En esta revisión, discutiremos tanto las técnicas de imagen como las bioquímicas utilizadas para estudiar el posicionamiento y la composición del orgánulo, así como los reordenamientos de citoesqueleto observados durante la formación de una sinapsis inmunológica. Las etapas iniciales de remodelación activa permiten a las células B aumentar su superficie celular y maximizar la cantidad de complejos de BCR de antígeno reunidos en la sinapsis. Por otro lado, el reclutamiento local de lisosomas, junto con el centrooma en la membrana sináptica, se puede acoplar a la secreción lisosoma, que se sabe para facilitar la extracción de antígenos inmovilizados.
El antígeno de absorción se procesa más dentro de compartimentos de endolitosomas en péptidos, que se cargan en moléculas MHC clase II para su presentación a las células auxiliares T. Por lo tanto, estudiar la dinámica del orgánulo asociada a la sinapsis inmune es crucial para entender cómo se activan completamente las células B. La inmunofluorescencia de las células B activadas con antígenos inmovilizados nos permite seguir diferentes componentes celulares y cómo pueden ser reclutados para la sinapsis inmune.
Las células B se pueden activar a través de antígenos inmovilizados en una superficie de cordón o una superficie de cubreobjetos. Las perlas recubiertas de antígeno se preparan incubando ligandos específicos con amino-perlas previamente tratadas con glutaraldehído para activar grupos amino. Resuspend cuentas activadas en 100 microlitros de PBS y vórtice.
Mientras tanto, preparar la solución de antígeno añadiendo 100 microgramos por ml de ligando BCR en 150 microlitros de PBS. A continuación, añadir 50 microlitros de perlas activadas a la solución de antígeno e incubar durante la noche a cuatro grados centígrados. Recuerde, también use un ligando no relacionado como control negativo.
Después de la incubación, lave las cuentas con PBS. Aspirar el sobrenadante y reemplazarlo con PBS. Repita tres veces.
A continuación, bloquear los tres grupos amino por perlas resuspendidas en 500 microlitros de una solución de BSA. Finalmente, resuspend cuentas en 70 microlitros de PBS. Para calcular la concentración final, puede utilizar un hemociclokómetro para contar las cuentas.
Para la activación de células B, utilice un tubo de 50 ml y células resuspend a una concentración de 1,5 millones por ml en CLICK complementado con 5% de suero bovino fetal. A continuación, agregue 150.000 células B, correspondientes a 100 microlitros de la mezcla de cuentas celulares a un cubreobjeto recubierto de poli-L-lisina ad incubar a 37 grados para los diferentes puntos de tiempo. Un segundo enfoque para activar las células B es sembrarlas en cubreobjetos recubiertos de antígenos.
Para ello, los portaobjetos con anti-BCR y B220 con mejora la adherencia celular. Preparar la solución de antígeno añadiendo anti-BRC y B220 en PBS a una concentración final de 10 microgramos por ml y 0,5 microgramos por ml, respectivamente. A continuación, ajuste el cubreobjetos sobre una tapa de 24 pozos cubierto con película parafilm y agregue 40 microlitros de solución de antígeno.
Selle la placa y luego incubar a 4 grados durante la noche. Para iniciar la activación en el cubreobjetos, primero lávelos con PBS y déjelos secar durante unos minutos. A continuación, agregue 150.000 células B e incubar a 37 grados para los diferentes puntos de tiempo.
En ambos casos, al activar ya sea con perlas o diapositivas recubiertas de antígeno, recomendamos comenzar con el punto de tiempo más largo y luego proceder a los más cortos. Una vez que haya montado el cubreobjetos seco en la diapositiva del microscopio, puede utilizar una epifluorescencia o un microscopio confocal para ver sus muestras, dependiendo de los requisitos de resolución. Enfoque la muestra utilizando la luz transmitida.
Debe buscar campos donde las celdas y los cordones estén interactuando en una proporción y una. Para las células B activadas en los cubreobjetos cubiertos con antígeno, utilice el objetivo 100x para una mejor resolución. Para los parámetros, considere la posibilidad de tomar una pila z que cubra toda la celda.
Puede etiquetar actin para delimitar los límites inferior y superior de la celda. Para las células B activadas con perlas recubiertas de antígeno y etiquetarlo para orgánulos confinados a un punto, primero delimitar dos áreas: el área de la célula y el área del cordón. A continuación, identifique la posición o el orgánulo por un punto y obtenga sus coordenadas de localización.
Dibuja dos vectores: uno entre el centro de la celda y el orgánulo, y otro entre el centro de la celda y el centro del cordón. Mida la longitud de ambos y mida el ángulo entre los dos vectores, ahora denominados alfa. Haga una proyección con el vector entre el centrooma y el centro celular usando el Guassiano de alfa y luego calcule el índice de polaridad del orgánulo dividiendo el vector proyectado, a, por b.
Por lo tanto, un índice de polaridad entre cero y uno indica un fenotipo polarizado. Los valores entre cero y menos uno indican un fenotipo no polarizado. Para determinar el índice de polaridad para los orgánulos más dispersos, como los lisosomas, puede utilizar el mismo algoritmo mencionado anteriormente, cambiando las coordenadas de localización del organelle para las coordenadas del centro de masa de las etiquetas, en este caso, lisosomas.
De forma similar al análisis descrito anteriormente, un índice de polaridad entre cero y uno indica un fenotipo polarizado, mientras que los valores entre cero y menos uno indican un fenotipo no polarizado. Para cuantificar la cantidad de cada orgánulo estrechamente reclutado para la nueva sinapsis, puede calcular el porcentaje de fluorescencia del organelle en el cordón. Para ello, debe delimitar el área del cordón y la celda, medir la intensidad de fluorescencia respectiva y luego dividir la fluorescencia del cordón por la suma del cordón y la fluorescencia de la celda.
Obtendrá la cantidad de cada orgánulo que está en contacto con la nueva sinapsis. Alternativamente, dibuje un rectángulo opuesto al cordón. Utilice un peso correspondiente a un cuarto de la longitud de la celda, luego mida la intensidad de fluorescencia dentro del rectángulo y divídala por la fluorescencia total.
Este algoritmo siempre obtendrá el porcentaje del orgánulo que está cerca de la nueva sinapsis, pero no necesariamente en contacto directo con la interfaz. Para cuantificar los componentes asociados al centrooma en las celdas B en reposo y activadas. Brevemente, determinamos tres parámetros.
El área de celda y cuenta, y las coordenadas de localización centrosomal. A continuación, definimos un círculo que rodea el centrosome y ejecutamos un análisis de perfil radial desde el centro del centrooma, previamente definido. Una vez que tenga la gráfica, determine el radio en el que se mantiene el 70% de la fluorescencia máxima.
Utilice este radio para dibujar un círculo que rodea el centrooma. Por último, obtenga la densidad de fluorescencia del componente de interés en el área centrosome y el área de la celda, y divida ambos valores para obtener la relación de densidad fluorescente. Para medir la distribución de los orgánulos en la interfaz de la sinapsis inmune, primero identifique el área de las células B en contacto con el cubreobjeto recubierto de antígeno.
Puede etiquetar actin para ayudarle a definir esta área. A continuación, mida el área en contacto con la diapositiva, la altura y la anchura de la celda. El área frente al resbalón de la cubierta recubierta de antígeno es una medida de la propagación de la célula B tras la activación de la célula B.
Utilice los valores de alto y ancho para delimitar un área central de la celda, que está separada de los límites por un cuarto de los valores de altura y anchura. Por lo general, estos corresponden a aproximadamente un tercio del área celular total. Finalmente, calcular el reclutamiento de orgánulos en el centro de la nueva sinapsis, dividiendo la densidad de fluorescencia en el área central por la densidad de fluorescencia de toda la célula.
Los valores positivos de este índice indican un enriquecimiento de organelles en el centro de la nueva sinapsis. Por el contrario, los valores negativos indican una distribución periférica. Para medir la distribución de los orgánulos a través de los planos z de las células B activadas en los cubreobjetos recubiertos con antígeno, primero delimite la interfaz sináptica y el límite superior de la célula.
A continuación, dibuje una línea a través del centro de la celda y vuelva alicer la imagen para obtener una imagen XZ. Mida la cabeza de la célula y divida la imagen en 10 fracciones de la misma área, desde la sinapsis inmune hasta el límite superior de la célula. Mida la fluorescencia en cada fracción z y calcule el porcentaje de fluorescencia dividiendo la fluorescencia en cada fracción z por la fluorescencia total de la célula.
Por último, trace el porcentaje de intensidad de fluorescencia por fracción z. La fracción uno y dos representan la interfaz sináptica. Aquí está el flujo de trabajo o el procedimiento de aislamiento de centrosome.
Use 20 millones de células B por condición. Pretratamiento de células con citocaplasina D y Nocodazol según el protocolo requerido para facilitar el desprendimiento de centroomas. A continuación, observe las células resuspendándolas en 5 ml de búfer TBS.
Repita utilizando 1 ml de búfer de 0,1x TBS complementado con 8% de sacarosa. Resuspender el pellet celular con 150 microlitros de tampón de lelisis. Centrifugar a 10.000 g durante 10 minutos a 4 grados Celsius para separar el citosol y los orgánulos del núcleo.
Recuperar cuidadosamente el sobrenadante celular y colocar en la parte superior de un tubo de 1,5 ml. Llénalo con 300 microlitros de tampón de gradiente complementado con 60%sacarosa. Centrifugar muestras a 10.000 g durante 30 minutos a 4 grados centígrados.
Este paso de centrifugación es importante para concentrar los centroomantes. Después de la centrifugación, retire cuidadosamente el sobrenadante hasta que llegue a la interfaz. Vórtice la muestra restante en el tubo.
Preparar gradiente discontinuo de sacarosa en un tubo de ultracentrífuga superponiendo 0,45 ml de 70%sacarosa, con 0,27 ml de 50% sacarosa, y luego 0,27 ml de 40% sacarosa en búfer de gradiente. Coloque las muestras enriquecidas con un centroomante en el gradiente discontinuo y calibre el peso de cada muestra en los adaptadores respectivos. Centrifugar los tubos a 40.000 g durante 1 hora a 4 grados Celsius, con una aceleración mínima y sin rotura para evitar perturbar el gradiente.
Después de la centrifugación, recoja cuidadosamente 12 fracciones con el mismo volumen. Resuspender el ejemplo con el búfer de carga y ejecutar un SDS-PAGE. Para estudiar la distribución del orgánulo en células B durante la formación de una sinapsis inmune, utilizamos 2A1.6 células B activadas con perlas recubiertas de antígeno para diferentes puntos de tiempo.
Como control, las células B se activaron con cuentas que contenían un BCR-ligand no relacionado. Entonces, utilizando la tinción de inmunofluorescencia, detectamos diferentes orgánulos, que cambian su localización tras la activación con antígenos inmovilizados. Aquí mostramos el centrooma, etiquetado con alfa-tubulina y aparatos golgi etiquetados con Rab6a.
En el gráfico, mostramos el índice de polaridad para el verus de polaridad del aparato centrosome y golgi cada punto de activación de tiempo, en el que cada punto representa una célula. Durante la activación, podemos observar que los índices de polaridad de estos orgánulos alcanzan valores más cercanos a 1, lo que sugiere un aumento en su reclutamiento a los IS.Organelles que muestran una distribución más dispersa, como los lisosomas, también se pueden cuantificar utilizando un índice de polaridad. Podemos observar que el índice de polaridad del lisosoma alcanzará valores más positivos tras la activación, lo que resulta del reclutamiento al EI. Mostramos un enfoque complementario para cuantificar el reclutamiento de un lisosoma hacia la sinapsis inmune.
Utilizando el mismo protocolo de activación con perlas recubiertas de antígeno, el reclutamiento de lisosomas al EI se calculó cuantificando la etiqueta de fluorescencia de los lisosomas reclutados en el área definida alrededor del cordón o dentro del área sináptica. Podemos observar esa activación abierta. Hay un aumento de lisosomas acoplados al sitio de la sinapsis.
Aquí presentamos la cuantificación de actina en el centrooma en células B activadas con perlas recubiertas de antígeno específicas e inespecíficas. El pool de actin se indica con una flecha. La cuantificación de componentes asociados al centrooma, como actin en este caso, se puede representar mediante trazado de puntos, en el que cada punto representa una celda.
Después de la activación, la célula B disminuye en la cantidad de actina alrededor del centrooma. Este paso es importante separar el centrooma de la región perinuclear para permitir su polarización a la nueva sinapsis. Para las células B activadas en la superficie recubierta de antígeno, puede estudiar la remodelación de actin, así como el reclutamiento de orgánulos a la membrana sináptica.
Aquí mostramos el análisis de orgánulos, como el aparato golgi y el retículo endoplasmático, que muestran una distribución central y periférica, respectivamente. Además, podemos calcular el área de propagación de las células B después de diferentes puntos de tiempo de activación. Para ello, etiquetamos actin para poder definir el límite de celda en el plano XY.
En el gráfico, puede observar el aumento en el área de la celda después de 30 y 60 minutos de activación. La distribución de un orgánulo también se puede calcular en el plano XZ en respectiva interfaz sináptica. El gráfico representa la distribución de actin en el plano z, donde los dos primeros planos corresponden a la interfaz sináptica.
Podemos observar que la actina se enriquece en esta área tras la activación. Además del análisis por imágenes, enfoque bioquímico también se puede utilizar para estudiar el cambio en la composición del centrooma tras la activación de la célula B. Aquí mostramos una mancha occidental representativa de la fracción que contiene centrooma resaltada por el rectángulo beige.
Las fracciones centroomas se aislaron en un gradiente discontinuo de sacarosa y se detectaron mediante nivelación gamma-tubulina. La mancha occidental a continuación muestra actina y Arp2 en fracciones centrosomes de las células B en reposo, que se agotan tras la activación. Los linfocitos B experimentan cambios dinámicos en la interfaz de la membrana para formar una sinapsis inmune funcional.
Este proceso se puede estudiar mediante imágenes y técnicas bioquímicas descritas aquí en este video. Creemos que este análisis puede proporcionar información de valor sobre los mecanismos moleculares involucrados en cómo las células B pueden activarse eficientemente.
