Esto podría servir para ayudar a responder preguntas clave sobre cómo sintetizar moléculas DCAF con la neutralización de anticuerpos dirigida. Esta técnica proporciona la forma más sencilla de sintetizar las moléculas DCAF con alta productividad. El mundo decide que las moléculas DCAF tienen las posibles intervenciones al anticuerpo en los problemas de enfermedades como la fiebre del dengue y la miastenia grave.
Este método se puede aplicar a otras moléculas DCAF con diferentes epítopos para atacar los anticuerpos cognados. Demostrando el procedimiento estará Xue Bai, un técnico superior de mi laboratorio. Para convertir resina de 2 cloros en resina de 2 cloro derivada de hidrazina, desde la parte superior del recipiente de síntesis de péptidos, agregue cinco mililitros de DMF a los 0,25 milimoles de resina de 2 cloro.
Vuelva a colocar la tapa, agite suavemente el recipiente durante 15 segundos y, a continuación, escóndalo en un soporte de hierro. Repita el lavado DMF dos veces más. A continuación, agregue cinco mililitros de DCM al recipiente, vuelva a colocar la tapa, agite suavemente el recipiente durante 15 segundos y, a continuación, escurralo en un soporte de hierro.
Repita el lavado DCM dos veces más y, a continuación, repita el lavado DMF tres veces más. A continuación, agregue seis mililitros de concentración de volumen del 50% de DMF sobre DCM para hinchar la resina durante 30 minutos y luego drenarla. Ahora transfiera seis mililitros de concentración de volumen del 5% de hidrazina y DMF al recipiente de reacción.
Colóquelo en la coctelera a 120 RPM y 30 grados centígrados durante 30 minutos, y luego drene la solución con bomba de vacío. Para purificar el derivado de la hidrazina de un péptido Fc-III, utilice el sistema HPLC para purificar el péptido mediante una elución de alusión de gradiente de 30 minutos a un caudal de un mililitro por minuto. Después de la purificación de proteínas según el manuscrito, añadir en un nuevo tubo dos mililitros de un miligramo por mililitro SUMO etiquetada proteína, un mililitro de PROteasa SUMO, un mililitro de 10X SUMO tampón proteasa, y seis mililitros de agua destilada doble para preparar la solución de reacción.
Incubar la mezcla durante 12 a 16 horas a cuatro grados centígrados. A continuación, aliquot la mezcla en ocho tubos de 1,5 mililitros Eppendorf, y centrifugar la mezcla a 15.000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Utilice una pipeta para desechar los agregados en la parte inferior, luego en los sobrenadantes despejados de 10 mililitros, agregue 0,5 mililitros de la lodo de cordón NTA de 50%níquel en 50 PBS mililolares.
Coloque el tubo en una coctelera giratoria a 200 RPM y cuatro grados centígrados para mezclar suavemente durante 60 minutos. A continuación, cargue la lisada y la mezcla de NTA de níquel en una columna con la tapa de salida inferior. Retire la tapa inferior y guarde el flujo a través de un tubo centrífugo de 15 mililitros.
La proteína HIS TAG SUMO es unión en la columna. La parte del antígeno del vinculador, que comienza con el CIS para la reacción de ligadura química nativa, está en el flujo a través. Ahora pondera 1,8 miligramos de derivado de hidrazina de un péptido Fc-III en un tubo de Eppendorf de dos mililitros y añade 0,8 mililitros de seis cloruro de guanidinio molar en 0,2 solución de fosfato monosódico molar a pH 3.
Vórtice para disolver el polvo. Después de centrifugar el tubo a 7, 200 veces G durante un minuto a temperatura ambiente, transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. Agregue una barra de agitación en el tubo y coloque el tubo en un baño de sal helada en un agitador magnético para agitar suavemente la solución durante 15 minutos.
A continuación, agregue 40 microlitros de 0,5 molar de nitrito sódico a la solución para oxidar el grupo de hidrazina. Agitar suavemente la solución durante otros 15 minutos en el baño de sal helada. Pesar a 11 miligramos de la parte del antígeno del eslador seco purificado y liofilado, y 13,6 miligramos de MPAA en el tubo de reacción en el baño de sal de hielo.
Revuelva durante cinco minutos y luego ajuste el valor de pH a 6.8 a 7.0 en la habitación templado con seis molares de hidróxido de sodio. El paso más crítico para la ligadura química nativa es ajustar el valor de pH cuidadosamente para iniciar la reacción de ligadura. Después de 12 horas en el baño de sal helada, agregue 0,4 mililitros de 0,1 solución neutra molar TCEP al sistema de reacción, y revuelva durante 20 minutos para terminar la reacción.
Después de la centrifugación y la purificación de HPLC, obtener el pico conjugado III para la desulfuración. Disolver en 50 microlitros de seis cloruros de guanidinio molar en solución de fosfato monosódico molar 0,2. A continuación, agregue 50 microlitros de un TCEP molar, 10 microlitros de tert-Butylthiol y cinco microlitros de 0,1 molar VAO para cuatro soluciones.
Ajuste el pH final de la solución a 6.9 y mantenga la solución a 37 grados centígrados en una coctelera durante unas cinco horas. Centrifugar y purificar de nuevo. Disolver el péptido preparado en 200 microlitros de 32 acetatos de plata milimétrica, y luego agitar la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante cuatro horas.
Para convertir los tiolados de plata en péptidos en tioles libres, agregue tres microlitros de una TDT molar en seis cloruro de guanidinio molar, y 0,2 fosfato monosódico molar a pH 7. Utilice el espectrómetro de masas en el modo de escaneo completo y ajuste el rango m/z en 300 a 2.000 y la resolución a 60.000. Abra los datos de espectros de masa y encuentre los picos del producto en cada paso para confirmar que la reacción química se ha realizado con éxito.
Para realizar el ensayo ELISA de la interacción entre el anticuerpo DCAF1 y 4G2, cubra cada pozo de una placa de microtíter de 96 pozos con un picomole de anticuerpo anti-GST en 100 microlitros de tampón de recubrimiento. Selle la placa con cintas de sellado y cíntela a 4 grados centígrados durante la noche en una coctelera. Por la mañana bloquee cada pozo con 200 microlitros de 1%BSA y PBS.
Selle la placa e incuba la habitación templada durante una hora en una coctelera. A continuación, utilice PBS con 0.05%Tween 20 para lavar cada pozo cuatro veces. En este protocolo se utilizó el método de ligadura química nativa para la semisíntesis de la molécula DCAF1.
El espectro de masas muestra que la molécula DCAF1 final tiene un peso molecular desconvolucional de 11,053. Durante el ensayo ELISA, el péptido antígeno Fc-III y DCAF1 inhiben competitivamente la unión de anticuerpos 4G2. Tanto el péptido antígeno como el DCAF1 bloquearon significativamente la unión 4G2, mientras que la peptita Fc-III no afectó a la interacción de anticuerpos antígenos.
Después de este desarrollo, esta técnica allanó el camino para una intervención de enfermedades asociadas a anticuerpos dañinos. Lote de las regiones utilizadas para la síntesis de péptidos y ligadura química nativa son altamente tóxicos. Asegúrese de llevar estos experimentos en su capucha química.
