Figure 1 e 2 sono stati precedentemente pubblicati in Biologia Free Radical &amp; Medicina (Queliconi et al. 5) e hanno copyright detenuti da Elsevier. Questo lavoro è stato supportato dal Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), l&#39;Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de processos Redox em Biomedicina, il Núcleo de Apoio à Pesquisa de processos Redox em Biomedicina, USPHS NS064945 (KN), e USPHS GM087483 (KN ). BBQ è uno studente di dottorato sostenuto da una borsa di studio FAPESP.

1. C. elegans crescita <ol><li> Preparare 35 millimetri Nematode crescita media (NGM) piastre di agar seminate con i batteri OP50, come da metodi di coltivazione standard di 1. </li><li> Sincronizzare C. elegans, ponendo 6 adulti gravide su un piatto NGM seminato. Rimuovere il numero di adulti dopo ~ 100 uova sono state fissate (~ 3 ore). </li><li> Incubare le piastre per 3 giorni a 20 ° C, a quel punto i vermi avranno sviluppato a giovani stadio adulto e sono ottimali per questo esperimento. Protocolli alternativi per sincronizzare C. elegans sono descritte altrove 10. </li></ol> 2. Materiali per AS <ol><li> M9 tampone (22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na 2 HPO 4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO 4) deve essere depurata di ossigeno equilibrando con N 2 (argon può anche essere usato) durante 30 min prima dell&#39;esperimento e tenuto circondato da ghiaccio. </li><li> Fai un piccolo foro (3 millimetrilarghezza) nel coperchio di 1,5 ml provette da microcentrifuga in cui i vermi saranno collocate durante AS. Il foro permette lo scambio di gas senza tenere il coperchio aperto, in quanto questo può portare a eccessiva della carta evaporazione. </li></ol> 3. Anossia / fame <ol><li> Condurre tutti gli esperimenti, almeno in triplicato. </li><li> Aggiungere 1 ml di tampone RT, M9 ossigenato per ogni placca 35 mm avente vermi adulti giovani coltivate come descritto sopra. Fare attenzione a non rimuovere i batteri dalla piastra (aggiungere M9 ai bordi dove i batteri non sono state seminate). Dopo circa 1 min i vermi dovrebbero essere nuotare nella M9. </li><li> Cappotto un puntale da 1 ml con BSA pipettando ed espellendo una soluzione sterile BSA 1%. </li><li> Inclinare con cautela il piatto contenente i vermi in un tampone M9, rimuovere la M9 dallo stesso luogo in cui è stato aggiunto, e posizionare la sospensione nei tubi microcentrifuga preparati. Far riposare in ghiaccio fino i vermi siano depositati sul fondo delle provette (~ 1-2 Min). </li><li> Rimuovere la quantità massima di M9 possibile senza disturbare i vermi dal tubo (lasciando circa 100 ml), aggiungere 1 ml di M9 ossigeno purgato e ghiacciata e posizionare il tubo sul ghiaccio fino a quando i vermi si depositano sul fondo di nuovo. Ripetere l&#39;ultimo passaggio 3x. In ultimo lavaggio, rimuovere la M9 fino ~ 100 microlitri rimane nel tubo. </li><li> Mettere le provette con i vermi in deoxygenated M9 all&#39;interno di una camera anossica / ipossia (vedere le istruzioni qui di seguito, Sezione 3.6.1) o, in alternativa, in un contenitore sigillato personalizzato (vedi istruzioni qui sotto, sezione 3.6.2). <ol><li> Se una camera anossica / ipossica commerciale deve essere utilizzato, lasciare alcune M9 spurgato all&#39;interno della camera prima di iniziare la fase 3.5 e ripetere il punto 3.5 una volta che i vermi sono all&#39;interno della camera. </li><li> Se una camera personalizzato deve essere utilizzato, una descrizione dettagliata di come creare un apparecchio a basso costo è presentato alla fine di questo protocollo ed è stato descritto da un altro gruppo in precedenza 11. In breve: <ol&gt; <li> Fare due fori in un coperchio da 250 ml Tupperware-tipo di contenitore e aggiungere connettori per tubi a loro. Uno sarà utilizzato per iniettare la miscela di gas mentre l&#39;altro sarà l&#39;uscita gas in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Posizionare i vermi nella camera e sigillare la camera con il coperchio. </li><li> Gas con un costante flusso di N 2 (100 ml / min). </li><li> Porre il contenitore in un bagno di acqua a 26 ° C. Assicurarsi che il tubo di uscita è ben immerso in acqua così non ritorni vie e che non vi siano perdite nel sistema (apparente da bolle derivanti dalla camera stessa). </li></ol></li></ol></li><li> Incubare i vermi a 26 ° C per 20 ore. </li></ol> 4. Riperfusione simulata <ol><li> Dopo 20 ore in condizioni di AS, rimuovere i tubi dalla camera di incubazione in aria ambiente. </li><li> Pipetta C. elegans con una punta BSA rivestito (come al punto 3.3) su un OP50 testa di serie 35 millimetri piastra NGM. Incubare le piastre a 20 ° C per 24 ore.Dopo questo, i vermi saranno pronti per essere segnato. </li></ol> 5. Identificare Morto Versus Live Worms <ol><li> Utilizzando un pick platino, toccare leggermente la parte superiore della testa della vite senza fine. Vermi vivi si sposteranno indietro dopo essere stato toccato. Se i vermi sono nonresponsive, segnare come morto. Occasionalmente, un verme non si muoverà all&#39;indietro, ma può presentare un leggero movimento della testa da lato a lato. Anche se non è tecnicamente morto, questi vermi sono quasi certo di scadenza entro poche ore, e dovrebbero essere classificati come morti. Se si aspetta troppo tempo per segnare i vermi, schiusa interna della progenie può accadere e queste &quot;borse-di-vermi&quot; può rompersi, facendo rilevare le carcasse molto difficile. </li><li> Rimuovere entrambi i vermi vivi e morti dalla piastra se essi sono computati al fine di evitare conteggi doppi. I vermi vivi possono essere spostati in un piatto a parte per eseguire test comportamentali. La quantità di vermi viventi relativi al totale è rappresentato come la% di vermi sopravvissuti (Figura 1A </strong&gt;). </li></ol> 6. Toccare risposta Assay <ol><li> Una descrizione dettagliata di questo protocollo è stato presentato in Hart, Anne C., ed. Comportamento (3 luglio 2006), WormBook, ed. La C. elegans Comunità di Ricerca, WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org. <ol><li> A segnare per la risposta al tocco, identificare i vermi che si muovono e toccano leggermente il lato della testa del verme (vicino alla parte centrale della faringe) con uno scalpello ciglio (Figura 3). </li><li> Se il worm si muove indietro, segnare come reattivo, se non, segnare come non risponde (Figura 1B). Ripetere questa operazione 10-15x per ogni vite senza fine con intervalli di 10 secondi. Sonda almeno 10 vermi in ogni gruppo per avere dati precisi. Lo stesso test può essere utilizzato per valutare i cambiamenti in avanti locomotore seguente tocco leggero alla parete posteriore del corpo. Fare attenzione a non toccare la testa o la coda del verme, dal momento che questo stimola un comportamento diverso. </li><li> Infine, inceppi di controllo genetico aziendali [N2 Bristol wild-type per il positivo, mec (mechanosensory) mutante di negativo - ad esempio CB1338 mec-3 (e1338) IV] per calibrare la forza con cui a toccare i vermi. Troppo dura di una stimolazione sarà suscitare una risposta comportamentale in mutanti MEC, troppo poco non si suscitare un effetto nei controlli N2 tipo selvatico. </li></ol></li></ol> 7. Neuronale modifiche <ol><li> Per visualizzare Post come modificazioni neuronali, utilizzare un ceppo che esprime GFP in-rispondere al tocco MEC neuroni 4,5. Questi neuroni sono lunghi processi che corrono lungo la parete del corpo e sono facilmente segnati per anomalie morfologiche. Inoltre, l&#39;informazione morfologica può essere integrato con misure comportamentali di funzione neuronale, come descritto sopra. Un ceppo che può essere utilizzato per questo scopo è TU2583, che è disponibile dalla C. elegans Genetics Center e contiene il transgene integrato uIs25 che esprimono GFP from il mec-18 promotore o, in alternativa TU2562, che contiene un mec-3 :: GFP fusion integrata. </li><li> Preparare un pad agarosio. <ol><li> Sciogliere 2% agarosio in acqua, portare a 1x M9 con uno stock 10x, e mantenere la soluzione a 70 ° C. </li><li> Una goccia (~ 20 microlitri) di questa soluzione in un vetrino (25 mm x 75 mm) che è stato inserito tra altri due slitte, ognuna delle quali ha un unico pezzo di nastro sul loro lato inferiore. </li><li> Posizionare un vetrino finale perpendicolare alla prima sulla superficie della soluzione di agarosio al 2%, e lasciate raffreddare a temperatura ambiente. Questo dovrebbe formare un pad che è lo spessore del nastro. </li><li> Rimuovere la slitta superiore e aggiungere 10 ml di M9 contenenti 0,1% Tetramisole, che immobilizzare i vermi. </li></ol></li><li> Spostare alcuni (~ 10) vivere vermi sul 2% agarosio diapositiva. Posizionare un vetrino su di loro e visualizzare GFP utilizzando un microscopio a fluorescenza in un obiettivo 100X con l&#39;illuminazione adeguata. </li><li> Danneggiatoneuroni mostrerà una stringa citosolico membrana del reticolo perle nei processi, composto punctum multiple (Figura 2A), e / o anomalie in cui i processi sembrano essere ignorate (Figura 2B). Conte punctum e le anomalie in entrambi i neuroni per ogni verme, con un totale di almeno 10 vermi. </li></ol> 8. Lab-made Hypoxic Camera <ol><li> Uno stile Tupperware, richiudibile, contenitore chiuso ermeticamente può essere retrofit come una camera anossica. Fare attenzione a scegliere un contenitore che è il più piccolo possibile. Un piccolo contenitore crea un ambiente ipossico più veloce ed è più facile da montare nel bagno d&#39;acqua (Figura 4). </li><li> Fai due fori sul coperchio (può essere fatto con un cacciavite o riscaldando pinze e costringendo nel coperchio) e inserire un connettore di plastica o di metallo che si inserisce il tubo (Figura 5A). Utilizzare colla che può essere posizionato sotto l&#39;acqua, e diventa difficile anche dopo essiccamento, evitando di movimentoil connettore e quindi riducendo la possibilità di perdite (Figura 5B). </li><li> Il contenitore deve essere collocato nella vasca d&#39;acqua in modo che sia completamente sommerso (Figura 4). Per immergere il contenitore, utilizzare un peso bottiglia o un peso immersioni. </li><li> Uno dei raccordi dei tubi saranno utilizzati per introdurre una miscela di gas e l&#39;altro tubo fungerà da sovrappressione, quindi, andrebbe lasciata sotto l&#39;acqua in modo che il contenitore è sigillato rispetto all&#39;ambiente esterno (Figura 4). </li><li> La composizione dell&#39;aria può essere modulata utilizzando il gas su misura, controllori di flusso di massa o di qualsiasi apparato che mescola i gas desiderati. Il flusso di gas deve essere controllato, come flusso elevato può creare eccessiva evaporazione. Ad esempio, in un contenitore da 250 ml, 100 ml / min di gas fornirà buon spazio per i vermi e un flusso adeguato. </li><li> La lunghezza del tubo deve essere ridotto al minimo, in quanto possono essere permeabile ai gas, unallowing l&#39;ingresso di O 2. È importante evitare l&#39;uso di silicone, Tygon provette come questi materiali sono permeabili scambio di gas. Noi preferiamo tubi di polipropilene o nylon. Vetro o tubi di metallo mantengono i gas bene, ma sono anche più difficili da lavorare. </li></ol>

<ol>
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S., Gottlieb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenotransplantation+of+mitochondrial+electron+transfer+enzyme,+Ndi1,+in+myocardial+reperfusion+injury.">Xenotransplantation of mitochondrial electron transfer enzyme, Ndi1, in myocardial reperfusion injury.</a> PloS One. 6 (2), e16288 (2011).</li><li>Chai, Y., Li, W., Feng, G., Yang, Y., Wang, X., Ou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Cellular+Dynamics+During+Caenorhabditis+elegans+Postembryonic+Development.">Live Imaging of Cellular Dynamics During Caenorhabditis elegans Postembryonic Development.</a> Nature Protoc. 7 (12), 2090-2102 (2012).</li><li>Nehrke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reduction+in+intestinal+cell+pHi+due+to+loss+of+the+Caenorhabditis+elegans+Na+/H++exchanger+NHX-2+increases+life+span.">A reduction in intestinal cell pHi due to loss of the Caenorhabditis elegans Na+/H+ exchanger NHX-2 increases life span.</a> J. Biol. Chem. 278 (45), 44657-44666 (1074).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Come è stato ampiamente utilizzato in C. elegans per modellare lesioni IR. Alcuni punti chiave dovrebbero essere evidenziati per questo protocollo: C. elegans sono resistenti a una vasta gamma di lesioni, che giustifica la necessità per 3 insulti concomitanti (calore, fame e anossia) per raggiungere morte con questo sistema. Solo Anoxia non uccide i vermi in questa finestra di tempo 14. Inoltre, l&#39;aumento della temperatura è un ulteriore stress, quindi è importante monitorare attentamente. In senso stretto, la fame non contribuisce significativamente al grado di mortalità osservata 7, di per sé, ma sembra ridurre la variabilità tra le repliche sperimentali. Dato che non ci può essere variabilità significativa dal giorno per giorno, è estremamente importante per confrontare i campioni eseguiti direttamente in parallelo, e di ripetere gli esperimenti su più giorni. In generale, i risultati vengono valutati per tre piastre separate di 50-100 vermi / condizione sperimentale e questi sono in media e considerato come una singola replica sperimentale. In generale, tra i sette ei nove repliche sembrano essere sufficienti per raggiungere o escludere la significatività statistica. Ha bisogno anche lo stadio di sviluppo dei vermi utilizzati nell&#39;esperimento essere attentamente monitorati come la suscettibilità delle diverse fasi di AS danni varia significativamente 15,16. L&#39;uso dei giovani adulti è standard, e la fase larvale (L3 e L4) vermi sembrano essere più resistenti agli effetti dannosi di AS (dati non pubblicati). Questo protocollo offre due modi per eseguire gli esperimenti, uno con un apparato di laboratorio-made (utilizzando contenitori Tupperware tipo e gas in ingresso 11) e altre con una camera ipossica commerciali 4,6. Anossia può essere ottenuto con altri mezzi che consumano l&#39;ossigeno, come descritto altrove 13,17. L&#39;uso di tecniche alternative per creare un ambiente ipossico può cambiare il tempo di incubazione AS necessarioper creare la quantità desiderata di morte. Targeting ~ 20% di sopravvivenza è un punto di partenza ideale per studiare interventi protettivi, mentre l&#39;80% è altrettanto ideale per gli interventi che aggravano gli effetti negativi di AS. Un altro avvertimento importante è il momento in cui i punteggi osservatore vermi morti / vivi. Se il tempo di analisi è estesa oltre 24 ore, i dati possono essere fuorviante in quanto vermi morti diventano sempre più difficili da identificare. Ciò può essere dovuto alle carcasse verme diventare relativamente trasparente nel tempo, ma anche al fatto che gli embrioni fecondati possono svilupparsi in progenie post-mortem all&#39;interno delle carcasse e disturbare loro che emergono. L&#39;analisi della morfologia neuronale può essere modificato per guardare proteina espressione modelli 18, frammentazione nucleare 4 e altri parametri 19 sostituendo un ceppo verme che esprime l&#39;appropriato marcatore geneticamente codificato. Un avvertimento finale è che la visualizzazione dellaprocessi neuronali dovrebbero essere fatte meno di 30 min dopo aver posizionato i vermi sul vetrino. Animali tenuti sotto anestesia su vetrini per periodi più lunghi possono presentare danni AS-indipendente. Regolare la quantità di animali per vetrino in base al tempo necessario per monitorare e analizzare loro.

C. elegans è un nematode che è stato ampiamente adottato come multicellulare eucariotica organismo modello sin dalla sua introduzione da Brenner 1. Si tratta di un modello semplice, economico e versatile, che permette facili collegamenti tra le alterazioni genetiche e fenotipiche cambia 2. L&#39;ischemia è caratterizzata da una mancanza di nutrienti e di ossigeno ad un tessuto, seguita da riperfusione, quando una raffica di specie reattive dell&#39;ossigeno è prodotto 3 e la maggior parte del danno. Nel 2002, un modello di ischemia / riperfusione (IR) in C. elegans è stato sviluppato 4 riguardanti la presentazione dell&#39;intero worm per anossia, la privazione di nutrienti e stress da calore per circa 20 ore, seguito da 24 ore in condizioni normali. Anche se questo modello è tecnicamente un anossia-fame (AS) condizione, la morte cellulare avviene attraverso meccanismi che sono conservati nei mammiferi, incluso il danno indotto da ossidanti durante la riperfusione &lt;sup&gt; 5. Inoltre, simili a mammiferi IR, danno indotto da AS in C. elegans può essere evitata mediante precondizionamento ischemico 6,7 o 8,9 precondizionamento anestetico. I protocolli di seguito viene illustrato come imitare IR in C. elegans utilizzando il modello AS, come a segnare anomalie morfologiche e comportamentali che derivano da AS, e come adattare il protocollo in modo da consentire l&#39;esperimento possa essere condotta con un investimento iniziale inferiore utilizzando una misura, facilmente costruito un&#39;alternativa camera .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1146">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">N2&#160; strain</td>
			<td style="width:269px;">CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/)</td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td style="width:453px;">Wild type strain</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">TU2583 uIs25 (Pmec-18::GFP)</td>
			<td style="width:269px;">CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/)</td>
			<td style="width:208px;">TU2583</td>
			<td style="width:453px;">integrated fluorescent transgene used to label touch neurons</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CB1338 mec-3 (e1338)IV</td>
			<td style="width:269px;">CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/)</td>
			<td style="width:208px;">CB1338</td>
			<td style="width:453px;">canonical mec-3 mutant that is touch insensitive</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Microcentrifuge Tube</td>
			<td style="width:269px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:208px;">0030 120.086</td>
			<td style="width:453px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Nikon Eclipse TE2000-U Microscope&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Nikon USA</td>
			<td style="width:208px;">TE2000-U</td>
			<td style="width:453px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Low Temperature Incubator</td>
			<td style="width:269px;">Sheldon Manufacturing Inc.</td>
			<td style="width:208px;">Model 2005</td>
			<td style="width:453px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Eyelash Pick</td>
			<td style="width:269px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td style="width:453px;">An eyelash pick can be prepared by attaching&#160; an eyelash onto a wooden toothpick, then attaching the toothpick in a glass Pasteur pipette (Figure 3)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Hypoxic Chamber</td>
			<td style="width:269px;">Coy</td>
			<td style="width:208px;">8307030</td>
			<td>Hypoxic Glove box equipped with paladium catalyst and CO2 controller.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an anoxia-starvation model for ischemia/reperfusion in c. elegans

Protocolli per anossia / fame nel modello di organismo genetico C. elegans simulare ischemia / riperfusione. Worms sono separati dal cibo batterica e poste sotto anossia per 20 ore (ischemia simulata), e successivamente trasferiti in un ambiente normale con il cibo (riperfusione simulata). Questo sperimentali risultati paradigma in aumento della morte e danno neuronale, e tecniche sono presentati per valutare la vitalità dell&#39;organismo, alterazioni della morfologia dei processi tocco neurone, nonché sensibilità al tocco, che rappresenta l&#39;uscita del comportamento della funzione neuronale. Infine, un metodo per la costruzione incubatori ipossiche utilizzando contenitori cucina comune è descritto. L&#39;aggiunta di una unità di controllo del flusso di massa consente modifiche da apportare alla miscela di gas nelle incubatrici personalizzati, e un bagno di acqua circolante consente sia il controllo della temperatura e rende facile identificare perdite. Questo metodo fornisce un&#39;alternativa a basso costo commerciale diunità disponibili.

Sottoponendo C. elegans a 20 ore di AS a 26 ° C in un laboratorio-made camera di incubazione personalizzato come descritto (punto 3.6.2) ha comportato una significativa mortalità (Figura 1A) 5. L&#39;imaging fluorescente successiva di punctum e le interruzioni nei GFP etichettati processi neuronali di sopravvissuti ha confermato la presenza di anomalie morfologiche (Figura 2). I sopravvissuti anche risposto male alla luce della parete di tocco del corpo (Figura 1B). Questo modello è stato utilizzato da più gruppi per studiare come la predisposizione genetica, intervento farmaceutico, e la plasticità metabolica colpisce esiti AS dipendenti 4-6,8,9,12,13. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig1.jpg" /> Figura 1. C. elegans sopravvivenza e la risposta al tocco dopoAS. A) Percentuale di vermi che esporre 24 ore post-AS sopravvivenza. Il ceppo N2 è il background genetico wild type, e KWN85 contiene un transgene integrato che etichette neuroni MEC con GFP. B) Risposta a toccare stimoli di vivere C. elegans (N2 Strain) dopo AS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51231/51231fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig2.jpg" /> Figura 2. Toccare modifiche neurone dopo AS. Neurone touch (PLML e PLMR) anomalie come i processi tortuosi e pause (A) o l&#39;accumulo di aggregati GFP nei processi (B) sono stati monitorati in sopravvivenza anestetizzata C. elegant<html> ans dopo AS. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig3.jpg" /> Figura 3. Scelta ciglio. Un ritiro ciglio assemblato. Nel riquadro, un particolare del ciglio incollato al legno stuzzicadenti. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig4.jpg" /> Figura 4. Lab-made camera ipossica all&#39;interno del bagno d&#39;acqua. Un contenitore chiuso pronto per iniziare l&#39;esperimento. Le frecce indicano l&#39;entrata e l&#39;uscita del gas ed il peso della bottiglia usata per evitare che flottante. 231fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. Dettagli del lato interno ed esterno del coperchio del contenitore. A) lato esterno del coperchio del contenitore, indicando il tubo e il suo connettore attaccato al foro precedentemente realizzato. B) lato esterno del coperchio del contenitore, indicando il connettore del tubo attaccato al foro precedentemente realizzato.

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An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Un protocollo è descritto che utilizza anossia / fame in C. elegans per modellare ischemia / riperfusione. Risultati funzionali comprendono un aumento della mortalità, anomalie visibili in processi neuronali GFP-etichettata, e le risposte deteriorate comportamentali che richiedono la funzione neuronale.

Un modello di anossia-fame per ischemia / riperfusione in<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

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Biology

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

9.8K Views.  Universidade de São Paulo.  Un protocollo è descritto che utilizza anossia / fame in C. elegans per modellare ischemia / riperfusione. Risultati funzionali comprendono un aumento della mortalità, anomalie visibili in processi neuronali GFP-etichettata, e le risposte deteriorate comportamentali che richiedono la funzione neuronale. 

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RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi di screening per identificare fenotipi postembrionale in C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Ricerca

Biologia

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Di base<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metodi: sincronizzazione e di osservazione

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Chemiotassi Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Un metodo per la coltura embrionale<em&gt; C. elegans</em&gt; Celle

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

Antibody colorazione in<em&gt; C. Elegans</em&gt; Uso di &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

Metodi per la pelle Ferimento e saggi per risposte ferita<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

Metodi di valutazione subcellulari Compartimenti di muscoli in<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

Indagare le proteine ​​prioniche-come diffusione e tossicità di utilizzare i metazoi Organismo modello<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

Monitoraggio e quantificazione processi di sviluppo in<em&gt; C. elegans</em&gt; Utilizzo strumenti open-source

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and physiology. Thus, organisms have evolved targeted and specific stress responses dedicated to repair damage and maintain homeostasis. These mechanisms include the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum (UPRER), the unfolded protein response of the mitochondria (UPRMT), the heat shock response (HSR), and the oxidative stress response (OxSR). The protocols presented here describe methods to detect and characterize the activation of these pathways and their physiological consequences in the nematode, C. elegans. First, the use of pathway-specific fluorescent transcriptional reporters is described for rapid cellular characterization, drug screening, or large-scale genetic screening (e.g., RNAi or mutant libraries). In addition, complementary, robust physiological assays are described, which can be used to directly assess sensitivity of animals to specific stressors, serving as functional validation of the transcriptional reporters. Together, these methods allow for rapid characterization of the cellular and physiological effects of internal and external proteotoxic perturbations.

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Here, we characterize cellular proteotoxic stress responses in the nematode C. elegans by measuring the activation of fluorescent transcriptional reporters and assaying sensitivity to physiological stress.

Misurazioni delle risposte allo stress fisiologico in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...