tubo cónico de 50 ml. </li><li> Añadir 1 l de Triton X-100 a 1 ml de solución de fijación / Perm precalentado desde el paso 1.1 y mezclar bien. Fijar y permeabilizar añadiendo 200 l de tampón Fix / Perm (paso 2.3) a las células. Incubar durante 10 men en la oscuridad a temperatura ambiente. </li></ol> 3. Las células de la mancha <ol><li> Prepare la tinción de tampón: tampón fosfato salino (PBS), 1% de BSA, 0,1% de saponina. <ol><li> Preparar la solución de anticuerpo primario en 200 l tampón de tinción (véase el paso 3.1). (Nota: El anticuerpo se debe ajustar antes de su uso). Evite el uso de anticuerpo primario que se plantea en las mismas especies que se utilizan para recubrir el cubreobjetos (paso 1.2). También evite vínculos Strepatividin-biotina para imágenes STED. </li><li> A raíz de la sección 2.3.1, lavar suavemente cubreobjetos en 50 ml de tinción de amortiguación. Humedezca los bordes de la región de PAP-pluma con el hisopo de algodón para eliminar el exceso de buffer. Aplique una solución de anticuerpo creado en la sección 3.1.1. Incubar 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. (Se recomienda incubar cubreobjetos en caja de portaobjetos con una toalla de papel húmeda para mantener la humedad). </li></ol></li><li> Preparar la solución de anticuerpo secundario en 200 l tincióntampón. Fluoróforos recomendados son Alexa Fluor 488, Pacific Orange y V500. En general, una dilución de 1:200 es adecuado para formación de imágenes STED. <ol><li> Lave suavemente cubreobjetos en 50 ml de tinción de amortiguación. Humedezca los bordes de la región de PAP-pluma con el hisopo de algodón para eliminar el exceso de buffer. Aplicar solución de anticuerpo secundario. Incubar 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Repita el lavado y la tinción de las proteínas de interés adicionales. Si la detección de F-actina con faloidina, este puede ser incluido con el anticuerpo secundario, en general, a una dilución 1:200. </li></ol> 4. Monte Cubreobjetos de Diapositivas <ol><li> Preparar medio de montaje. Nota: Prolong o Prolong Oro son preferibles. VECTASHIELD debe evitarse, ya que no es compatible con STED. 2,2-thiodioethanol debe ser evitado si se utiliza faloidina. Mowiol es aceptable. </li><li> Coloque aproximadamente 10-20 l de medio de montaje en una diapositiva. Cubreobjetos Invertir (célula boca abajo) y montar el cubreobjetos con cuidado, teniendo cuidado deevitar la introducción de burbujas de aire. Incubar los portaobjetos durante 24 horas (cubreobjetos hacia arriba) antes de la imagen. </li><li> Selle los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas. </li></ol> 5. Configuración Experimental <ol><li> Iniciar láseres y software necesarios. Iniciar láser agotamiento STED al 100% de potencia. Alineación de haz láser STED, que en el caso de los sistemas comerciales es a menudo un procedimiento automatizado. </li><li> Enfoque la muestra, comenzando con solo control de colores, en el microscopio utilizando oculares. </li></ol> 6. Optimización de los ajustes <ol><li> Escanear el primer canal y optimizar la potencia del láser, la posición del haz de excitación y el rango del detector. Si es posible, evitar la ganancia de&gt; 100. Para capturar la imagen en confocal para optimizar los ajustes. Línea y / o un promedio de marco aumentarán resolución. Compruebe si hay saturación de píxel. Nota: Algunos de saturación es aceptable en confocal como aplicación de STED reducirá la intensidad de la emisión. Para STED, un tamaño óptimo pixel será inferior a 30 nm cómocada vez mejor resolución se obtiene con tamaños de píxeles más pequeños. El tamaño de la región de interés se toman las radiografías dictará el límite inferior de tamaño de píxel. Tamaños de píxeles más pequeños pueden aumentar fotoblanqueo. <ol><li> Aplicar la captura de imágenes STED haz agotamiento y, a partir de un 50% la potencia del láser agotamiento. Si no se observa una mejora en la resolución, mayor potencia láser agotamiento puede ser aplicada. En esta etapa, puede ser necesario para ajustar la potencia de excitación de láser, promedio de la línea, y / o ganancia. </li><li> Aplicar gating tiempo para reducir el fondo (mínimo 0,3 ns). Ajuste la configuración hasta que una mejora en la resolución sobre confocal se puede ver. Resolución se puede aproximar mediante la estimación de ancho completo la mitad del máximo (FWHM). Esto representa la distancia en el medio de intensidad máxima de un pico gaussiano dibujo creado por un perfil de línea a través de la estructura de interés, y es un método ampliamente utilizado de la estimación de resolución. </li><li> Una vez que el primer canal es satisfactorio, iniciar una segunda secuencia para SEincidentales o de exploración. En general, lo mejor es escanear el fluoróforo de longitud de onda más larga primero. Repita el paso 6.1 en el segundo canal. </li></ol></li><li> Confirme la falta de superposición espectral por imágenes controles individuales teñidas con ambas secuencias de escaneado. Superposición espectral leve se puede corregir utilizando características espectrales de la ONU-la mezcla en el software, sin embargo debe evitarse siempre que sea posible. </li></ol> 7. Adquisición de imágenes <ol><li> Adquirir imágenes. Para cuantitativo de imágenes, se recomienda para obtener al menos 20 imágenes / condiciones. El número exacto, sin embargo, debe ser definido de acuerdo con la pregunta experimental en concierto con un enfoque estadístico, como el cálculo del tamaño de muestra. Ahorra experimento. </li></ol> 8. Deconvolution <ol><li> Abrir el archivo con el software de deconvolución o procesador por lotes. Compruebe los parámetros para cada canal mediante software. Confirme los espectros de excitación y emisión de cada canal, STED emisión agotamiento, y dirección de imágenesción (hacia arriba o hacia abajo, si la imagen es de 3 dimensiones), en particular. </li><li> Deconvoluir mediante el asistente de deconvolución. Los ajustes por defecto son generalmente adecuados, sin embargo la relación señal-ruido (SNTR) variará de un fluoróforo al fluoróforo y tendrá que ser determinado para cada canal y cada experimento individual. </li></ol>

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42-interacting+protein-4+functionally+links+actin+and+microtubule+networks+at+the+cytolytic+NK+cell+immunological.">Cdc42-interacting protein-4 functionally links actin and microtubule networks at the cytolytic NK cell immunological.</a> J. Exp. Med. 204 (10), 2305-2320 (2007).</li><li>Vicidomini, G., Moneron, G., Han, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sharper+low-power+STED+nanoscopy+by+time+gating.">Sharper low-power STED nanoscopy by time gating.</a> Nat. Methods. 8 (7), 571-573 (2011).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia. Costo de la publicación parcial de este artículo fue sufragado por Leica Microsystems, Inc.

La mejora en la resolución sobre confocal será algo que depende de factores que no pueden ser controlados. Estos factores incluyen aberraciones menores de espesor de hoja de la cubierta y de las inconsistencias en los medios de montaje. Es importante mantener la temperatura y la humedad en la sala de proyección de imagen lo más coherente posible, y el haz de STED debe ser realineado aproximadamente cada 60 min. Como se mencionó en los procedimientos, el uso de medio de montaje VECTASHIELD se debe evitar, ya que no es compatible con STED. Además de que, se debe utilizar siempre # 1.5 cubreobjetos, y si está disponible, utilice las que se han verificado hasta un grosor específico. Una modificación del método descrito aquí es a imagen canales adicionales en confocal, usando fluoróforos que emiten a una longitud de onda más largo que el haz de STED. De esta manera, una imagen puede hasta cuatro canales (dos en confocal, dos en STED). Si toma este enfoque, sin embargo, los canales con fluoróforos enecesitará mitting encima del láser agotamiento STED a ser fotografiado primera, como la aplicación del haz de STED agotará fotones en estos canales. Una ventaja de esta técnica es la aplicación de compuerta tiempo, que también mejorar la resolución en confocal mediante la eliminación de las emisiones de fotones con tiempos de vida cortos 34. En particular, el uso de compuerta tiempo, el momento de detectores de emisión para corresponder con excitación pulsada STED, disminuirá la fluorescencia de fondo de la reflexión de vidrio cubreobjetos cuando formación de imágenes cerca de ella. Incluso en un experimento no es adecuado para STED, si se utiliza una fuente de excitación pulsada, el bloquear el tiempo puede ser una herramienta útil para mejorar la resolución en confocal. Hay diversas modificaciones que pueden ser utilizados para mejorar la resolución en STED. Una de ellas es para disminuir el tamaño del agujero de alfiler de la unidad 1 de Airy estándar, aunque esto también disminuirá la cantidad de luz que llega a la muestra. Esto puede ser compensado mediante el aumento de laspoder er o ganancia. Otra es la de aumentar la media de la línea, lo que aumentará la cantidad de información recopilada por cada fotón, la mejora de resolución. Una vez más, sin embargo, esto puede ser a costa de photobleaching de la muestra, por lo que se necesita un equilibrio necesario entre la resolución y el blanqueo. Del mismo modo, el uso de proteínas fluorescentes, tales como GFP requerirá la optimización cuidadosa para evitar la decoloración. Esto se puede lograr por la disminución de la potencia del láser STED si es necesario. Puntos de tiempo más largos también permitirán una mayor recuperación de fotones y reducir la decoloración. Corrección por fotoblanqueo debe contabilizarse al analizar STED vivo. Por supuesto, de formación de imágenes en 3 dimensiones en STED también es posible, y también dará una mejora sobre la imagen confocal convencional. Esto es particularmente cierto si se hace en combinación con deconvolución, aunque se debe tener cuidado para corregir la deriva que se produce durante la formación de imágenes múltiples planos en el eje z. Si el uso de software de Huygensa deconvoluir, se obtiene esta corrección utilizando la función de &quot;estabilizar la imagen.&quot; Usando este enfoque, se puede mejorar la resolución en el eje z. Esta es una gran mejora con respecto a la imagen confocal convencional, que tiene una pobre resolución axial, e incluso más de sólo Sted en sí, que también tiene relativamente pobre resolución eje z. Si bien la adquisición de varias pilas en STED, se debe tener cuidado para evitar el blanqueo de la muestra, y si uno es necesario puede reducir un promedio de línea o la intensidad de potencia del láser con el fin de hacerlo. Una vez más, hay que señalar que si otros fluoróforos formación de imágenes que no son adecuados para STED, la aplicación del haz de agotamiento en la primera exploración secuencial sería evitar la emisión de estos canales. Por lo tanto, un enfoque STED / confocal mixta (cuando se utiliza confocal de barrido en canales que emiten en una longitud de onda mayor que 592 nm) será por desgracia no ser adecuado para 3D. En resumen, hemos elegido STED como un acercamiento debido a su relativa facilidad de aplicacióncación y la mejora en la resolución sobre la imagen confocal estándar. Para obtener imágenes de la sinapsis inmune, se ha demostrado una técnica eficaz y valioso que nos permite ver los detalles de la arquitectura no es posible la actina F con una resolución de más de 200 nm. Mientras que muchos de estos detalles parecer sutiles, que pueden tener un profundo efecto sobre la función de las células NK. Por lo tanto, estamos aplicando la última tecnología de imagen nanoscópico para derivar información que es fundamental para el mantenimiento de la salud humana.

La sinapsis inmunológica es un complejo entorno de las proteínas de señalización y elementos del citoesqueleto. La sinapsis citolítica fue originalmente descrito como teniendo un &quot;ojo de buey&quot; como la estructura con un anillo de actina y moléculas de adhesión que rodean un dominio secretora Central 1-4. Sin embargo, ahora sabemos que se compone de dominios microscópicos de señalización activa que requieren continua reorganización del citoesqueleto dinámico para la función 5-11. Mucha de la información que ahora tenemos sobre la sinapsis viene de la microscopía, y los inmunólogos han sido los primeros en adoptar la tecnología de imagen de vanguardia. Una de estas tecnologías novela es super-resolución de la microscopía. Microscopía de luz convencional está espacialmente limitado por la barrera de la difracción de la luz, que establece el límite inferior de la resolución para todos microscopía de fluorescencia, incluyendo confocal, aproximadamente a 200 nm. En los últimos años, varias técnicas han sido developed que permiten la resolución por debajo de la barrera de la difracción. Estos incluyen la estimulación de emisión de agotamiento de microscopía (STED), microscopía iluminación estructurada (SIM), microscopía resuelto estocásticamente (TORMENTA) y microscopía de luz fotoactivable (PALM). Estas técnicas se han revisado en detalle en otra parte 12 a 15, sino que se indica a continuación. Resolución limitada Subdiffraction se genera de una forma única en cada sistema. La selección de una técnica de super-resolución, por lo tanto, debe ser dictado por el experimento y el sistema experimental de interés. Súper resolución STED se logra utilizando una alta intensidad toroidal haz agotamiento que selectivamente &quot;silencios&quot; de fluorescencia alrededor de cada fluoróforo de interés después de la excitación, lo que resulta en subdiffraction limitada microscopía de fluorescencia 16-18. Una ventaja de STED es que la adquisición de imágenes es rápida y requiere relativamente poca post-procesamiento. Mientras que la selección de colorante está dictada por la especificacióntral posición del haz de agotamiento, que en el sistema comercialmente disponible se sitúa en 592 nm, varios colorantes disponibles comercialmente disponibles que hacer combinaciones de dos fluoróforos posible. Además, los reporteros fluorescentes comúnmente utilizados, tales como GFP se pueden obtener imágenes, por lo que los experimentos de células vivas posible 19,20. Hemos utilizado anteriormente STED para identificar y cuantificar regiones de hipodensidad F-actina que son utilizados por las células NK para la desgranulación de 21,22. Proponemos que STED es una buena opción para obtener imágenes de la sinapsis inmune debido a su disponibilidad relativamente flexible de fluoróforos y mejora superior en una resolución en el eje xy. Además, en el sistema de STED disponibles comercialmente utilizado para estos experimentos, el uso de un escáner de resonancia de alta velocidad (12.000 Hz) permite la adquisición rápida de imágenes con un daño mínimo a las muestras. Flexibilidad limitada en la selección del tinte se considera una desventaja de STED 12,Sin embargo dos colores STED es relativamente sencillo con varios fluoróforos disponibles en el mercado. La integración de STED con un microscopio confocal de barrido con láser también permite la formación de imágenes confocal adicional en combinación con STED, así que mientras STED se limita a dos canales, estructuras adicionales se pueden obtener imágenes en confocal con la resolución de aproximadamente 200 nm (E. Mace, observaciones no publicadas ). Mientras que se describe el uso de STED para obtener imágenes de las células inmunes, esta tecnología se aplicó a una variedad de tipos celulares, incluyendo células neuronales, y para la visualización de una variedad de estructuras celulares 23-26. SIM utiliza un método diferente para generar imágenes subdiffraction limitado. Mediante la visualización de patrones de excitación periódica conocidos, a continuación, la información puede obtenerse sobre la estructura desconocida en estudio después de la transformación matemática 27. Esto produce un aumento de la resolución de ~ 100 nm lateralmente 28,29. La ventaja de SIM es que is compatible con todos los colorantes confocal estándar y sondas, sin embargo, la desventaja es que es mucho más lento para adquirir imágenes y estos requiere un largo periodo de post-procesamiento 12. Esto también limita su uso para imágenes de células vivas. Por último, las imágenes de super-resolución pueden ser generados por estocástico foto conmutación de fluoróforos. Este enfoque es explotada en fotoactivado localización microscopía (PALM) y microscopía óptica reconstrucción estocástica (TORMENTA). Mediante la exploración de varios fotogramas de la cámara y la localización de moléculas activadas al azar que se activa &quot;On&quot; y &quot;off&quot; con el tiempo, las imágenes con una resolución de 20-30 nm se generan a partir de fotogramas acumulados 30-32. El trade-off de esta resolución es el tiempo necesario para adquirir imágenes. Aquí se muestra, en detalle, el protocolo para la preparación y muestras de imágenes de dos colores en STED. En este sistema, la excitación es con una, sintonizables, laser luz blanca pulsante. Debido a la naturalezadel haz de excitación pulsada, se hace posible gating momento de la detección y resolución de nuevos aumentos. Además, el sistema está equipado con gadolinio híbrido (HYD) detectores, que son más sensibles que los tubos fotomultiplicadores convencionales, permitiendo de este modo los requisitos de energía de láser inferiores. El haz de agotamiento para STED se aplica continuamente y está sintonizado a 592 nm, que dictará la elección de colorantes disponibles para dos colores STED. Combinaciones de colorantes más utilizados generalmente incluyen uno excitable por 488 nm (como Alexa Fluor 488, Oregon Green, DyLights verdes o Chromeo 488) y uno excitable por 458 nm (como el Pacífico o naranja Horizonte V500). Por lo tanto, mientras que la detección de los dos colorantes estará en un rango similar (y ambos son accesibles por el láser agotamiento), de excitación se produce con diferentes longitudes de onda. Con unos detectores láser sintonizables luz y sintonizables blancas, lo que maximiza la señal al tiempo que elimina la superposición espectral se hace bastante fácil. Como tal, hemos tenido buen éxito con combinationes de colorantes disponibles comercialmente, tales como Naranja Pacífico y Alexa Fluor 488 (utilizado aquí). Nuestro protocolo se adapta hacia y describe la evaluación de células NK humanas como que representa el enfoque histórico de nuestro laboratorio. Estamos utilizando específicamente la línea celular NK92 en este ejemplo, ya que es uno que hemos aplicado con regularidad en nuestra 21,33 trabajo experimental.

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:602px;" width="602">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:230px;">#1.5 cover slips</td>
			<td style="width:222px;">VWR</td>
			<td style="width:150px;">48393-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">BD Cytofix/Cytoperm</td>
			<td style="width:222px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:150px;">554722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:222px;">Sigma</td>
			<td style="width:150px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Cotton tipped applicator</td>
			<td style="width:222px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">S450941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Falcon centrifuge tubes (50 ml)</td>
			<td style="width:222px;">VWR</td>
			<td style="width:150px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Fetal calf serum (FCS) (500 mL)</td>
			<td style="width:222px;">Atlantic Biologicals</td>
			<td style="width:150px;">S11050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Goat anti-rabbit Pacific Orange</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">P31584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Laboratory tissue wipers</td>
			<td style="width:222px;">VWR</td>
			<td style="width:150px;">82003-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Nail polish</td>
			<td style="width:222px;">VWR</td>
			<td style="width:150px;">100491-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">NK-92 cells</td>
			<td style="width:222px;">ATCC</td>
			<td style="width:150px;">CRL-2407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Phalloidin Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Prolong anti-fade reagent</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">P7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Purified anti-CD18</td>
			<td style="width:222px;">Biolegend</td>
			<td style="width:150px;">301202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Purified anti-NKp30</td>
			<td style="width:222px;">Biolegend</td>
			<td style="width:150px;">325202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Purified anti-perforin</td>
			<td style="width:222px;">Biolegend</td>
			<td style="width:150px;">308102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">RPMI 1640 medium (500 mL)</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Saponin from Quillaja bark</td>
			<td style="width:222px;">Sigma</td>
			<td style="width:150px;">S4521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Super PAP pen</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">008899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:222px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:150px;">22142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:27px;">Material Name</td>
			<td style="height:27px;">Company</td>
			<td style="height:27px;">Catalogue Number</td>
			<td style="height:27px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:27px;">Huygens deconvolution software</td>
			<td style="height:27px;">SVI</td>
			<td style="height:27px;">Contact company</td>
			<td style="height:27px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:27px;">Leica SP8 TCS STED microscope</td>
			<td style="height:27px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="height:27px;">Contact company</td>
			<td style="height:27px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (sted) nanoscopy

Las células asesinas naturales forman fuertemente reguladas, las sinapsis inmunológicas finamente sintonizados (SI) con el fin de lisar las células infectadas por virus o tumorigénicos. Reorganización de la actina dinámica es crítica para la función de las células NK y la formación de la SI. Imágenes de F-actina en la sinapsis ha utilizado tradicionalmente la microscopía confocal, sin embargo, el límite de difracción de la luz limita la resolución de la microscopía de fluorescencia, incluyendo confocal, a aproximadamente 200 nm. Los recientes avances en la tecnología de imágenes han permitido el desarrollo de la imagen de super-resolución limitada subdiffraction. Con el fin de visualizar la arquitectura de F-actina en el SI recapitulamos el NK citotóxica de las células de la sinapsis al adherirse las células NK para la activación del receptor en el vidrio. A continuación, las proteínas de imagen de interés usando dos colores agotamiento de la emisión estimulada de microscopía (STED). Esto da como resultado &lt;80 nm resolución en la sinapsis. Aquí se describe los pasos de preparación de muestras y la adquisición de imágenes mediante doble colo STED nanoscopía visualizar F-actina en el NK ES. También ilustramos la optimización de la adquisición de la muestra utilizando el software SP8 Leica y el tiempo-dependientes STED. Por último, utilizamos software Huygens para el post-procesamiento de deconvolución de imágenes.

Está claro que el objetivo principal de las imágenes de super-resolución será una mejora con respecto a la microscopía confocal convencional. Sin embargo, hay algunos errores comunes que pueden conducir a la resolución óptima. Esto requiere que cada experimento optimizarse individualmente. En nuestro experimento representativo, estamos Imaging la red F-actina en una célula NK activadas por el anticuerpo unido al vidrio. Las causas comunes de (y correcciones para) la falta de resolución mejorada de STED sobre confocal son los siguientes: <ol><li> Sub-muestreo (Figura 1a). Esto puede conducir a la granularidad y la pérdida de información de los píxeles, como se muestra por la mala resolución de los filamentos de F-actina. El aumento de la línea o un promedio de marco a menudo pueden corregir esto. </li><li> Blanqueo y / o sobre-muestreo (Figura 1b). Esto puede ser causado por píxel largo tiempo de permanencia como resultado de la excesiva de la línea de promediado. Alternativamente, puede ser un resultado de la exploración sobre-de la imagen antes de la adquisición, incluyendo el uso excesivo deel láser agotamiento. Esto se traduce comúnmente en las imágenes confusas o difusas. Esto se puede corregir mediante el escaneo de la campo de interés sólo mínimamente antes de adquirir o, si es posible, aumentar la velocidad de exploración láser. Si el problema persiste, la potencia del láser agotamiento puede ser reducido. </li></ol> Al lograr el equilibrio correcto de tiempo de permanencia de píxeles, la potencia del láser de excitación, y la potencia del láser agotamiento, una imagen con una mejor resolución y la información que pueda generarse suficiente (Figura 1c). Resolución se puede mejorar aún más por el uso de deconvolución (Figura 1d). Cuando se optimiza la adquisición, deconvolución mejorará la resolución, tanto cualitativa como cuantitativamente, y debajo de los 100 nm de resolución debe ser evaluada alcanzable. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51100/51100fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51100/51100fig1.jpg" /> Figura 1. Optimización de la adquisición y errores comunes de imágenes STED. NK92 células se activaron el anti-CD18 y NKp30 vidrio recubierta durante 20 minutos después se fijaron, permeabilizaron y se tiñeron para F-actina con faloidina Alexa Fluor 488. A) Un ejemplo de pérdida de información de imagen debido a. b submuestreo) Un ejemplo de la pérdida de resolución debido al blanqueamiento / sobremuestreo c) las condiciones d optimizado) condiciones optimizadas conducen a una mayor mejora en la resolución de deconvolución. Barra de escala = 5 micras.

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Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Aquí se ilustra el protocolo para obtener imágenes de dos colores STED nanoscopía la sinapsis inmune citotóxica de las células NK recapitulado sobre vidrio. Con este método se obtiene la resolución nm sub-100 de las proteínas de la sinapsis y el citoesqueleto.

La visualización de la sinapsis inmunológica mediante gated-Tiempo color dual Emisión Estimulada de Agotamiento (STED) Nanoscopia

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

77.9K vistas.  Texas Children's Hospital and Baylor College of Medicine.  Aquí se ilustra el protocolo para obtener imágenes de dos colores STED nanoscopía la sinapsis inmune citotóxica de las células NK recapitulado sobre vidrio. Con este método se obtiene la resolución nm sub-100 de las proteínas de la sinapsis y el citoesqueleto. 

Video: Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

El agotamiento de las poblaciones de células específicas por el agotamiento del complemento

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Investigación

Inmunología e Infección

Facilitating the Analysis of Immunological Data with Visual Analytic Techniques

Visual analytics (VA) has emerged as a new way to analyze large dataset through interactive visual display. We demonstrated the utility and the flexibility of a VA approach in the analysis of biological datasets. Examples of these datasets in immunology include flow cytometry, Luminex data, and genotyping (e.g., single nucleotide polymorphism) data. Contrary to the traditional information visualization approach, VA restores the analysis power in the hands of analyst by allowing the analyst to engage in real-time data exploration process. We selected the VA software called Tableau after evaluating several VA tools. Two types of analysis tasks analysis within and between datasets were demonstrated in the video presentation using an approach called paired analysis. Paired analysis, as defined in VA, is an analysis approach in which a VA tool expert works side-by-side with a domain expert during the analysis. The domain expert is the one who understands the significance of the data, and asks the questions that the collected data might address. The tool expert then creates visualizations to help find patterns in the data that might answer these questions. The short lag-time between the hypothesis generation and the rapid visual display of the data is the main advantage of a VA approach.

Visual analytics (VA) is a new approach of analyzing data interactively. In this video, we discuss the data overload problem brought on by high-throughput biological experiments, and propose VA as a solution to such problem. The video demonstrates analysis within and between immunological datasets using a VA tool called Tableau.

Facilitar el análisis de los datos inmunológicos con Visual técnicas analíticas

Visual analytics (VA) has emerged as a new way to analyze large dataset through interactive visual display. We demonstrated the utility and the ...

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Macrophages are critical players in the innate immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune response and directing the acquired immune response. Macrophage dysfunction can lead to an inability to mount an appropriate immune response and as such, has been implicated in many disease processes, including inflammatory bowel diseases. Macrophages display polarized phenotypes that are broadly divided into two categories. Classically activated macrophages, activated by stimulation with IFN&gamma; or LPS, play an essential role in response to bacterial challenge whereas alternatively activated macrophages, activated by IL-4 or IL-13, participate in debris scavenging and tissue remodeling and have been implicated in the resolution phase of inflammation. During an inflammatory response in vivo, macrophages are found amid a complex mixture of infiltrating immune cells and may participate by exacerbating or resolving inflammation. To define the role of macrophages in situ in a whole animal model, it is necessary to examine the effect of depleting macrophages from the complex environment. To ask questions about the role of macrophage phenotype in situ, phenotypically defined polarized macrophages can be derived ex vivo, from bone marrow aspirates and added back to mice, with or without prior depletion of macrophages. In the protocol presented here clodronate-containing liposomes, versus PBS injected controls, were used to deplete colonic macrophages during dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis in mice. In addition, polarized macrophages were derived ex vivo and transferred to mice by intravenous injection. A caveat to this approach is that clodronate-containing liposomes deplete all professional phagocytes, including both dendritic cells and macrophages so to ensure the effect observed by depletion is macrophage-specific, reconstitution of phenotype by adoptive transfer of macrophages is necessary. Systemic macrophage depletion in mice can also be achieved by backcrossing mice onto a CD11b-DTR background, which is an excellent complementary approach. The advantage of clodronate-containing liposome-mediated depletion is that it does not require the time and expense involved in backcrossing mice and it can be used in mice regardless of the background of the mice (C57BL/6, BALB/c, or mixed background).

Macrophages play a central role in homeostasis and pathology in many tissues. The protocol presented here describes methods for depleting macrophages in vivo, deriving polarized macrophages from bone marrow aspirates, and adoptively transferring macrophages into mice. These techniques allow determination of the role that polarized macrophages play in health and disease.

El agotamiento y la reconstitución de los macrófagos en ratones

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

El colesterol de los macrófagos agotamiento y su efecto sobre la fagocitosis de<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer's attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.

We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

Super-resolución de imagen de la célula Natural Killer inmunológica Synapse en un apoyada-Glass planar bicapa lipídica

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological synapses&#39;. Within these intimate cell-cell interfaces discrete sub-cellular clusters of MHC/Ag-TCR, F-actin, adhesion and signaling molecules form and remodel rapidly. These dynamics are thought to be critical determinants of both the efficiency and quality of the immune responses that develop and therefore of protective versus pathologic immunity. Current understanding of immunological synapses with physiologic APCs is limited by the inadequacy of the obtainable imaging resolution. Though artificial substrate models (e.g., planar lipid bilayers) offer excellent resolution and have been extremely valuable tools, they are inherently non-physiologic and oversimplified. Vascular and lymphatic endothelial cells have emerged as an important peripheral tissue (or stromal) compartment of &#39;semi-professional APCs&#39;. These APCs (which express most of the molecular machinery of professional APCs) have the unique feature of forming virtually planar cell surface and are readily transfectable (e.g., with fluorescent protein reporters). Herein a basic approach to implement endothelial cells as a novel and physiologic &#39;planar cellular APC model&#39; for improved imaging and interrogation of fundamental antigenic signaling processes will be described.

Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

Un modelo de la célula endotelial planar for Imaging inmunológica Synapse Dinámica

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins towards the immune synapse to assure a stable binding and signal exchange. Classical confocal, TIRF, or super-resolution microscopy have been used to study the immune synapse. Since these methods require manual image acquisition and time-consuming quantification, the imaging of rare events is challenging. Here, we describe a workflow that enables the morphological analysis of tens of thousands of cells. Immune synapses are induced between primary human T cells in pan-leukocyte preparations and Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB)-loaded Raji cells as APCs. Image acquisition is performed with imaging flow cytometry, also called In-Flow microscopy, which combines features of a flow cytometer and a fluorescence microscope. A complete gating strategy for identifying T cell/APC couples and analyzing the immune synapses is provided. As this workflow allows the analysis of immune synapses in unpurified pan-leukocyte preparations and hence requires only a small volume of blood (i.e., 1 mL), it can be applied to samples from patients. Importantly, several samples can be prepared, measured, and analyzed in parallel.

Here, we describe a complete workflow for the qualitative and quantitative analysis of immune synapses between primary human T cells and antigen-presenting cells. The method is based on imaging flow cytometry, which allows the acquisition and evaluation of several thousand cell images within a relatively short period of time.

Análisis cualitativo y cuantitativo de la sinapsis inmune en el sistema humano utilizando imágenes de citometría de flujo

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy

B cells that bind to membrane-bound antigens (e.g., on the surface of an antigen-presenting cell) form an immune synapse, a specialized cellular structure that optimizes B-cell receptor (BCR) signaling and BCR-mediated antigen acquisition. Both the remodeling of the actin cytoskeleton and the reorientation of the microtubule network towards the antigen contact site are essential for immune synapse formation. Remodeling of the actin cytoskeleton into a dense peripheral ring of F-actin is accompanied by polarization of the microtubule-organizing center towards the immune synapse. Microtubule plus-end binding proteins, as well as cortical plus-end capture proteins mediate physical interactions between the actin and microtubule cytoskeletons, which allow them to be reorganized in a coordinated manner. Elucidating the mechanisms that control this cytoskeletal reorganization, as well as understanding how these cytoskeletal structures shape immune synapse formation and BCR signaling, can provide new insights into B cell activation. This has been aided by the development of super-resolution microscopy approaches that reveal new details of cytoskeletal network organization. We describe here a method for using stimulated emission depletion (STED) microscopy to simultaneously image actin structures, microtubules, and transfected GFP-tagged microtubule plus-end binding proteins in B cells. To model the early events in immune synapse formation, we allow B cells to spread on coverslips coated with anti-immunoglobulin (anti-Ig) antibodies, which initiate BCR signaling and cytoskeleton remodeling. We provide step-by-step protocols for expressing GFP fusion proteins in A20 B-lymphoma cells, for anti-Ig-induced cell spreading, and for subsequent cell fixation, Immunostaining, image acquisition, and image deconvolution steps. The high-resolution images obtained using these procedures allow one to simultaneously visualize actin structures, microtubules, and the microtubule plus-end binding proteins that may link these two cytoskeletal networks.

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy

We present a protocol for using STED microscopy to simultaneously image actin structures, microtubules, and microtubule plus-end binding proteins in B cells that have spread on coverslips coated with antibodies to the B-cell receptor, a model for the initial phase of immune synapse formation.

Visualización de la actina y los microtúbulos citoesqueletos en la sinapsis inmune de células B mediante microscopía de emisión (STED) el agotamiento

B cells that bind to membrane-bound antigens (e.g., on the surface of an antigen-presenting cell) form an immune synapse, a specialized cellular structure ...

Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both signaling&#160;and antigen uptake are coordinated. IS formation involves dynamic actin remodeling accompanied by the polarized recruitment to the synaptic membrane of the centrosome and associated intracellular organelles such as lysosomes and the Golgi apparatus. Initial stages of actin remodeling allow B cells to increase their cell surface and maximize the quantity of antigen-BCR complexes gathered at the synapse. Under certain conditions, when B cells recognize antigens associated to rigid surfaces, this process is coupled to the local recruitment and secretion of lysosomes, which can facilitate antigen extraction. Uptaken antigens&#160;are internalized into specialized endo-lysosome compartments for processing into peptides, which are loaded onto major histocompatibility complex II (MHC-II) molecules for further presentation to T helper cells. Therefore, studying organelle dynamics associated with the formation of an IS is crucial to understanding how B cells are activated. In the present article we will discuss both imaging and a biochemical technique used to study changes in intracellular organelle positioning and cytoskeleton rearrangements that are associated with the formation of an IS in B cells.

Herein we describe two approaches to characterize cell polarization events in B lymphocytes during the formation of an IS. The first, involves quantification of organelle recruitment and cytoskeleton rearrangements at the synaptic membrane. The second is a biochemical approach, to characterize changes in composition of the centrosome, which undergoes polarization to the immune synapse.

Estudio de la dinámica de los organelos en células B durante la formación de la sinapsis inmune

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both ...

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF)

Elimination of harmful antibodies from organisms is a valuable approach for the intervention of antibody-associated diseases, such as Dengue hemorrhagic fever and autoimmune diseases. Since thousands of antibodies with different epitopes are circulating in blood, no universal method, except for the dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF), was reported to target specific harmful antibodies. The development of DCAF molecules makes significant contribution to the progress of targeted therapy, which were demonstrated to eliminate the antibody dependent enhancement (ADE) effect in a Dengue virus (DENV) infection model and to boost the acetylcholine receptor activity in a myasthenia gravis model. Here, we describe a protocol for the synthesis of a DCAF molecule (DCAF1), which can selectively block 4G2 antibody to attenuate ADE effect during Dengue virus infection, and illustrate the binding of DCAF1 to 4G2 antibody by an ELISA assay. In our method, DCAF1 is synthesized by the conjugation of a hydrazine derivative of a Fc-III peptide and a recombinant expressed long &#945;-helix with antigenic sequence through native chemical ligation (NCL). This protocol has been successfully applied to DCAF1 as well as other DCAF molecules for targeting their cognate antibodies.

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics DCAF

Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) is novel for the elimination of harmful antibodies. Here, we describe a detailed protocol for the synthesis of DCAF1 molecule, which can selectively block 4G2 antibody to eliminate antibody dependent enhancement effect during Dengue virus infection.

Bloqueo de anticuerpos dirigido por un conjugado dual-funcional de péptido antigénico y méticos Fc-III (DCAF)

Elimination of harmful antibodies from organisms is a valuable approach for the intervention of antibody-associated diseases, such as Dengue hemorrhagic ...