Este trabajo fue apoyado por una &quot;subvención al Servicio de la Investigación&quot; de la enfermedad de Crohn y Colitis Foundation of Canada al LMS, que se apoya en una Asociación Canadiense de Gastroenterología / Asociación Canadiense de Investigación en Salud / enfermedad de Crohn &#39;s and Colitis Foundation Premio de Canadá, New Investigator.

1. Los macrófagos que agotan la Utilización de liposomas que contienen clodronato <ol><li> Los liposomas se almacenan a 4 ° C. Dos horas antes de la inyección, retire clodronato que contienen liposomas, los liposomas que contienen PBS o PBS estéril (inyección de control) del refrigerador para permitir que se adapte a la temperatura ambiente (18 ° C). </li><li> Invertir los tubos que contienen liposomas 8-10 veces para asegurar una distribución uniforme antes de cargar 200 l en una jeringa de 1 ml. Colocar una aguja de calibre 26 a la parte superior de la jeringa. </li><li> Con la mano izquierda pescuezo, el ratón debajo de las orejas que sostienen la piel lo suficiente para inmovilizar la cabeza y las extremidades. </li><li> Al girar el ratón por lo que su cabeza es ligeramente hacia el suelo para los órganos internos se mueven lejos del sitio de inyección, que se encuentra en el cuadrante inferior derecho del abdomen. </li><li> Haga rodar la jeringa entre las palmas de las manos e invertirlo 6 veces para distribuir uniformemente la solución de liposomas antes de la inyección. </li> &lt;li&gt; Inserta la aguja en la parte inferior derecha del abdomen del ratón en un ángulo de 30-40. Inyectar 200 l de solución de liposomas o PBS. </li><li> Durante un modelo de inflamación inducida, como la colitis inducida por DSS, inyectar ratones 4 días antes de la aparición de la inflamación experimental para garantizar el agotamiento de los macrófagos residentes y cada 2 días durante el protocolo de agotar los nuevos macrófagos infiltrantes. </li><li> Al final del experimento, junto con los análisis experimentales planificadas, extraer tejidos desde el sitio de interés y fijar con paraformaldehído para confirmar el agotamiento del macrófago por tinción inmunohistoquímica. </li></ol> 2. Derivación de los macrófagos polarizados de aspirados de médula ósea <ol><li> La médula ósea de ratones de entre 8 y 12 semanas de edad proporciona el mayor rendimiento de derivados de médula ósea macrófagos. Practicar la eutanasia con el ratón, que yacía sobre la espalda, y precisar sus patas, que se extiende a sus miembros en la medida de lo posible. </li><li> Trabajo en un recipiente estéril Hood, eliminar fémur y la tibia, cortando tanto músculo como sea posible. </li><li> Lavar la médula de los huesos usando IMDM con FCS al 10% carga en una jeringa de 5 ml equipado con una aguja de calibre 26. </li><li> Diluir aspirado de médula ósea a 40 ml en IMDM con 10% FCS, las células de lugar en una de 75 cm 2 frasco de cultivo de tejidos, y se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 4 horas. Este paso quita adherentes células mesenquimales o macrófagos maduros de progenitores hematopoyéticos. </li><li> Transferir el sobrenadante de cultivo que contiene no adherentes progenitores a un Tubo de 50 ml cónico de Falcón y centrifugar durante 5 min a 1200 rpm. </li><li> Resuspender pellet de células en 5 ml de IMDM, 10% de FCS y contar las células nucleadas por dilución de la suspensión celular 1 en 20 en ácido acético. Este procedimiento destruye las células, incluyendo todos los glóbulos rojos y los núcleos restantes se pueden contar con un hemocitómetro. </li><li> Resuspender las células a una concentración de 0,5 x 10 6 células / ml en medio completo; IMDM, 10% FCS, 150 mM monotioglicerol (MTG), y 10 ng / ml de cualquiera de MCSF, GM-CSF o IL-3. MCSF macrófagos derivados son clásicamente macrófagos activados, mientras que los macrófagos GM-CSF o IL-3-derivados se alternativamente activado. </li><li> Sustituir medio a 4 días, girando hacia abajo las células no adherentes y devolverlos al matraz, y en el día 7, descartando las células no adherentes. </li><li> Además, IFN (10 ng / ml) o IL-4 (10 ng / ml) se puede añadir a matraces que contienen MCSF células derivadas en el día 7 a los macrófagos sesgar a una. Clásicamente activado o un fenotipo alternativamente activado, respectivamente Se incuban las células durante 3 días más. </li><li> Al día 10, se separa el medio y levante las células fuera del frasco de cultivo de tejidos utilizando la célula tampón de disociación (Gibco-BRL). Coloque 5 ml de tampón en las células durante 5 minutos a temperatura ambiente (18 ° C) y luego golpear el lado del aparato, con el talón de la palma de la mano firmemente varias veces. Asegurarse de que las células han quitado del matraz examinando el matraz bajo unmicroscopio. Pipetee resuspendieron las células en un tubo de 15 ml cónico Falcon y lavar el matraz con 10 ml adicionales de IMDM, 10% de FBS. La piscina y centrifugar las células durante 5 minutos a 300 x g. </li><li> Contar células viables utilizando un hemocitómetro y resuspende a una concentración de 10 7 células / ml en PBS estéril pH 7,4. Los macrófagos están listos para su inyección en ratones. </li><li> Reserva de 1,0 × 10 6 macrófagos para la evaluación del fenotipo de los macrófagos. Macrófagos activados Clásicamente estimulados con niveles altos de lipopolisacárido secretan óxido nítrico y los niveles de IL-12p70 y baja de IL-10 en comparación con los macrófagos activados alternativamente. Macrófagos activados alternativamente expresan constitutivamente YM1 y arginasa I (Argi), que puede ser detectada por inmunotransferencia. </li></ol> 3. Tranferring macrófagos en ratones <ol><li> Macrófagos Resuspender en PBS estéril a una concentración de 10 7 células / ml. Esto permite una eninyección intravenosa de 10 6 macrófagos en un volumen total de 100 l, que es un volumen que puede ser de forma segura y cómodamente inyecta en ratones por la vena de la cola. </li><li> Los ratones tibia con una almohadilla térmica o una vuelta al calor durante 5-10 minutos para dilatar la vena de la cola. Controlar el ratón en todo momento en busca de signos de la hipertermia. </li><li> Transferir el ratón a un dispositivo de retención que permite el acceso a las venas de la cola. </li><li> Gire la cola de 90 ° para que la vena se hacia arriba. Las venas correr lateralmente a ambos lados de la cola y, o bien la vena se puede utilizar. </li><li> Limpie el sitio de la inyección con un algodón empapado en alcohol y poco a poco, inyectar 100 l (10 6 macrófagos), utilizando una jeringa de 1 ml con una aguja de calibre 26 ó 28. Insertar la aguja con el lado cónico hacia arriba y con un ligero ángulo, casi paralela a la vena. </li><li> Si la aguja se inserta adecuadamente sin resistencia debe ser sentida y la vena debe quedar claro después de la inyección. Si la aguja no está en elorden de cosas, la cola se hinchará. Si esto sucede, retire la aguja y vuelva a intentarlo proximal a la última tentativa, o en la vena otra. Una nueva aguja debe ser utilizado para cada inyección como la cola es dura y las agujas se embotan rápidamente durante la inyección vena de la cola. </li><li> Después de la inyección, retire la aguja, aplique una leve presión sobre el sitio de la inyección hasta que el sangrado se detenga, y controlar el ratón de un 5 minutos adicionales para asegurarse de que el sangrado se ha detenido. </li><li> Repetir las inyecciones macrófagos cada 4 días para asegurar un suministro continuo de los macrófagos polarizados durante el procedimiento experimental. </li><li> Al final del experimento, junto con los análisis experimentales, extraer tejidos desde el sitio de interés y fijar con paraformaldehído o formalina para confirmar la entrega efectiva de los macrófagos polarizados por tinción inmunohistoquímica. </li></ol> 4. Los resultados representativos El número y el fenotipo de macrop residentePasador valvula en cualquier tejido determinado depende del tejido que se examina y cambiará durante la infección o inflamación. De manera similar, la capacidad de los liposomas que contienen clodronato para agotar los macrófagos a partir de un tejido dependerá de la vía de administración y la entrega efectiva para el tejido diana. La inyección intraperitoneal de clodronato liposomas que contienen los resultados en una disminución en F4/80 + macrófagos en el colon de ratón durante DSS-colitis inducida evidente por tinción inmunohistoquímica para el marcador de macrófagos, F4/80 (Figura 1A). Tinción histológica también se puede utilizar para determinar las diferencias cuantitativas en número de macrófagos y fenotipo en secciones de tejido. Figura 1B muestra que un promedio de 55% de los macrófagos se agote por clodronato que contienen liposomas en comparación con ningún agotamiento detectado en dos puntos del ratón cuando los ratones son inyectados con PBS solo como un control de la inyección. Cada valor se determina contando F4/80 y Argi manchaed células positivas en cortes de tejidos de serie de 6 ratones a los 3 puntos, en 3 secciones por ratón con contar los trabajos realizados por dos individuos cegados a la condición experimental. Estos resultados demuestran que las inyecciones intraperitoneales de liposomas clodronato agotan los macrófagos de colon en ratones. Derivación de los macrófagos de médula ósea en presencia de diferentes factores de crecimiento rendimientos macrófagos que son clásicamente activados (MCSF derivado o derivados-MCSF y se trató con IFN) o alternativamente activado (GM-CSF o IL-3-derivado o derivados y MCSF tratadas con IL-4). Lavado de médula ósea de 2 fémur y la tibia 2 de un ratón 8 semanas de edad típicamente rinde 6 x 10 7 células nucleadas por ratón y de los rendimientos 8 x 10 6 MCSF derivados de macrófagos, 10 x 10 6-GM-CSF derivados macrófagos, o 12 x 10 6 IL-3-macrófagos derivados. Figura 2A muestra el nitrito y la relación IL-12p70/IL-10 en macrófagos supernatants tratados con lipopolisacárido durante 24 horas la Figura 2B muestra un análisis típico de transferencia Western de 0,5 x 10 6 macrófagos de MCSF + / -. IL-4 condiciones derivación probaron con anticuerpos para marcadores de macrófagos activados alternativamente, Argi, YM1, o con GAPDH como un control de carga. Estos datos demuestran que derivados de médula ósea macrófagos pueden estar sesgadas a un fenotipo polarizado durante la derivación. La transferencia efectiva de ex vivo derivadas macrófagos polarizados a un tejido depende de la vía de administración y el acceso al tejido. Durante DSS-colitis inducida, macrófagos inyecta por vía intravenosa viajar al sitio de la inflamación y macrófagos activados alternativamente reducir la severidad de la enfermedad. Figura 3A muestra el número total de los macrófagos y el número de macrófagos Argi + (alternativamente activado) contados en secciones histológicas de ratones inyectados con polarizado médula óseaDerivados de macrófagos. El impacto de la transferencia de los macrófagos polarizados a los dos puntos en la colitis inducida por DSS-se muestra el índice de actividad de la enfermedad, una puntuación de aditivo basada en la pérdida de peso, sangrado rectal, heces y consistencia disminuyó (Figura 3B). Estos resultados demuestran que ex vivo deriva, los macrófagos pueden adoptiva transferidos tráfico hacia el colon y la inflamación inducida por el impacto. Macrófagos M1 no afectan a la inflamación, mientras que los macrófagos M2 reducir significativamente índice de actividad de la enfermedad. <img src="/files/ftp_upload/4105/4105fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Clodronato liposomas que contienen efectivamente agotan F4/80 + y + F480 Argi + en las células de ratón en dos puntos in vivo. Una generación F2 de ratones de tipo salvaje en una mezcla de C57BL / 6 x fondo 129Sv recibieron DSS 5% durante 7 días y de propiedad intelectual inyectado con PBS (control) o liposomas que contienen clodronato (clodronato) 4 días antes de la DSS del tratamientoy en los días 0, 2, 4 y 6 durante el tratamiento DSS. (A) Los dos puntos fueron retirados, fijo, y las secciones fueron teñidas por inmunohistoquímica para macrófagos maduros (F4/80) y el marcador de macrófagos M2, Argi. (B) Cuantificación de F4/80 + y macrófagos ARGI +. Células teñidas positivamente fueron contados por dos individuos ciegos a la condición experimental de ampliación × 40 en 6 campos de 3 secciones y de ratón y de 6 ratones por grupo. * P &lt;0,01. <img src="/files/ftp_upload/4105/4105fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. MCSF derivados de macrófagos expresan un fenotipo clásicamente activado y MCSF derivados de macrófagos tratados con IL-4 expresar un fenotipo de macrófagos activados alternativamente. (A) De acuerdo con un fenotipo clásicamente activado, MCSF derivados de los macrófagos producen mayores niveles de óxido nítrico en respuesta a lipopolisacárido y se puede medir por el ensayo de Griess, que detecta su metabolito intermedio, el nitrito. Se also producir una mayor proporción IL-12p70/IL-10, que puede ser medida por ELISA. * P &lt;0,01 para n = 3. (B) De acuerdo con un fenotipo alternativamente activado, MCSF derivados de macrófagos tratados con IL-4 YM1 expresan constitutivamente y Argi, que puede ser detectada por inmunotransferencia Western. Los datos son representativos de 3 experimentos independientes con resultados similares. <img src="/files/ftp_upload/4105/4105fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Inyectado por vía intravenosa, ex vivo derivado de los macrófagos activados alternativamente, el tráfico en el colon y reducir la inflamación intestinal. Una generación F2 de ratones de tipo salvaje en una mezcla de C57BL / 6 x 129Sv de fondo se les dio 5% del DSS en el agua de bebida durante seis días. Macrófagos M1 y M2 fueron inyectados IV en los días 0 y 4 durante el tratamiento con DSS. (A) Los dos puntos fueron retirados, fijo, y las secciones fueron teñidas por inmunohistoquímica para macrófagos maduros (F4/80) y un marcador de macrófagos M2 (Argi).La cuantificación de los macrófagos de los ratones de control de PBS inyectado (C), los ratones inyectados con los macrófagos M1 (+ M1) y los ratones inyectados con los macrófagos M2 (M2 +) fueron realizados por el recuento de células con tinción positiva con un aumento de × 40 en 6 campos de 3 secciones / ratón y de 6 ratones / grupo. Conteo se llevó a cabo por dos individuos cegados a la condición experimental. (B) Actividad de la enfermedad se controló y anotó todos los días durante el tratamiento y es una puntuación aditivo basada en la pérdida de peso, sangrado rectal, heces y la consistencia disminuye. * P &lt;0,05 para n = 6 ratones en 2 experimentos independientes.

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No hay conflictos de interés declarado.

Los macrófagos son células fagocíticas que juegan un papel importante en el sistema inmunológico. Ellos son los responsables de iniciar la respuesta inmune innata y la dirección de la respuesta inmune adquirida. Típicamente, los macrófagos activados clásicamente son activados por IFN o LPS y son responsables de la eliminación de patógenos y montaje de una respuesta inflamatoria 1. A la inversa, los macrófagos activados alternativamente se activan por la IL-4 o IL-13 y jugar un papel en los desechos...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Que contienen clodronato-liposomas </td><td> <a href="http://Clodronateliposomes.org" target="_blank">Clodronateliposomes.org</a> </td><td></td></tr><tr><td> PBS que contienen liposomas </td><td> <a href="http://Clodronateliposomes.org" target="_blank">Clodronateliposomes.org</a> </td><td></td></tr><tr><td> PBS estéril pH 7,4 </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td></tr><tr><td> IMDM </td><td> Invitrogen </td><td> 12440 </td></tr><tr><td> Suero fetal bovino (FCS) </td><td> Invitrogen </td><td> 12483 </td></tr><tr><td> ácido acético </td><td> BDH Aristar </td><td> BDH3092-500MLP </td></tr><tr><td> Monotioglicerol (MTG) </td><td> Sigma </td><td> 96-275 </td></tr><tr><td> RECOMBnante murino MCSF </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 02951 </td></tr><tr><td> Recombinante GM-CSF murino </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 02935 </td></tr><tr><td> Recombinante IL-3 murina </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 02903 </td></tr><tr><td> Recombinante murino IFN </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 02746 </td></tr><tr><td> Recombinante de IL-4 murino </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 02714 </td></tr><tr><td> Disociación celular buffer </td><td> Invitrogen </td><td> 13150-016 </td></tr><tr><td> Rata anti-F4/80 anticuerpos </td><td> AbD Serotec </td><td> MCA497GA </td></tr><tr><td> Mouse anti-anticuerpos Argi </td><td> BD Transduction Laboratories </td><td> 610708 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Reactivos específicos utilizados en este protocolo.

depletion and reconstitution of macrophages in mice

Los macrófagos son participantes cruciales en la respuesta inmune innata a cualquier reto infeccioso o lesión, iniciando la respuesta inmune innata y la dirección de la respuesta inmune adquirida. La disfunción de macrófagos puede conducir a la incapacidad de montar una respuesta inmune adecuada y, como tal, ha sido implicado en muchos procesos patológicos, incluyendo las enfermedades inflamatorias del intestino. Los macrófagos muestran fenotipos polarizadas que se dividen en dos categorías. Macrófagos activados Clásicamente, activada por la estimulación con LPS o IFN, desempeñan un papel esencial en la respuesta a la exposición a las bacterias, mientras que los macrófagos activados alternativamente, activada por IL-4 o IL-13, participar en los residuos de barrido y la remodelación tisular y han sido implicados en la resolución fase de la inflamación. Durante una respuesta inflamatoria in vivo, los macrófagos se encuentran en medio de una mezcla compleja de la infiltración de células inmunes y puede participar por exacerbar o resolvinag inflamación. Para definir la función de los macrófagos in situ en un modelo animal completo, es necesario examinar el efecto de agotamiento de los macrófagos del entorno complejo. Para hacer preguntas sobre el papel de fenotipo de macrófagos in situ, fenotípicamente definidos los macrófagos polarizados se pueden derivar ex vivo, a partir de aspirados de médula ósea y se añade de nuevo a los ratones, con o sin el agotamiento previo de los macrófagos. En el protocolo presentado aquí clodronato liposomas que contienen, en comparación con los controles de PBS inyectados, se utilizaron para agotar los macrófagos colon durante dextrano sulfato de sodio (DSS)-colitis inducida en ratones. Además, los macrófagos polarizados se obtuvieron ex vivo y se transfiere a los ratones por inyección intravenosa. Una advertencia de este enfoque es que los liposomas que contienen clodronato agotan todos los fagocitos profesionales, incluyendo tanto las células dendríticas y los macrófagos para asegurar el efecto observado por el agotamiento de los macrófagos es específica, la reconstitución ofenotipo f por transferencia adoptiva de los macrófagos es necesario. Agotamiento macrófagos sistémica en ratones también se puede lograr por retrocruzamiento ratones sobre un fondo CD11b-DTR, que es un enfoque complementario excelente. La ventaja de clodronato contiene mediada por liposomas agotamiento es que no requiere el tiempo y los gastos implicados en ratones retrocruzamiento y que puede ser utilizado en ratones con independencia del fondo de los ratones (C57BL / 6, BALB / c, o fondo mixto ).

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Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Los macrófagos juegan un papel central en la homeostasis y la patología en muchos tejidos. El protocolo presentado aquí se describen métodos para agotar los macrófagos<em&gt; En vivo</em&gt;, Que derivan de los macrófagos polarizados aspirados de médula ósea, y la transferencia adoptiva macrófagos en ratones. Estas técnicas permiten determinar el papel que los macrófagos polarizados desempeñan en la salud y la enfermedad.

El agotamiento y la reconstitución de los macrófagos en ratones

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

depletion-and-reconstitution-of-macrophages-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

39.4K vistas.  University of British Columbia. Los macrófagos juegan un papel central en la homeostasis y la patología en muchos tejidos. El protocolo presentado aquí se describen métodos para agotar los macrófagos En vivo, Que derivan de los macrófagos polarizados aspirados de médula ósea, y la transferencia adoptiva macrófagos en ratones. Estas técnicas permiten determinar el papel que los macrófagos polarizados desempeñan en la salud y la enfermedad.

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Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

El agotamiento de las poblaciones de células específicas por el agotamiento del complemento

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Investigación

Inmunología e Infección

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

Estudio de fagolisosoma Biogénesis en macrófagos en directo

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

El uso de<em&gt; Flexneri Shigella</em&gt; Para estudiar las interacciones Autophagy Citoesqueleto

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied by adverse side effects such as a reduced ability to control infections or malignancies. Therefore, new approaches need to be developed that target only the disease mediating cells and leave the remaining immune system intact. Over the past decade a variety of cell based immunotherapy strategies to modulate T cell mediated immune responses have been developed. Most of these approaches rely on tolerance-inducing antigen presenting cells (APC). However, in addition to being technically difficult and cumbersome, such cell-based approaches are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, which limits their therapeutic capacity. Here we present a protocol for the generation of non-cellular killer artificial antigen presenting cells (KaAPC), which allows for the depletion of pathologic T cells while leaving the remaining immune system untouched and functional. KaAPC is an alternative solution to cellular immunotherapy which has potential for treating autoimmune diseases and allograft rejections by regulating undesirable T cell responses in an antigen specific fashion.

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Guidelines are presented for the generation of killer artificial antigen presenting cells, KaAPC, an efficient tool for in vitro depletion of human antigen-specific T cells and an alternative solution to cellular immunotherapy for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases in an antigen-specific fashion without compromising the remaining immune system.

Killer Artificial células presentadoras de antígenos (KaAPC) para la utilización eficiente<em&gt; In Vitro</em&gt; El agotamiento de células T humanas específicas de antígeno

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

Proteómico de perfiles de los macrófagos por electroforesis 2D

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

El colesterol de los macrófagos agotamiento y su efecto sobre la fagocitosis de<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like Shigella flexneri and Francisella novicida need to induce the rupture of the phagosome. In contrast, Salmonella typhimurium replicates in a vacuolar compartment, known as Salmonella-containing vacuole (SCV). However certain mutants of Salmonella fail to maintain SCV integrity and are thus released into the cytosol. The percentage of cytosolic vs. vacuolar bacteria on the level of single bacteria can be measured by differential permeabilization, also known as phagosome-protection assay. The approach makes use of the property of detergent digitonin to selectively bind cholesterol. Since the plasma membrane contains more cholesterol than other cellular membranes, digitonin can be used to selectively permeabilize the plasma membrane while leaving intracellular membranes intact. In brief, following infection with the pathogen expressing a fluorescent marker protein (e.g. mCherry among others), the plasma membrane of host cells is permeabilized with a short incubation in digitonin containing buffer. Cells are then washed and incubated with a primary antibody (coupled to a fluorophore of choice) directed against the bacterium of choice (e.g. anti-Salmonella-FITC) and washed again. If unmarked bacteria are used, an additional step can be done, in which all membranes are permeabilized and all bacteria stained with a corresponding antibody. Following the staining, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria can be quantified by FACS or microscopy by counting single or double-positive events. Here we provide experimental details for use of this technique with the bacterium Salmonella typhimurium. The advantage of this assay is that, in contrast to other assay, it provides a quantification on the level of single bacteria, and if analyzed by microscopy provides the exact number of cytosolic and vacuolar bacteria in a given cell.

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

Cuantificación de Citosólica vs. Vacuolar<em&gt; Salmonella</em&gt; En macrófagos primarios por permeabilización diferencial

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Aislamiento de Salmonella typhimurium-que contienen fagosomas de los macrófagos

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Aislamiento y cultivo In Vitro de los macrófagos alveolares murinos y humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Tuning Degradation to Achieve Specific and Efficient Protein Depletion

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting them for degradation. This system is exploited in many non-plant eukaryotes, such that a target protein, tagged with the AID motif, is degraded upon auxin addition. The level of TIR1 expression is critical; excessive expression leads to degradation of the AID-tagged protein even in the absence of auxin, whereas low expression leads to slow depletion. A &#946;-estradiol-inducible AID system was created, with expression of TIR1 under the control of a &#946;-estradiol inducible promoter. The level of TIR1 is tunable by changing the time of incubation with &#946;-estradiol before auxin addition. This protocol describes how to rapidly deplete a target protein using the AID system. The appropriate &#946;-estradiol incubation time depends on the abundance of the target protein. Therefore, efficient depletion depends on optimal timing that also minimizes auxin-independent depletion.

Here, we present a protocol to effectively and specifically deplete a protein of interest in the yeast Saccharomyces cerevisiae using the &#946;-est AID system.

Afinación de la degradación para lograr un agotamiento específico y eficiente de las proteínas

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting ...