El procedimiento para analizar y especie de Streptomyces gránulos a partir de un cultivo líquido-crecido de dos días de edad se representa esquemáticamente en la Figura 1. Detalles sobre el método se dan a continuación. 1. Crecimiento (incluyendo la preparación de los Medios y Buffers) <ol><li> Preparar 1 L de 10x tampón fosfato salino (PBS; 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4, 2,4 g de KH 2 PO 4 en 1 L de agua destilada ajustada a pH 7,4). En el momento de uso, añadir 100 ml de PBS 10X a 900 ml de agua destilada para obtener 1 l de PBS. </li><li> Preparar 1 L de medio YEME (3 g extracto de levadura Difco, 5 g de Bacto peptona, 3 g de extracto de malta Oxoid, 10 g de glucosa, 340 g de sacarosa, agua destilada hasta 1 L) y 100 ml de 2,5 M de MgCl 2. Esterilizar en autoclave ambas soluciones. Tenga en cuenta que también otros medios de Streptomyces se pueden utilizar 4,14. </li><li> Añadir 100 ml de medio YEME y 0,2 ml de 2,5 M de MgCl 2 a unmatraz Erlenmeyer de 250 ml estéril equipado con muelles de metal en espiral. Preparar tantos frascos como muestras bacterianas para estudiar. </li><li> Inocular cada matraz con 10 8 esporas de Streptomyces para obtener una concentración de esporas de 10 6 esporas / ml. Haga crecer las bacterias durante 2 días a 30 ° C con agitación a 180 rpm. </li></ol> 2. Muestreo <ol><li> Transferir una muestra de 5 ml de cada cultivo a un tubo Falcon de 15 ml utilizando una pipeta estéril ml 5. Agite suavemente la cultura, mientras que la toma de muestras para asegurar que la muestra es representativa de toda la cultura. </li><li> Cuando se analizan muestras de inmediato con COPAS no son necesarias medidas de preparación de muestras. Mantenga la muestra en hielo y vaya al paso 3.1 del presente protocolo. Cuando se analizan las muestras en un momento posterior, fije las pastillas, como se describe en los pasos 2.3 a 2.5 de este protocolo. Tenga en cuenta que la fijación también evita el crecimiento de las bacterias en el sistema de tubos cuando no se limpian adecuadamente después de Analyses. Asegúrese de que la fijación con formaldehído no obstaculiza los análisis. Por ejemplo, el ARN no podía aislarse a partir de pellets de hongos después de la fijación con formaldehído. En contraste, el ARN se aisló con éxito después de la fijación con etanol al 70% 12. </li><li> Añadir 600 l de formaldehído al 37% a 5 ml de muestra y mezclar invirtiendo el tubo de 3x. Fijar las muestras en hielo durante 30 min. </li><li> Centrifugar las muestras a 2500 xg en un rotor fijo a 4 ° C durante 10 min. Retire con cuidado el sobrenadante y lavar las pastillas con 5 ml de PBS. </li><li> Repetir el paso 2.4 de manera que los gránulos se lavan con PBS 2x. Las muestras se pueden almacenar en PBS a 4 ° C durante varias semanas. </li></ol> 3. Análisis COPAS <ol><li> Asegúrese de que el COPAS Plus, la bomba, el ordenador y el láser de argón de 488 nm se enciende y se inicia el software Biosort. Aunque encendido, el láser todavía estará en el modus de espera. </li><li> Compruebe si la botella de fluido de funda está lleno y labotella de residuos está vacía. </li><li> Haga clic en &quot;Inicio&quot; y luego &quot;RUN&quot; para encender el láser de argón de 488 nm de espera para el. Después de aproximadamente 60 segundos, cuando el láser está activado, haga clic en &quot;Hecho&quot;. </li><li> Compruebe los indicadores de presión. Las presiones para &#39;vaina&#39;, &#39;Muestra&#39;, &#39;clasificador&#39; y &#39;Clean&#39; deben leer alrededor de 4,0, 0,5, 2,7 y 10,9 respectivamente. </li><li> Haga clic en la casilla junto a &quot;OK presión&quot;. Entonces, el sistema prepara la celda de flujo y está listo para su uso. </li><li> Ajustes estándar son asumidos con &#39;Delay&#39; a las 11 y &#39;Ancho&#39; 7. Los umbrales se han fijado en 50 para la &quot;señal&quot; y 40 para &quot;TOF mínimo &#39;, con TOF que representa el tiempo de vuelo-. (Para completar: todos los &quot;beneficios&quot; se han fijado en 1, el disparo se fija en EXT (Extinción) y en la pestaña &quot;Configuración&quot; bajo &quot;Seleccione velocidad de barrido &#39;se escoge 2,50 MHz coincidencia está en&#39; mejorada &#39;.). </li><li> Eliminar el agua sobrante de la una taza de la muestrad añadir 0,1 ml de muestra Streptomyces desde el paso 2.2 o 2.5 en el vaso junto con PBS (alrededor de 50 ml). Asegúrese de que la cubeta de la muestra está bien cerrada. </li><li> Haga clic en &#39;Acquire&#39; para iniciar la recopilación de datos. Gestione la velocidad del flujo para obtener entre 30 a 50 eventos por segundo. Si el flujo es demasiado alta, añadir PBS a la copa de muestra. Si la velocidad de flujo es demasiado bajo, añada más muestra. </li><li> Cuando por lo menos 2.500 eventos se recogen click &#39;STOP&#39;. Para guardar todos los datos haga clic en &#39;Store&#39; y guardar el archivo para su posterior análisis estadístico. El software Biosort guardará los datos en cuatro archivos, de los cuales sólo el archivo txt. Será utilizado para el análisis posterior. </li><li> Limpiar el vaso de muestra mediante la eliminación de la muestra con una jeringa de 50 ml y lavar con 2x agua. </li><li> Repita los pasos 3.7 a 3.10 hasta que se analizaron todas las muestras. </li></ol> 4. Análisis de Datos <ol><li> Abra el archivo txt. Y descartar los datos con un EXT inferior a 25 (utilizando, por ejemplo, MS Excel). Estecorresponde a los restos y fragmentos de hifas sueltos (por Aspergillus niger se descartan todos los datos con un EXT inferior a 150) 4,12. A continuación, guarde todos los TOF en una columna en una llanura de archivo (por muchos archivos de datos esto puede ser automatizado en el lenguaje de programación R, disponible en: &#39;txt&#39;. <a href="http://www.r-project.org">http://www.r-project.org</a> ). </li><li> Asegúrese de que SciLab (versión 5.3.2 o posterior de http://www.scilab.org/) se instala junto con la biblioteca &#39;fittools&#39;, que está disponible, junto con el manual, a partir de: http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/fittools.zip http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/manual% 20fittools.pdf </li><li> Comience SciLab y ejecutar las funciones necesarias de la biblioteca fittools para modelar los datos. En resumen: Instale la biblioteca fittools como se muestra en el manual (sólo es necesario una vez). <ol><li> Cargar la librería fittools. </li><li> Leer los datos (&#39;. Txt&#39; de archivos) en SciLab. </li><li>Entrar transformar los datos (logaritmo natural es la función de registro por defecto). </li><li> Ajuste el modelo de 2 poblaciones a los datos. </li><li> Trazar una curva con el histograma y el modelo (opcional). </li><li> Bootstrap los datos (1000 repeticiones). </li><li> Ajuste del modelo a los datos programados previamente. </li><li> Obtener el intervalos de confianza estimados de los 5 parámetros. Esto proporcionará información sobre la fracción de la participación (p) de las poblaciones, de sus medios (2 μ 1 y μ 2) y las desviaciones estándar se acompañan (α 1 y α 2). Por otra parte, los intervalos de confianza del 95% son determinados por la readaptación con el modelo tras bootstrapping (1000 repeticiones) 12,13,15. Cuando los intervalos de confianza de los medios no se superponen y el intervalo de confianza de p está comprendido entre 0,025 hasta 0,975 el conjunto de datos se puede explicar como una combinación de dos poblaciones de distribuciones normales. (Nota ªen la fracción de la participación de pequeñas bolitas es p, mientras que la participación de grandes gránulos es 1 -. p) La relación entre TOF y el diámetro de una pastilla de Streptomyces es igual a 0,57 × TOF + 159 m 4. </li></ol></li><li> En el caso de que dos poblaciones se encuentran el uso de los medios TOF como ordenar los parámetros en el COPAS como el límite superior e inferior para ordenar los pequeños y grandes gránulos posteriormente. Tenga en cuenta que también otros parámetros de clasificación se pueden seleccionar dependiendo de las exigencias del usuario. </li></ol> 5. Pellet clasificación <ol><li> Cargar la muestra de Streptomyces que tiene que ser resuelto como se describe en el paso 3.7. </li><li> Set &#39;Clasificación Límites&#39; y proporcionar detalles sobre el mínimo (Lo) y máximo (Hi) los valores TOF. Por otra parte, establecer un área seleccionando &quot;Regiones&quot; y luego &quot;Definir Puerta Región &#39;para seleccionar los pellets con las dimensiones o propiedades deseadas. </li><li> Coloque un tubo de 50 ml arecoger múltiples pastillas que cumplan con los parámetros de clasificación. Alternativamente, una placa de microtitulación se puede utilizar para ordenar gránulos individuales. Se necesitan gránulos múltiples (10 4 -10 5) para el ADN y la extracción de proteínas. Una sola pastilla es suficiente para el análisis de qPCR de la expresión génica, pero se necesitan múltiples pastillas para la secuenciación de ARN. </li><li> Decidir y establecer el número de pastillas que deben ser ordenados y haga clic en &#39;Ordenar manual&#39; para clasificar para los parámetros seleccionados. Cuando se alcanza la cantidad fijada de pastillas, la clasificación finaliza automáticamente. </li><li> Retire la izquierda sobre la muestra con una jeringa de 50 ml de la taza de la muestra y lavar la taza con 2x agua. Repita los pasos 5.1 a 5.5 si otras muestras que habrá que resolver. </li><li> Antes de apagar las COPAS enjuagar la taza de la muestra con agua para eliminar los gránulos restantes y limpie el recipiente para muestras con EtOH al 70% y / o 2% de hipoclorito en el agua. Ejecutar una muestra de agua tratada con cloro para limpiar todo el sistema y repita esto con agua. Empty tse desborde recipiente y limpie o reemplace el filtro que se encuentra en este contenedor. </li><li> Cuando haya terminado, haga clic en &quot;STOP&quot; para liberar la presión del sistema. Cuando el motor se detiene cerrar el programa y haga clic en &quot;apagado sin tener que eliminar &#39;. Luego apague el ordenador, el COPAS, el láser, y la bomba. </li></ol>

<ol>
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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

La citometría de flujo ha permitido el análisis de alta velocidad de grandes números de células individuales, lo que contribuyó a nuestra comprensión de la heterogeneidad en las poblaciones clonales 6. Citometría de flujo regular no es factible para el análisis de los sedimentos miceliales multicelulares de estreptomicetos y hongos. Nuestro trabajo ha demostrado que el análisis de alto rendimiento de los pellets de Streptomyces es factible utilizando COPAS. El procedimiento que se describe aquí es simple, rápido y altamente reproducible. El parámetro fundamental a tener en cuenta durante el funcionamiento del instrumento es la velocidad de flujo, que no debe superar los 100 eventos / seg (paso 3.8 de este protocolo). Si la concentración de sedimento, y por lo tanto también la velocidad de flujo, se hace demasiado alta, los valores TOF se calcularon mal porque el instrumento no detecta gránulos individuales. Suficientemente dilución de la muestra por la adición de PBS que supera este problema. Limitaciones El uso COPAS Plus<html> d aquí tiene un diámetro de boquilla de 1 mm, que es adecuado para la medición de partículas con un tamaño que varía desde 30 hasta 700 micras. Por tanto, esta boquilla permite la medición de gránulos formados por estreptomicetos. En el caso de los hongos filamentosos los micro-colonias pueden ser más grandes, lo que limita la aplicabilidad general de la COPAS Plus. El COPAS XL puede medir partículas de hasta 1500 m de tamaño, pero su sensibilidad en el rango inferior de diámetro es menor en comparación con la de la COPAS Plus. Tanto el COPAS Plus y el COPAS XL no pueden analizar las partículas menores de 30 micras. Esto implica que las esporas o células microbianas individuales no pueden ser analizados. Además, la COPAS no puede analizar con precisión pequeños agregados de células o esporas y las muy pequeñas micro-colonias. Para esto, se deben utilizar analizadores celulares regulares. Esta limitación se supera por la Biosorter de Unión Biometrica, que puede analizar partículas en el rango de 1-1,500 m. El premio compra sin embargo es mayor. t &quot;&gt; Solución de problemas El COPAS es un instrumento robusto que es fácil de operar. Sin embargo, a veces granulado no se detectan después de cargar una muestra en la copa de muestra y de iniciar la medición. La causa suele ser un tubo de entrada obstruido, que puede ser resuelto fácilmente pulsando el comando &quot;limpia&quot;. Esto obligará a los pellets de vuelta desde el sistema de tubería en la copa de muestra. Una razón alternativa podría ser que la tapa no está correctamente colocado en la copa de muestra. Esto conduce a la pérdida de presión y el fracaso concomitante para detectar gránulos. Importancia y direcciones futuras Nos centramos aquí en el análisis del tamaño del gránulo pero la configuración COPAS también es capaz de analizar y clasificar basado en la fluorescencia y la densidad. Detección de fluorescencia permite analizar la expresión de genes en base a los periodistas, como las buenas prácticas agrarias. Además, la composición de las células se puede evaluar. Aún más poderosa es la opción para separar pelets de acuerdo con estos parámetrostros. Gránulos Ordenado se pueden utilizar para los análisis posteriores, incluyendo estudios de todos-ómicas. De hecho, hemos ordenado previamente 60.000 gránulos grandes y 200.000 pequeñas, y demostramos que el proteoma fue significativamente diferente entre las grandes y pequeñas bolitas 4. Por tanto, esta tecnología proporciona nuevas pistas para mejorar streptomycetes como fábricas celulares. La principal ventaja de la tecnología COPAS es el tiempo. Estudios anteriores sobre sedimentos celulares se realizaron utilizando microscopía, y esto limita el número de gránulos que se pueden analizar hasta varios cientos 16. Los estudios microscópicos ya se ha sugerido la existencia de dos poblaciones de gránulos en las culturas 16 Streptomyces líquidos de cosecha propia. De hecho, dos poblaciones de gránulos se detectaron independientemente de las condiciones de cultivo en un gran número de diferentes estreptomicetos 4. Esta heterogeneidad de tamaño no se limita a estreptomicetos filamentosos, pero también se observó en hongos filamentosos 12 &lt;/ Sup&gt;. En todos los casos, aún no se conocen los mecanismos subyacentes de la heterogeneidad. La posibilidad de ordenar los pellets de acuerdo con el tamaño y la fluorescencia nos permite desentrañar esos mecanismos.

Estreptomicetos son bacterias del suelo filamentosos que son bien conocidos por su habilidad para hacer antibióticos, así como compuestos que se pueden utilizar como inmunosupresores o para combatir las infecciones por hongos o 1,2 cáncer. Además, estos organismos producen enzimas que son de interés para una amplia gama de aplicaciones industriales 3. La mayoría de estos compuestos comercialmente interesante se producen en biorreactores. Crecimiento de estreptomicetos en biorreactores se caracteriza por la formación de estructuras complejas de hifas interconectado, conocidos como grumos o gránulos. Estas estructuras multicelulares son altamente heterogénea con respecto al tamaño 4 y pueden alcanzar tamaños que son más de un millón de veces más grande que una bacteria unicelular tal como Escherichia coli o Bacillus subtilis. Aunque la heterogeneidad es considerado como un rasgo beneficioso en sistemas biológicos naturales 5, se considera una trampa de producción en la industria. Biocultivos de reactores tienen que ser reproducible y controlable para obtener los mayores rendimientos posibles. Por tanto, una comprensión detallada de la función de cada uno de los tipos de pellets en un biorreactor es crucial para mejorar estreptomicetos como una fábrica de células. La citometría de flujo se utiliza comúnmente para analizar células individuales en una población 6. Los citómetros de flujo pueden adquirir información de multiparamétrico midiendo simultáneamente características de las células (tales como el tamaño, la densidad, y la fluorescencia multicolor). De esta manera, las propiedades de celda se pueden correlacionar lo que contribuye a nuestra comprensión de la heterogeneidad dentro de una cultura y de la existencia de distintas poblaciones de células 6. Instrumentos más especializados han permitido clasificar las células de acuerdo con los parámetros definidos por el usuario. Por ejemplo, los mutantes pueden ser examinados. Después de la selección, estas células mutantes pueden ser cultivadas para una caracterización adicional. Esto ya ha demostrado ser útil, entre otros,para mejorar la productividad de las cepas de 7,8. Las boquillas de los citómetros de flujo permiten típicamente para el paso de las células con un diámetro máximo de aproximadamente 10 micras. Por lo tanto, los pellets de estreptomicetos no pueden ser analizados con los citómetros de flujo regulares. Ellos, sin embargo, pueden ser analizados con el objeto complejo paramétrico Analyzer y Clasificador (COPAS). Al igual que los citómetros de flujo regulares, COPAS puede adquirir datos multiparamétricos de partículas en un alto rendimiento. Dependiendo del tipo de COPAS 10-1,500 micras de tamaño de partículas pueden ser analizados. Además, permite la clasificación de las partículas individuales que se pueden utilizar para el cultivo o análisis aguas abajo, tales como el aislamiento de ADN, ARN, o proteínas. COPAS se diseñó inicialmente para el análisis y la clasificación de pequeños organismos multicelulares, tales como los nematodos Caenorhabditis elegans 9, y embriones de Drosophila y larvas 10. Los instrumentos también se han utilizado para el pez cebra 11 unnd 12,13 por hongos filamentosos. Los últimos organismos también forman sedimentos miceliales que son incluso más grandes que las formadas por bacterias filamentosas. Recientemente hemos demostrado que el uso de COPAS también es factible para estreptomicetos 4. Estamos aquí describir el procedimiento experimental para el uso de las COPAS para evaluar la heterogeneidad de pellets en Streptomyces coelicolor, incluyendo detalles sobre la metodología para clasificar pelets de acuerdo al tamaño. Tenga en cuenta, sin embargo, que este método también se puede utilizar para el análisis de otros estreptomicetos formadora de gránulos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="992">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Copas PLUS</td>
			<td style="width:183px;">Union Biometrica</td>
			<td style="width:119px;">PLUS</td>
			<td style="width:479px;">Large particle flow cytometer including lasers and software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P9791</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Difco Yeast Extract</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>210933</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Peptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oxoid Malt Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>OXLP0039B</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2.6H2O</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>Media components. Add after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:212px;">Formaldehyde Solution</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td style="width:479px;">Fixation of pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hypochlorite Solution&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">71696</td>
			<td>For cleaning of the instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EtOH</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20816.367</td>
			<td>For cleaning of the instrument</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:212px;">Erlenmeyer Flask (250 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td>214-1132</td>
			<td>Culture flask for growing Streptomyces</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Springs</td>
			<td style="width:183px;">Verenfabriek De Spiraal</td>
			<td style="width:119px;">Custom-Made</td>
			<td>Used in culture flask. RVS1.4401/Length 210 mm/Diameter 17 mm/Pitch 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Sterile Centrifuge Tube (15 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Sarstedt</td>
			<td>62.554.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Syringes (50 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td>Z683698&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sorting of streptomyces cell pellets using a complex object parametric analyzer and sorter

Estreptomicetos son bacterias del suelo filamentosos que se utilizan en la industria para la producción de enzimas y antibióticos. Cuando se cultiva en biorreactores, estos organismos forman redes de hifas interconectada, conocida como pellets, que son heterogéneos en tamaño. Aquí se describe un método para analizar y pellets de tipo de micelio usando un Objeto Complejo paramétrico Analyzer y Clasificador (COPAS). Las instrucciones detalladas se indican para el uso del instrumento y el análisis estadístico básico de los datos. Además, nos describimos como bolitas se pueden clasificar de acuerdo a los ajustes definidos por el usuario, lo que permite el procesamiento aguas abajo, tales como el análisis del ARN o de proteínas. Con esta metodología el mecanismo de crecimiento heterogéneo subyacente puede ser abordado. Esto será fundamental para mejorar estreptomicetos como una fábrica de células, teniendo en cuenta el hecho de que la productividad se correlaciona con el tamaño de pellets.

Mediciones COPAS de pellets de Streptomyces Estreptomicetos forman sedimentos miceliales en cultivos líquidos que tienen una amplia gama de tamaños. Para analizar la distribución de tamaño de los gránulos, un líquido 2-días de edad crecido Streptomyces coelicolor cultura fue sometido a flujo de partícula grande citometría usando un COPAS Plus de perfiles equipada con una boquilla de 1 mm. Una salida COPAS típico es un gráfico de dispersión tal como se visualiza en la Figura 2A. El eje x representa el (TOF) de tiempo-de-vuelo, que se correlaciona con el tamaño de precipitado (es decir, se tarda más tiempo para gránulos más grandes para pasar el haz de láser). El eje y muestra la extinción, que representa la densidad óptica del objeto. Cada punto en el gráfico de dispersión corresponde a un evento individual, es decir, una única pastilla de pasar el haz de láser. Es importante destacar que cuando la muestra está demasiado concentrada (es decir, cuando el láser detecta más de 100 eventos / seg), el COPAS con frecuencia no detecta p individuoellets. Esto conduce a valores de TOF falsas que son demasiado altos. La dilución de la muestra reduce los valores medios TOF, hasta un punto en el que más de dilución ya no hace impacto TOF. Este punto se alcanza cuando se analizaron aproximadamente 100 bolitas / seg. Trazado de los puntos de datos en un histograma indica que los tamaños no se distribuyen normalmente (Figura 2B). La distribución parece estar sesgado hacia la derecha. Iniciar la transformación del conjunto de datos también no dio lugar a una distribución normal (Figura 2 C). Para evaluar si la distribución de tamaño puede explicarse por el supuesto de una mezcla de dos distribuciones normales de los datos se modela matemáticamente 12,15. Modelado de hecho indicó que la distribución del tamaño se puede explicar suponiendo la existencia de dos poblaciones distintas de gránulos. La población de pequeños gránulos consistió en 92% de todos los gránulos con un tamaño medio de 248 micras, mientras que la población de gran PELpermite (8% de todos los gránulos) tenía un tamaño medio de 319 micras (tenga en cuenta que se supone que dos poblaciones de existir cuando la fracción de la participación es entre 2,5 a 97,5%). Clasificación de pellets de Streptomyces de acuerdo al tamaño Fueron ordenados micro-colonias de las poblaciones de gránulos grandes y pequeños. Para este fin, se utilizaron los tamaños medios de pellets de las dos poblaciones para definir los límites para la clasificación. Pellets más pequeñas que 248 micras se considera que a partir de la población de pellets pequeña, mientras que gránulos más grandes que 319 micras se considera que a partir de la gran población de pellets (Figura 3), a fin de limitar la clasificación de gránulos a partir de la parte de superposición de los dos tamaño distribuciones. El análisis microscópico de los pellets ordenados mostró sus tamaños distintos (Figura 3). Los gránulos recogidos se pueden utilizar adicionalmente para el ADN, ARN, o aislamientos de proteína. &lt;img alt = &quot;Figura 1&quot; fo: content-width = &quot;5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51178/51178fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1. Representación esquemática del montaje experimental para medir y analizar el uso de pellets de Streptomyces COPAS. Para obtener más detalles, consulte los procedimientos experimentales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51178/51178fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51178/51178fig2.jpg" /> Figura 2. Heterogeneidad tamaño Pellet en cultivos de Streptomyces líquidos de cosecha propia. Análisis COPAS de un 2 días de edad S. cultura YEME coelicolor (A) indica que los tamaños de pellets (indicado como tiempo de los valores de vuelos) Normalmente no distribuyed (B), y tampoco convertirse así que cuando log-transformado (C). En cambio, se detectaron dos poblaciones de gránulos que difieren en TOF (y por tanto el tamaño). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51178/51178fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51178/51178fig3.jpg" /> Figura 3. El fraccionamiento de pastillas Streptomyces según el tamaño. Pellets con un tamaño menor que 248 micras (indicado en rosa) fueron considerados como pequeñas bolitas, mientras que se consideraron gránulos con un tamaño superior a 319 micras (indicado en azul) para ser grandes gránulos. El análisis microscópico confirmó la diferencia de tamaño. Tenga en cuenta que estos tamaños se calcularon a partir de los datos de transformación logarítmica utilizando la relación descrita entre TOF y la diameter de una pastilla Streptomyces, lo que equivale a 0,57 × TOF + 159 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a>

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Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Culturas Streptomyces líquidos cultivados se caracterizan por sedimentos miceliales que son heterogéneos en tamaño. Se describen un método para analizar y clasificar dichos gránulos en una forma de alto rendimiento. Estos pellets se pueden utilizar para otros análisis, que proporcionarán pistas para comprender y controlar la heterogeneidad del crecimiento.

Clasificación de<em&gt; Streptomyces</em&gt; Pellets de celda que utilizan un objeto complejo paramétrico Analyzer y Clasificador

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

sorting-streptomyces-cell-pellets-using-complex-object-parametric

Research

JoVE Journal

Biology

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

10.9K vistas.  Leiden University.  Culturas Streptomyces líquidos cultivados se caracterizan por sedimentos miceliales que son heterogéneos en tamaño. Se describen un método para analizar y clasificar dichos gránulos en una forma de alto rendimiento. Estos pellets se pueden utilizar para otros análisis, que proporcionarán pistas para comprender y controlar la heterogeneidad del crecimiento. 

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A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes. The device consists of three layers: first layer contains an array of microscale wells (500 &mu;m diameter and 150 &mu;m depth) that help to immobilize the islets while exposed to flow and maximize the exposed surface area of the islets; the second layer contains a circular perifusion chamber (3 mm deep, 7 mm diameter); and the third layer contains an inlet-mixing channel that fans out before injection into the perifusion chamber (2 mm in width, 19 mm in length, and 500 &mu;m in height) for optimizing the mixing efficiency prior to entering the perifusion chamber. The creation of various glucose gradients including a linear, bell shape, and square shapes also can be created in the microfluidic perifusion network and is demonstrated.

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes.

A multi-paramétricos Islet Sistema Perifusion dentro de un dispositivo de microfluidos Perifusion

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence ...

Investigación

Biología

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

Fluorescencia de células activadas por la clasificación de los protoplastos de la planta

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

Lípidos vesículas mediada por cromatografía de afinidad utilizando magnética clasificación de células activadas (LIMACS): un nuevo método para analizar la interacción de proteínas y lípidos

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

Análisis específico de célula de<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Hojas usando citometría de flujo

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Optimizado manchas y Proliferación métodos de modelización para la vigilancia del uso de tintes División Celular Celulares de seguimiento

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

El Protein Complex Plataforma de Producción MultiBac en el EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Análisis de una sola partícula de código abierto para el Super-resolución Microscopía con VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the mechanisms are not well understood. To investigate coral response to stressors, we need tools for analyzing cellular responses. In particular, we need tools that facilitate the application of functional assays to better understand how cell populations are reacting to stress. In the current study, we use fluorescence-activated cell sorting (FACS) to isolate and separate different cell populations in stony corals. This protocol includes: (1) the separation of coral tissues from the skeleton, (2) creation of a single cell suspension, (3) labeling the coral cells using various markers for flow cytometry, and (4) gating and cell sorting strategies. This method will enable researchers to work on corals at the cellular level for analysis, functional assays, and gene expression studies of different cell populations.

Corals create biodiverse ecosystems important for both humans and marine organisms. However, we still do not understand the full potential and function of many coral cells. Here, we present a protocol developed for the isolation, labeling, and separation of stony coral cell populations.

Clasificación celular activada por fluorescencia para el aislamiento de las poblaciones celulares escleractinianas

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...

Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, prevent fracture. In the interest to both optimize peak bone mass and combat various musculoskeletal diseases (i.e., post-menopausal osteoporosis, anorexia nervosa, type 1 and 2 diabetes mellitus), incredible efforts have been made in the field of bone biology to fully characterize osteoblasts throughout their differentiation process. Given the primary role of mature osteoblasts to secrete matrix proteins and mineralization vesicles, it has been noted that these processes take an incredible amount of cellular energy, or adenosine triphosphate (ATP). The overall cellular energy status is often referred to as cellular bioenergetics, and it includes a series of metabolic reactions that sense substrate availability to derive ATP to meet cellular needs. Therefore, the current method details the process of isolating primary, murine bone marrow stromal cells (BMSCs) and monitoring their bioenergetic status using the Real-time cell metabolic flux analyzer at various stages in osteoblast differentiation. Importantly, these data have demonstrated that the metabolic profile changes dramatically throughout osteoblast differentiation. Thus, using this physiologically relevant cell type is required to fully appreciate how a cell's bioenergetic status can regulate the overall function.

Real-time cell metabolic flux assay measures the oxygen consumption rate and extracellular acidification rate, which corresponds to mitochondrial and glycolytic adenosine triphosphate production, using pH and oxygen sensors. The manuscript explains a method to understand the energy status of osteoblasts and the characterization and interpretation of the cellular bioenergetic status.

Uso del analizador de flujo metabólico celular en tiempo real para monitorear la bioenergética de osteoblastos

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, ...

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids potential pitfalls caused by the heterogeneity of tissues and unleashes the powerful transcriptome analysis. The protocol described here demonstrates how to use the Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) method to isolate ribosome-bound RNAs from a small amount of EGFP-expressing cells in a complex tissue without cell sorting. This protocol is suitable for isolating cell-type-specific RNAs using the recently available NuTRAP mouse model and could also be used to isolate RNAs from any EGFP-expressing cells.

This protocol aims to isolate cell-type-specific translating ribosomal mRNAs using the NuTRAP mouse model.

Aislar ARN específicos del tipo de célula de muestras de tejido heterogéneo congeladas a presión sin clasificación celular

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...