Este trabajo fue apoyado por una concesión de NIH / NHGRI Genoma Académico / Facultad de Transición (K22 HG002908) de AMD y una asociación estratégica entre el Instituto de Biología de Sistemas y la Universidad de Luxemburgo. Las solicitudes de las cepas o plásmidos se deben dirigir a Aimée Dudley (aimee.dudley @ gmail.com).

1. Strain Construcción y caracterización <ol><li> Construir la cepa diploide heterocigótico para ser utilizado en la cruz en el apareamiento de cepas haploides y diploides seleccionar 2 o el uso de una cepa heterocigótica de origen natural. Las cepas no deben albergar GFP. </li><li> Confirme que la cepa es incapaz de crecer en YPD 2 + 200 mg / ml de G418. </li><li> Confirme que la cepa es capaz de esporulación. BEST es compatible con cruces de baja eficiencia esporulación, pero requiere aumentar la frecuencia baja esporulación FACS tiempo de clasificación. <ol><li> Establecer un cultivo O / N de la cepa en 5 ml de YPD y crecer con agitación a 30 ° C. </li><li> Lavar 0,5 ml del cultivo O / N tres veces con PBS (pH 7,4). </li><li> Sedimenten las células lavadas, separar el sobrenadante y volver a suspender en 2 ml de medio de esporulación 7. </li><li> Agite las células a temperatura ambiente y compruebe diariamente para la formación de cuarteto con un microscopio óptico de contraste de fase con un objetivo de 40X. </li> &lt;/ Ol&gt; </li><li> Estimar la viabilidad de las esporas de la cruz por la disección convencional 2,3 de un número pequeño (~ 20) de tétradas. Viabilidad de las esporas en los cruces entre diferentes fondos de deformación es muy variable e impredecible. Sin embargo, las expectativas a priori de viabilidad de las esporas se pueden utilizar para evaluar la eficiencia de un MEJOR experimento antes de los de mano de obra y de alto coste pasos de ahorro y genotipificación de las cepas. Por lo tanto, es muy recomendable este paso. </li></ol> 2. Transformación de diploides con la Biblioteca de Códigos de Barras plásmidos <ol><li> Insertar el plásmido con código de barras pCL2_BC en la cepa diploide heterocigótico usando el protocolo de transformación descrito en Gietz y Woods 8 con las siguientes modificaciones. <ol><li> Después las células han sido incubadas con la mezcla de transformación a 30 º C durante 20 min, se añade DMSO hasta 8% del volumen de la mezcla de transformación. La adición de DMSO se ha encontrado para mejorar la eficiencia de transformación in algunos fondos de deformación 9. </li><li> Después de la etapa de choque térmico, sedimentar las células con una breve centrifugación, se decanta la mezcla de transformación, y lavar las células suavemente en YPD. A continuación, volver a suspender las células en 1 ml de YPD y permitir que se recuperen a temperatura ambiente durante 3 h sin agitación. </li></ol></li><li> Seleccionar los transformantes en placas de YPD en + G418 (200 mg / ml) en placas de agar. Para garantizar una piscina complejo de códigos de barras de plásmido, cosechar un gran número de colonias, por ejemplo, 5 placas con ~ 2500 colonias por placa. </li><li> Una vez que las colonias son visibles (2-3 días de crecimiento a 30 ° C), en común los transformantes raspando cuidadosamente de la placa en líquido YPD + G418 (200 mg / ml) + 15% de glicerol. Vortex esta suspensión celular, transferir a un vial de crioconservación, y congelar a -80 ° C. Hacer una reserva congelada por separado para cada plato. Estas existencias congeladas sirven como las cepas de partida para la etapa 3.1 y también se pueden utilizar para generar más tétradas en una fecha posterior, si se desea. </li&gt; </ol> 3. Esporulantes la Biblioteca de células transformadas obtener Barcoded Tétradas <ol><li> Revive las células de los stocks congelados creados en 2.3 por el crecimiento de O / N en 5 ml de YPD + G418 (200 mg / ml) a 30 ° C con agitación. </li><li> Lavar las células de la O / N culturas 3x en PBS (pH 7,4) y luego volver a suspender las células en medio de esporulación 7 más 200 mg / ml de G418. </li><li> Agite culturas esporulación a TA y monitorear el progreso de esporulación diariamente hasta nuevos tétradas han dejado de formar. </li><li> Una vez que el cultivo contiene tétradas bien formados y relativamente pocos diadas, retire las culturas de la agitación y dejar a temperatura ambiente durante al menos 7 días. Mientras que algunos cruces pueden ser susceptibles a la digestión en placa y la interrupción tan pronto como tétradas se han formado (evaluado como se describe en 7.3), la incubación adicional (7-10 días en nuestros experimentos) es esencial para otros cruces. Por lo tanto, es muy recomendable este paso. </li></ol> 4. Establecerlas Puertas FACS para Tetrad clasificación El meióticamente expresó fusión SPS2-GFP en el plásmido pCL2_BC permite tétradas en la cultura esporulación a ser detectados y aislados del cultivo por fluorescencia. El siguiente protocolo ha sido desarrollado para una FACSAria II. <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51401/51401fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. FACS puertas. Una serie de cuatro puertas secuenciales se utiliza para aislar tétradas. Las puertas que se muestran en (A) y (B) ayudan a reducir el número de grupos. Eventos fluorescentes se seleccionan con la puerta en (C). El histograma en (D) tiene dos picos. Eventos en el pico izquierdo son principalmente tétradas (imagen del recuadro de la izquierda), y los acontecimientos en el pico de la derecha son generalmente tétradas con una yema adjunto (imagen de la inserción a la derecha). Una puerta final esaplicado a este histograma para seleccionar los eventos que son en su mayoría tétradas (barras rojas). Esta cifra ha sido modificado desde Ludlow, et al 1. <ol><li> Cargue el cultivo esporulado en un clasificador FACS y la creación de dos de dispersión y la dispersión lateral puertas delanteras para excluir los desechos, las células agrupadas, y varias células por gota (Figuras 2A y 2B). </li><li> No debe haber una población de células fluorescentes, que cuando se utiliza el constructo indicador SPS2-GFP incluyen díadas y tétradas 10. Puerta de la GFP frente a FSC para incluir estos eventos fluorescentes (Figura 2 C). </li><li> Dependiendo de la cepa de fondo puede ser necesario para incluir una puerta adicional para eliminar grumos que incluyen tétradas y otras células. Si esto es necesario, inspeccionar un histograma FSC de los eventos fluorescentes y especifique una puerta que incluye eventos con menor FSC (Figura 2D, eventos cerrados están en rojo). </li><li> Controlar la eficacia de t<html> que gating régimen de clasificación por ~ 1500 tétradas en un portaobjetos de microscopio y contando la proporción de tétradas a los no tétradas usando un microscopio de contraste de fases con un aumento de 400X. El por ciento de tétradas se puede estimar con precisión contando sólo ~ 200 eventos según, pero la clasificación ~ 1500 reduce la cantidad de tiempo de búsqueda de células sobre el portaobjetos de microscopio. Alternativamente, la relación de tétradas a los no tétradas se puede evaluar durante el Paso 4.5. </li><li> Comprobar periódicamente que el clasificador está informando con precisión el número de eventos por clasificación 25 tétradas en un portaobjetos de microscopio y el examen de las células contenidas en la gotita usando un microscopio de contraste de fases con un aumento de 400X. No debe haber 25 tétradas en la gotita. Repetir 3-4x para evaluar la varianza del instrumento de FACS. </li></ol> 5. Sorting Tétradas sobre una placa de agar p_upload/51401/51401fig3highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figura 3. Colocación de la placa de agar en el clasificador FACS. Para ordenar tétradas en una pequeña gota de la solución zimoliasa colocado en el centro de un estándar (circular) placa de agar, un estándar (100 mm rectangular) placa de 96 pocillos es primero colocado en el escenario de la clasificador de células y el clasificador está programado para depositar tétradas en un pozo específico (en este caso D5). Entonces, la placa de agar circular se coloca en la parte superior de la placa de 96 pocillos y se alinea de manera que la gota de zimoliasa está centrado sobre el bien especificado. <ol><li> Calentar el número deseado de placas de YPD + G418 (200 mg / ml) durante al menos 1,5 horas en una incubadora a 37 ° C posicionado cerca de la clasificador FACS. </li><li> Una característica clave del protocolo de clasificación es la capacidad de localizar con precisión FACS tétradas a una ubicación específica en una placa de agar que contiene una piscina de solución zimoliasa. Para ello, coloque un &quot;hito&quot; placa de 96 pocillos en tél automatizado unidad de deposición de células (ACDU) del clasificador. Preparar un diseño de tipo que va a clasificar 25 tétradas en un pocillo de un formato de 96 pocillos. Elija un pozo cerca de la mitad de la placa, por ejemplo, así D5. Figura 3 muestra una placa de Petri y placa de 96 pocillos se cargó en un clasificador de células. Clasificación 25 tétradas por placa produce colonias bien separadas. </li><li> Traiga una pila de 10 placas de agar de la incubadora a 37 º C para el clasificador. </li><li> Tomar una placa de agar de pipeta y 25 l de solución de zimoliasa (1 mg / ml en 0,7 M de sorbitol) sobre el agar cerca del centro de la placa. Luego, coloque la placa en la placa de 96 pocillos de interés, la alineación de la gota zimoliasa sobre el objetivo y desde el paso 5.2, por ejemplo, así D5. </li><li> Iniciar el tipo y depositar 25 tétradas en el medio de la gotita de zimoliasa sobre la placa de agar. Entonces, quite y cubrir el plato. </li><li> Repetir los pasos 5.4 y 5.5 hasta 25 tétradas han sido ordenados en gotitas zimoliasa sobre cada placa de la pila. </li&gt; <li> Devuelva la pila de platos que contienen tétrada-a la incubadora a 37 ° C. </li><li> Repetir los pasos 5.3 a través de 5.7 hasta que todas las placas tienen tétradas. </li></ol> 6. Separación Esporas <ol><li> Incubar cada pila de placas de agar que contiene tétrada-a 37 ° C durante 1,5 h. </li><li> Retire las placas de la incubadora, agregue 15-25 perlas de vidrio estériles de 3 mm por placa, y agitar las placas como una pila (o como dos lotes de 5 unidades) durante 3-5 minutos. La mejor separación de esporas se logra moviendo las placas de forma rígida de lado a lado o de adelante hacia atrás. No mueva las placas de tal manera que la cuentas &quot;swirl&quot; alrededor del borde exterior de la placa. Deje las cuentas en las placas cuando haya terminado. </li><li> Coloque la pila de platos con cuentas boca arriba en una incubadora a 30 ° C. Recuperar los próximos placas de pila de la incubadora a 37 ° C, y repita el paso 6.2. </li><li> Incubar las placas O / N a 30 ° C. </li></ol> 7. Cosecha Colonias <ol><li> Despuésuna incubación O / N a 30 ° C, las colonias pequeñas deben haberse formado en las placas. Retire con cuidado las placas de la incubadora sin molestar a las perlas de vidrio. </li><li> Retire las perlas de vidrio con cuidado e invirtiendo rápidamente las placas sobre un recipiente hondo. El recipiente debe ser lo suficientemente profunda para coger las bolas sin permitir que rebotan hacia arriba y golpear la placa de agar. Al tocar la parte inferior de la placa, mientras que se invierte puede ayudar a desalojar los granos que se pegan a la placa. Estas perlas pueden ser reutilizados por lavado a fondo con jabón, enjuagar bien con agua desionizada y esterilización en autoclave. </li><li> Contar el número de colonias en cada placa y utilizar el número de colonias para estimar la eficiencia de la separación y la recuperación de esporas. Por ejemplo, 25 tétradas por placa de una cruz con cerca de 100% de viabilidad podrían producir un total de 100 colonias por placa. </li><li> Desde placas con un número suficiente de colonias (&gt; 65 por unos cruces de alta viabilidad), células de transferencia de cada coloNY en un pocillo separado de una placa de 96 pocillos que contiene líquido YPD + G418. Además, tome nota de que los pozos contienen colonias de la misma placa de agar; esta información se utiliza para ayudar al software de asignación de tétrada. </li><li> Utilice las placas de 96 pocillos líquidos para sembrar cultivos para la genotipificación y para el ahorro de cepas como acciones de glicerol congelado. Los detalles de la secuenciación RAD-tag y análisis de la secuencia se pueden encontrar en Ludlow et al 1. </li></ol>

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	<li>Ludlow, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+tetrad+analysis.">High-throughput tetrad analysis.</a> Nat Methods. 10, 671-675 (2013).</li><li>Rose, M., Winston, F., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics A Laboratory Course Manual. , (1990).</li><li>Morin, A., Moores, A. W., Sacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Saccharomyces+cerevisiae+asci.">Dissection of Saccharomyces cerevisiae asci.</a> J Vis Exp. 27, (2009).</li><li>Winge, O., Laustsen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+two+types+of+spore+germination,+and+on+genetic+segregations+in+Saccharomyces+demonstrated+through+single+spore+cultures.">On two types of spore germination, and on genetic segregations in Saccharomyces demonstrated through single spore cultures.</a> C.R. Trav. Lab. Carlsberg Ser. Physiol. 24, 263-315 (1937).</li><li>Coluccio, A., Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspore+bridges:+a+new+feature+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+spore+wall.">Interspore bridges: a new feature of the Saccharomyces cerevisiae spore wall.</a> Microbiology. 150, 3189-3196 (2004).</li><li>Baird, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+SNP+discovery+and+genetic+mapping+using+sequenced+RAD+markers.">Rapid SNP discovery and genetic mapping using sequenced RAD markers.</a> PLoS One. 3, (2008).</li><li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants.">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate/single-stranded+carrier+DNA/polyethylene+glycol+method.">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods Enzymol. 350, 87-96 (2002).</li><li>Hill, J., Donald, K. A., Griffiths, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMSO-enhanced+whole+cell+yeast+transformation.">DMSO-enhanced whole cell yeast transformation.</a> Nucleic Acids Res. 19, 5791-57 (1991).</li><li>Gerke, J. P., Chen, C. T., Cohen, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+isolates+of+Saccharomyces+cerevisiae+display+complex+genetic+variation+in+sporulation+efficiency.">Natural isolates of Saccharomyces cerevisiae display complex genetic variation in sporulation efficiency.</a> Genetics. 174, 985-997 (2006).</li><li>Bloom, J. S., Ehrenreich, I. M., Loo, W. T., Lite, T. L., Kruglyak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+sources+of+missing+heritability+in+a+yeast+cross.">Finding the sources of missing heritability in a yeast cross.</a> Nature. 494, 234-237 (2013).</li><li>Fogel, S., Mortimer, R., Lusnak, K., Tavares, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+gene+conversion:+a+signal+of+the+basic+recombination+event+in+yeast.">Meiotic gene conversion: a signal of the basic recombination event in yeast.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 43 Pt 2, 1325-1341 (1979).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Muchas de las áreas de investigación de la genética, que van de cartografía rasgo complejo 11 para el estudio de los mecanismos subyacentes de recombinación de ADN 12, requieren un número extremadamente grande de la progenie y los altos volúmenes de secuenciación de ADN. Las técnicas que se casan con el poder de los enfoques convencionales con la capacidad de alto rendimiento de secuenciación de ADN tienen el potencial de permitir estudios que antes eran intratables. Aunque varios métodos de genética de la levadura de alto rendimiento se han aplicado de manera efectiva a los problemas específicos, cada uno tiene limitaciones que no llegan a la amplia aplicabilidad de análisis tétrada convencional. MEJORES enfrenta a estos retos mediante el empleo de un enfoque de alto rendimiento que combina la disección tétrada y genotipificación de la progenie de cruces de levadura. Junto con multiplexado secuenciación RAD-tag, MEJOR ofrece una manera económica de recoger información del genotipo para cada cepa progenie preservando relaciones tétrada por medio de códigos de barras tétrada únicas.0; De utilizarse toda la actualidad métodos de alto rendimiento, MEJOR recapitula más de cerca la información proporcionada por una cruz de levadura disecados manualmente. MEJOR tiene dos características fundamentales. El primero es el uso de FACS para aislar rápidamente tétradas de distancia a partir de células no esporulados en la cultura (Protocolo pasos 5-6). La capacidad de aislar miles de eventos fluorescentes (tétradas) da BEST su mayor ganancia en el rendimiento. Esta automatización ofrece una mayor ventaja sobre la disección manual para cruces con baja eficiencia esporulación, debido al aumento del tiempo necesario para identificar visualmente los eventos raros. La segunda característica clave es el uso de un código de barras molecular altamente complejo (Protocolo Paso 2) que se transmite a cada uno de esporas hermana de una tétrada. Debido a que estos códigos de barras pueden utilizarse para computacionalmente reconstruir las relaciones entre tétrada esporas que se han distribuido aleatoriamente a través de una placa de agar, la necesidad de manualmente las células de la matriz en una red ordenada se alivia. Finalmente,debido a que el código de barras molecular y el gen reportero GFP-esporulación específica están vinculados físicamente (en el mismo plásmido), sólo tétradas que han retenido el código de barras molecular se seleccionan por la separación FACS. Hay dos consideraciones que rigen la longitud de tiempo que los cultivos deben ser incubados en el medio de esporulación. En primer lugar, debido a que el reportero en particular la esporulación (SPS2-GFP) se expresa al principio de la meiosis, solo GFP no distingue completas tétradas 4 de esporas a partir de células que no han completado la meiosis (es decir, las diadas). Mientras gating FACS adicional puede disminuir el número de tétradas, incompletos fluorescentes, la forma más fácil de disminuir estos eventos no deseados simplemente monitoreando la cultura esporulación (Paso 3.3) y proceder una vez nuevos tétradas han dejado de formar. En nuestros experimentos, la frecuencia de díadas según es menos de 1%. En segundo lugar, para algunos cruces tiempo adicional en medio de esporulación a temperatura ambiente sin agitación (Paso 3.4) sigsignificativamente mejora la separación de tétradas por las perlas de vidrio durante chapado ((Protocolo Paso 6). De hecho, este paso es absolutamente necesario para la interrupción de algunos cruzamientos. Al igual que todos los métodos de alto rendimiento, mejor es &quot;ruidosa&quot; que el enfoque convencional correspondiente. La modesta reducción en la eficiencia de BEST en comparación con la disección tétrada convencional podría ser el resultado de combinaciones de varios factores. Un factor es el aumento de la pérdida de esporas viables de otra manera, lo que podría resultar de la adhesión a las perlas de vidrio durante la extensión o aumento de la muerte de esporas debido a los esfuerzos mecánicos del proceso. Un segundo factor que podría ser simple pérdida de plásmido durante la meiosis. Un tercer factor podría ser una disminución efectiva en colonias utilizables resultantes de colonias con genotipos mixtos, se estima que ~ 5% de colonias en nuestro piloto cruza 1. Es probable que estas colonias representan fracasos de la hermana de separación de esporas. Debido a la rápida Fluorescence clasificación y separación de esporas permitir la recolección de un número enorme de tétradas, MEJOR está bien equipado para superar una disminución en la eficiencia en esta escala. Mientras que las versiones futuras de BEST podría aumentar la eficiencia próxima a la de la disección manual, que es tal vez más probable que la actual trayectoria exponencial de la capacidad de secuenciación de ADN compensará rápidamente para este nivel de pérdida de tensión utilizable. En cualquier caso, la capacidad de realizar análisis de tétrada en la escala a la que se puede aplicar mejor permitirá a los estudios que se encuentran actualmente inviable por métodos manuales.

Mapeo de genes meiótica, comúnmente conocida como análisis de tétrada, es central a la genética de la levadura. En resumen, dos cepas haploides, cada uno contienen una sola copia de cada cromosoma, se acoplan para formar una cepa diploide heterocigótico con dos copias de cada cromosoma, uno de cada padre. Morirse de hambre células diploides para el nitrógeno induce meiosis (esporulación) en el que los cromosomas se duplican, se someten a la reordenación, y se dividen en cuatro células haploides (esporas o segregantes) con nuevas combinaciones de alelos de cada padre. Las cuatro esporas resultantes de una sola meiosis se pueden aislar mediante un proceso manual llamado disección tétrada. Tétrada Convencional 2,3 disección que ha cambiado relativamente poco desde la publicación original en 1937 4, tiene tres objetivos. En primer lugar, las células que han sido sometidos a la meiosis (tétradas) deben ser aislados de distancia de un fondo de células vegetativas. En el análisis convencional, esto se logra por un investigador que, utilizandoun microscopio, identifica visualmente tétradas en una placa de agar y emplea un aparato de micromanipulador identificar visualmente tétradas en una placa de agar y utilizando un micromanipulador para mover la tétrada a una zona libre de células de la placa. A continuación, las cuatro esporas en la tétrada deben estar físicamente separados para evitar el apareamiento interspore. Las esporas dentro de una tétrada se mantienen unidas por tanto un asco, el remanente de la pared celular de la célula diploide original, y un conjunto de puentes interspore 5. En el análisis convencional de la tétrada ascus se elimina por digestión enzimática, y un investigador utiliza el micromanipulador para romper los puentes interspore y desmenuzar las esporas. Finalmente, las esporas individuales están dispuestos en un patrón cuadriculado que mantiene la relación entre las esporas, es decir, toda la progenie en una fila de cuatro esporas son hermanas de la misma tétrada originales. Un investigador de la levadura experimentado puede completar el proceso de disección 10 tétradas (un número mínimo de aceptación generalpor la cruz) en aproximadamente 15 min. Hemos desarrollado un nuevo método de genotipificación tétrada de alto rendimiento, lo que llamamos B arcode E nabled S equencing de T etrads (BEST) 1. MEJOR expande sobre los métodos actuales de la genética de alto rendimiento al permitir la generación y el genotipado de un gran número de descendientes que son aislados, genotipo, y mantenidos como individuos de una manera que permite a las relaciones de esporas de la hermana de los cuatro productos meióticos que deben recuperarse. Esto se logra mediante tres estrategias principales (Figura 1). En primer lugar es la introducción de un constructo indicador que marca las células que se han sometido a la meiosis con GFP y les permite ser aislados por células activadas por fluorescencia (FACS). En segundo lugar es la incorporación de un código de barras de ADN altamente complejo (una cadena de 15 nucleótidos aleatorios) en una forma que se transmite a todas las cuatro esporas de una tétrada y puede ser leído por la secuenciación del ADN de la Progen recombinantey por lo identifica esporas hermanas de la misma tétrada. En tercer lugar es el paso de genotipado, y lo mejor es compatible con numerosas plataformas de genotipado que capturan tanto un conjunto de marcadores genómicos, así como el código de barras-tétrada específico. Empleamos un sitio de restricción de secuenciación de ADN asociada a la etiqueta (RAD-ss) 6 método que dirige la secuenciación del genoma de sitios de restricción específicos 1, de ese modo la captura de una coherente 2-3% del genoma de las cepas de la progenie, así como el código de barras plásmido transmitidas . La recuperación de las relaciones tétrada junto con los datos de genotipado obtenida de forma empírica desde la cruz permite la inferencia exacta de la información faltante, incluyendo el estado de los marcadores con baja cobertura de secuencia y el genotipo completo de individuos inviables (y por lo tanto no recuperables). Aquí, se describe la aplicación del método en el microorganismo más comúnmente usado para el mapeo de meiótica, la levadura S. cerevisiae. Sin embargo, con las sustituciones menores de rea-organismo específicocaballeros, por ejemplo, diferentes proteínas esporulación específicos fusionados a GFP, el método deben ser fácilmente transferibles a otros microorganismos, incluidos los organismos en los que la cartografía meiótica es significativamente más mano de obra intensiva o actualmente intratable. <img alt="Figura 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51401/51401fig1highres.jpg" width="400" /> Figura 1. Mejor método. (A) El plásmido pCL2_BC es un plásmido de 2 micras con una fusión GFP-esporulación específica, resistencia a G418, y un código de barras aleatorio 15-mer. Construcción de la biblioteca de plásmidos se describe en Ludlow et al 1. (B) Un grupo de plásmidos con código de barras se transforma en la cepa diploide de una cruz. (C) Los transformantes se cultivaron a continuación en la selección y ~ 10.000 colonias transformadas se reúnen y se esporulados. Durante la meiosis cada uno de esporas de una tétrada hereda un copy del plásmido con código de barras. (D) tétradas se separan de las células no esporulados por FACS y se recogieron en placas de agar, donde se digieren y se interrumpieron para permitir que cada uno de esporas para formar una colonia. (E) Las colonias se recogieron a continuación en placas de 96 pocillos, fenotipados, y genotipo. Durante el genotipado del código de barras plásmido se lee y se utiliza para identificar a los cuatro miembros de cada tétrada. Esta cifra ha sido modificado desde Ludlow et al 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51401/51401fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="726">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">FACSAria II (Special order unit)</td>
			<td style="width:149px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">-</td>
			<td style="width:155px;">Other cell sorters should work for this procedure. The key factors are: (1) a laser/detection system for the fluorescent reporter being used (488nm laser to excite EGFP in our case), (2) the ability to sort single events, (3) the ability to sort onto microscope slides for assessing the sort quality and (4) the ability to sort onto petri dishes (which may need</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Automated Cell Deposition Unit (for FACSAria II)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td colspan="2">643155 (if purchased separately from the FACSAria instrument)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zymolyase 100T</td>
			<td>Seikagaku Biobusiness</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">G418</td>
			<td>A.G. Scientific</td>
			<td></td>
			<td>http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

best: barcode enabled sequencing of tetrads

Análisis Tetrad es una herramienta valiosa para la genética de la levadura, pero la naturaleza laborioso manual del proceso ha impedido su aplicación en gran escala. Barcode Enabled La secuenciación de Tétradas (BEST) 1 sustituye los procesos manuales de aislamiento, lo que altera y espaciar tétradas. MEJOR aislamientos tétradas en virtud de una proteína de fusión GFP-esporulación específica que permita activado por fluorescencia de células de clasificación de tétradas directamente sobre placas de agar, en el que el asco es enzimáticamente digeridos y las esporas se interrumpen y aleatoriamente vistió por grano de cristal de recubrimiento. Las colonias haploides se asignan relaciones esporas hermanas, es decir, la información sobre la que las esporas se originaron de la misma tétrada, utilizando los códigos de barras moleculares leídos durante el genotipado. Al eliminar el cuello de botella de la disección manual, cientos o incluso miles de tétradas se pueden aislar en cuestión de minutos. Aquí presentamos una descripción detallada de los procedimientos experimentales necesarios para llevar a cabo mejor en la levaduraSaccharomyces cerevisiae, a partir de una cepa diploide heterocigótico a través del aislamiento de colonias derivadas de la progenie meiótica haploide.

MEJOR puede mejorar en gran medida la velocidad con que las esporas de tétradas se pueden aislar. Como un ejemplo de este método el rendimiento puede entregar, un investigador realizó las clasificación FACS y la separación de esporas (Pasos 5.1 a 6.3) con 149 placas de agar en 3 horas 1. Un rendimiento equivalente (aproximadamente 3.725 tétradas) requeriría más de 90 horas de la disección manual. Sin embargo, como con muchos métodos de alto rendimiento, la iteración actual del método tiene alguna pérdida de eficiencia en comparación con la disección manual. Esta pérdida se manifiesta como una reducción del número de colonias se recuperó en comparación con la expectativa calculada sobre la base de la viabilidad de las esporas de la cruz, determinado por disección manual (paso 1.4). Suponiendo que las causas de la pérdida de esporas (Discusión) afectan esporas al azar, se pueden realizar estimaciones de la cantidad de colonias recuperadas serán miembros de tétradas en la que 1, 2, 3, o 4 esporas han sido recuperadas (Figura 4). Figura 4. Simulación de la eficiencia método en el nivel de la tétrada. Imposibilidad de recuperar con éxito esporas (como colonias) puede ser debido a la inviabilidad de las esporas, la adhesión de esporas a las perlas de vidrio, el fracaso para separar esporas el uno del otro, etc se usó la distribución binomial para calcular la fracción esperada de tétradas (con al menos una de esporas recuperado con éxito) la producción de 4, 3, 2 o 1 colonias sobre la base de la proporción de todas las esporas recuperados con éxito. En este gráfico se puede servir como una guía aproximada de la cantidad de cepas que finalmente se ensamblan en 3 - o 4 - tétradas de esporas. Como el número de colonias por placa aumenta, también lo hace el número de tétradas completos recuperados. En el experimento descrito anteriormente, 25 tétradas de una cruz con esporas viabilidad cercana al 100% (como Determined por disección manual) 1 se sembraron en 149 placas de agar. En este experimento, el número máximo de colonias observadas por placa fue de 80, lo que indica que 20 esporas no lograron formar colonias discretas. El número medio de colonias por placa fue de 62. Colonias de las 61 placas que contienen 65 o más colonias se recogieron y secuenciados. De las 3.700 cepas que pasan el control de calidad de secuenciación, 72% podría ser computacionalmente asignado en 3 - o 4 - tétradas de esporas.

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BEST: Barcode Enabled Sequencing of Tetrads

Barcode Enabled La secuenciación de Tétradas (BEST) sustituye los procesos manuales de aislamiento, lo que altera y espaciar tétradas. MEJOR aislamientos tétradas por fluorescencia de células activadas por la clasificación en placas de agar, separa las esporas por agitación con perlas de vidrio, y determina qué colonias dispuestas al azar se derivaron de la misma tétrada original utilizando códigos de barras moleculares.

MEJOR: Barcode Enabled La secuenciación de Tétradas

Tetrad analysis is a valuable tool for yeast genetics, but the laborious manual nature of the process has hindered its application on large scales. ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.0K vistas.  Pacific Northwest Diabetes Research Institute.  Barcode Enabled La secuenciación de Tétradas (BEST) sustituye los procesos manuales de aislamiento, lo que altera y espaciar tétradas. MEJOR aislamientos tétradas por fluorescencia de células activadas por la clasificación en placas de agar, separa las esporas por agitación con perlas de vidrio, y determina qué colonias dispuestas al azar se derivaron de la misma tétrada original utilizando códigos de barras moleculares. 

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Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Pantallas competitiva Genómica de Bibliotecas de levadura con código de barras

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Investigación

Biología

Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any two individuals is greater than previously thought3. In contrast, array-based genotyping has failed to identify a significant contribution of common sequence variants to the phenotypic variability of common disease4,5. Taken together, these observations have led to the evolution of the Common Disease / Rare Variant hypothesis suggesting that the majority of the "missing heritability" in common and complex phenotypes is instead due to an individual's personal profile of rare or private DNA variants6-8. However, characterizing how rare variation impacts complex phenotypes requires the analysis of many affected individuals at many genomic loci, and is ideally compared to a similar survey in an unaffected cohort. Despite the sequencing power offered by today's platforms, a population-based survey of many genomic loci and the subsequent computational analysis required remains prohibitive for many investigators.
To address this need, we have developed a pooled sequencing approach1,9 and a novel software package1 for highly accurate rare variant detection from the resulting data. The ability to pool genomes from entire populations of affected individuals and survey the degree of genetic variation at multiple targeted regions in a single sequencing library provides excellent cost and time savings to traditional single-sample sequencing methodology. With a mean sequencing coverage per allele of 25-fold, our custom algorithm, SPLINTER, uses an internal variant calling control strategy to call insertions, deletions and substitutions up to four base pairs in length with high sensitivity and specificity from pools of up to 1 mutant allele in 500 individuals. Here we describe the method for preparing the pooled sequencing library followed by step-by-step instructions on how to use the SPLINTER package for pooled sequencing analysis (<a href="http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter" target="_blank">http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter</a>). We show a comparison between pooled sequencing of 947 individuals, all of whom also underwent genome-wide array, at over 20kb of sequencing per person. Concordance between genotyping of tagged and novel variants called in the pooled sample were excellent. This method can be easily scaled up to any number of genomic loci and any number of individuals. By incorporating the internal positive and negative amplicon controls at ratios that mimic the population under study, the algorithm can be calibrated for optimal performance. This strategy can also be modified for use with hybridization capture or individual-specific barcodes and can be applied to the sequencing of naturally heterogeneous samples, such as tumor DNA.

Pooled DNA sequencing is a fast and cost-effective strategy to detect rare variants associated with complex phenotypes in large cohorts. Here we describe the computational analysis of pooled, next-generation sequencing of 32 cancer-related genes using the SPLINTER software package. This method is scalable, and applicable to any phenotype of interest.

La detección de raras variantes genómicas de secuenciación agruparon mediante SPLINTER

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

Mapeo bacterianas redes funcionales y vías en<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Utilizando matrices sintéticas genéticos

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identificación de los complejos de proteínas en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; La purificación mediante afinidad del péptido secuencial en combinación con espectrometría de masas tándem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

La secuenciación de próxima generación de 16S ARN ribosomal genes Amplicones

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

Dirigida análisis de metilación del ADN mediante secuenciación de próxima generación

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplificación, secuenciación de próxima generación, y Genómica Mapeo de ADN retrovirales sitios de integración

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; untranslated regions (UTRs) are generated in differentiated cells whereas proliferating cells preferentially express transcripts with short 3&#39;UTRs. We describe the A-seq protocol, now at its second version, which was developed to map polyadenylation sites genome-wide and study the regulation of pre-mRNA 3&#39; end processing. Also this current protocol takes advantage of the polyadenylate (poly(A)) tails that are added during the biogenesis of most mammalian mRNAs to enrich for fully processed mRNAs. A DNA adaptor with deoxyuracil at its fourth position allows the precise processing of mRNA 3&#39; end fragments for sequencing. Not including the cell culture and the overnight ligations, the protocol requires about 8 h hands-on time. Along with it, an easy-to-use software package for the analysis of the derived sequencing data is provided. A-seq2 and the associated analysis software provide an efficient and reliable solution to the mapping of pre-mRNA 3&#39; ends in a wide range of conditions, from 106 or fewer cells.

3&#039; End Sequencing Library Preparation with A-seq2

This protocol describes a method for mapping pre-mRNA 3&#39; end processing sites.

Extremo 3' secuencia biblioteca elaboración con Sec2 A

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various techniques have been developed to study the morphology and biology of adipose tissue. However, conventional visualization methods are limited to studying the tissue in 2D sections, failing to capture the 3D architecture of the whole organ. Here we present whole-mount staining, an immunohistochemistry method that preserves intact adipose tissue morphology with minimal processing steps. Hence, the structures of adipocytes and other cellular components are maintained without distortion, achieving the most representative 3D visualization of the tissue. In addition, whole-mount staining can be combined with lineage tracing methods to determine cell fate decisions. However, this technique has some limitations to providing accurate information regarding deeper parts of adipose tissue. To overcome this limitation, whole-mount staining can be further combined with tissue clearing techniques to remove the opaqueness of tissue and allow for complete visualization of entire adipose tissue anatomy using light-sheet fluorescent microscopy. Therefore, a higher resolution and more accurate representation of adipose tissue structures can be captured with the combination of these techniques.

The focus of the present study is to demonstrate the whole-mount immunostaining and visualization technique as an ideal method for 3D imaging of adipose tissue architecture and cellular component.

Visualización de estructura del tejido adiposo blanco 3D utilizando tinción de Whole-mount

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Assessment of the Metabolic Effects of Isocaloric 2:1 Intermittent Fasting in Mice

Intermittent fasting (IF), a dietary intervention involving periodic energy restriction, has been considered to provide numerous benefits and counteract metabolic abnormalities. So far, different types of IF models with varying durations of fasting and feeding periods have been documented. However, interpreting the outcomes is challenging, as many of these models involve multifactorial contributions from both time- and calorie-restriction strategies. For example, the alternate day fasting model, often used as a rodent IF regimen, can result in underfeeding, suggesting that health benefits from this intervention are likely mediated via both caloric restriction and fasting-refeeding cycles. Recently, it has been successfully demonstrated that 2:1 IF, comprising 1 day of fasting followed by 2 days of feeding, can provide protection against diet-induced obesity and metabolic improvements without a reduction in overall caloric intake. Presented here is a protocol of this isocaloric 2:1 IF intervention in mice. Also described is a pair-feeding (PF) protocol required to examine a mouse model with altered eating behaviors, such as hyperphagia. Using the 2:1 IF regimen, it is demonstrated that isocaloric IF leads to reduced body weight gain, improved glucose homeostasis, and elevated energy expenditure. Thus, this regimen may be useful to investigate the health impacts of IF on various disease conditions.

The current article describes a detailed protocol for isocaloric 2:1 intermittent fasting to protect and treat against obesity and impaired glucose metabolism in wild-type and ob/ob mice.

Evaluación de los efectos metabólicos del ayuno intermitente isocalórico 2:1 en ratones

Intermittent fasting (IF), a dietary intervention involving periodic energy restriction, has been considered to provide numerous benefits and counteract ...