Este trabajo fue realizado en y apoyado por el Instituto Politécnico de Worcester.

1. preparación de medio de crecimiento nematodo (NGM) <ol><li>para 1 L de medios de comunicación combinan agar 20 g, 2,5 g fuente de nitrógeno orgánico (e.g., bacto-peptona) y 3 g de cloruro de sodio en un matraz de 2 L. Añadir 975 mL de agua estéril.
	<ol><li>Agregar en una barra de agitación estéril. Si se utiliza un dispensador automático de medios de comunicación, tubería de autoclave y media durante 15 min; los medios de comunicación deben ser esterilizado para ya si es un volumen más alto.</li>
	</ol></li> <li>Establecer los medios de comunicación en remover la placa y deje para enfriar.
	<ol><li>Una vez que los medios de comunicación está caliente al tacto (aproximadamente 60 ° C) asépticamente añada 1 mL de 1 M MgSO 4 &#9679; H 2 O, 1 mL de 1 M de CaCl 2, 25 mL de KPO 4 y 1 mL de colesterol de 0,5% en etanol.</li>
		<li>Vierta media (manualmente o por bomba automática) bajo flujo laminar en 35 x 10 mm placas de petri estériles. Deje que se seque bajo campana por 1-2 días antes de su uso. 
		Nota: Las placas deben guardarse a 4 ° C para evitar la contaminación.</li>
	</ol></li></ol> 2. Hacer un gusano Pick <ol><li>corte un pedazo de 1,5 cm de alambre de aluminio. Cuidadosamente Inserte la punta de una pipeta Pasteur aproximadamente 0,5 cm de esta longitud.
	<ol><li>Usando un quemador de Bunsen o lámpara de alcohol, fundir la punta de la pipeta de cristal girando lentamente en la llama hasta que el alambre se adhiere firmemente a la pipeta, sin comprometer la forma original de la punta de la pipeta.</li>
	</ol></li></ol> 3. Preparación de la cultura de e. coli <ol><li>utilizando un asa estéril, inocular una colonia de e. coli cepa OP50 en 200 mL de caldo Luria. Incubar durante una noche con agitación a 37 ° C.</li>
	<li>El cultivo líquido está listo para usar al día siguiente y pueden ser almacenada a 4 ° C cuando no esté en uso. 
	Nota: La cepa de e. coli, OP50, se utiliza como fuente de alimento para C. elegans. Este cultivo puede ser utilizado por hasta varios meses si se almacena a 4 ° C.</li>
</ol> 4. Esencial C. elegans mantenimiento <ol><li>semilla preparada las placas de agar NGM con e. coli por manchas aproximadamente 50-100 μl de preparados OP50 cultivo líquido en el centro de la placa de.</li>
	<li>Placas y déjelos secar a temperatura ambiente durante 24 h. Una vez seco, colocar las placas a 37 ° C durante la noche para un rápido crecimiento o mantener a temperatura ambiente, si se desea un crecimiento más lento.</li>
	<li>Añada gusanos a la placa o &#34; trozos, &#34; (ver protocolo paso 5 &#34; Chunking y recogiendo gusanos &#34;), recogiendo gusanos individualmente o colocar huevos de gusano directamente sobre la placa (ver protocolo paso 6 &#34; huevo preparación &#34;).</li>
</ol> 5. Chunking y recogiendo gusanos Nota: &#34; trozos, &#34; se refiere a una práctica que es común en el mantenimiento de C. elegans. Se trata de cortar una sección de la placa de agar NGM que contiene gusanos y así también transferir esta pieza en un plato nuevo, transferir un gran número de gusanos en el proceso. La contaminación también puede cortar de la placa de esta manera. Cuando recogiendo gusanos, es importante mantener la integridad del agar porque gusanos pueden ser perdidos en los agujeros en el agar. Además, es importante permitir que la hoja se enfríe antes de tocar la placa para evitar fundir el agar o quema los gusanos.
<ol><li>Para transferir rápidamente grandes cantidades de gusanos en las nuevas placas, cortar un trozo de agar NGM que contiene las lombrices seleccionadas con una espátula. Retirar la pieza cortada y poner cara abajo en el borde del césped de OP50 en un plato nuevo.</li>
	<li>Transferencia de gusanos individualmente como se describe a continuación en el paso de protocolo 8.2, &#34; Análisis de la supervivencia, &#34; utilizando un gusano pick. La llama el alambre en la recogida del gusano hasta que esté rojo. Retire del fuego y deje que se enfríe durante unos segundos.</li>
	<li>Con el cable en la selección, raspar suavemente el césped de la cultura OP50 crecido en la placa de nuevo, cubriendo el hilo en el pico.</li>
	<li>La cultura viscosa que cubre la punta del alambre hace gusanos se pegan a la punta de la ganzúa, así suavemente recoger gusanos seleccionados con un movimiento de swiping.</li>
	<li>Una vez que las lombrices se reúnen, colocarlos en un plato nuevo deslizando suavemente la cultura en el agar. Coloque el alambre en la llama para eliminar la cultura restantes en la selección.</li>
</ol> 6. Preparación del huevo <ol><li>colocar aproximadamente 20 animales adultos (aproximadamente 2-3 días después de la eclosión, cuando se cultiva a 20 ° C) por cosecha o por trozos como se describe en el paso 5, de protocolo &#34; Chunking y recogiendo gusanos, &#34; en una placa sembrada con 50 Μl de cepa de e. coli, OP50.</li>
	<li>a recoger los huevos, inundar la placa con 10 mL de buffer M9 después de 1-2 días. Utilizando una pipeta serológica de vidrio, agitar y agitar suavemente el contenido sobre la placa de agar para lanzar huevos atascados OP50 o animales adultos. Recoger todo el líquido que contiene los huevos y adultos.</li>
	Tubo de <li>solución de transferencia M9 y OP50 en un cónico de 15 mL. Centrifugar el tubo cónico de 15 mL a 2.100 x g durante 2 min</li>
	<li>Aspirar aproximadamente 9 mL del sobrenadante sin perturbar el pellet OP50.</li>
	<li>Resuspender el precipitado en 2 mL de agua estéril, 1 mL de blanqueador y 1 mL de NaOH M 0.25.</li>
	<li>Mezclar suavemente por inversión hasta que la mayoría (aproximadamente el 70 por ciento) de los animales adultos aparece sometidas a lisis, por lo general, huevos permanecen intactos durante este tratamiento blanqueador corto debido a su cáscara. Centrifugar el tubo cónico a 990 x g durante 2 min</li>
	<li>Aspirar sobrenadante sin perturbar el pellet. Resuspenda el sedimento en 10 mL de buffer M9.</li>
	<li>Centrifugar el tubo cónico en 990 x g para 2 min aspirar sobrenadante sin pellets inquietante. Vuelva a suspender los pellets con 200 μL de buffer M9. 
	Nota: La preparación de huevo puede requerir múltiples ensayos. Huevos pueden ser destruidos si se exponen para blanquear demasiado. Si no salen de los huevos, disminuir la concentración de cloro en solución o disminuir la duración de la exposición a bleach.</li>
</ol> 7. Instalación de placa de infección <ol><li>distribuir 3-5 mL de YPD en un tubo de ensayo estéril y sembrar con una sola Colonia de Candida albicans utilizando un asa estéril.
	<ol><li>Coloque el tubo en un tambor rotatorio para aproximadamente 16-18 h a 30 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Etiqueta un 1,5 mL tubo de microcentrífuga para contener C. albicans y otro para contener OP50. Registrar el peso de cada tubo de vacío.
	<ol><li>Lugar 500 μl de la noche a la mañana cultura de C. albicans en el tubo con la etiqueta C. albicans y 1.500 μl de la noche a la mañana OP50 cultura (paso 3.1) en el tubo etiquetado OP50.</li>
		<li>Centrifugar 10 min a 16.100 x sobrenadante de aspirado g. sin pellets inquietante.</li>
		<li>Resuspender cada pellet con 500 μl de agua estéril. Centrifugar durante 5 min a 16.100 x g.</li>
		<li>Aspirar sobrenadante sin perturbar el pellet. Registrar el peso final de los tubos del microfuge.</li>
		<li>Determinar el peso de cada pellet restando el peso inicial de los tubos de microcentrífuga del peso final.</li>
	</ol></li> <li>Con agua estéril, Resuspender el pellet de C. albicans a 10 mg/mL y el sedimento OP50 a 200 mg/mL. Hacer una infección principal mezcla combinando 10 μl de una solución de 50 mg/mL de estreptomicina, 2.5 μl de cultivo OP50, 0,5 μl del cultivo de C. albicans y 7 μl de agua estéril.
	<ol><li>Para las placas de control, crear una mezcla principal reemplazando el volumen de la cultura de C. albicans con agua estéril. De semilla de 20 μl de mezcla de infección o solución de control OP50 sobre las placas del centro de NGM utilizando una micropipeta. 
		Nota: Se necesitan aproximadamente 100 gusanos para determinar significación estadística durante el análisis. Este ensayo se ejecuta normalmente por triplicado. Por lo tanto, se hace un 3.2 x mezcla de infección, así como a 3.2 x solución de control. Estas mezclas se hacen para ser un poco sobre 3 x el original para asegurarse de que se siembra un total de 20 μl en cada plato, permitiendo espacio para error. Esta mezcla principal se crea porque la faringe del gusano es insuficiente durante las primeras etapas larvales (L1-L3) consumir C. albicans. La exposición a agentes farmacológicos como el fluconazol ( figura 3B), el agente se introduce en la mezcla de la infección. Empíricamente se determina la concentración del agente. Por ejemplo, en la figura 3B, 50 μm fluconazol está representado, sin embargo 0, 12,5, 25, 50 y 100 μm fluconazol también fueron probados usando el mismo protocolo de.</li>
	</ol></li></ol> 8. Análisis del fenotipo de deforma la región Anal (Dar) y análisis de supervivencia <ol><li>Visualize el fenotipo de Dar Nota: Dar mejor se visualiza en la fase L3 y más allá. Dar se presenta como una pequeña protuberancia en la región anal post del gusano ( figura 2A), que llega a ser más prominente con el tiempo.
	<ol><li>Confirmar si un animal tiene Dar rápidamente tocando la placa en la etapa del microscopio de disección, animales sin Dar voluntad mover hacia atrás inmediatamente, mientras que animales con Dar cualquier necesidad repetidas rondas de tapping para invertir su dirección, o no lo hará en todo.</li>
	</ol></li> <li>Análisis de supervivencia <ol><li>preparación de huevo completo, como se describió anteriormente en el paso del Protocolo 6, &#34; huevo preparación &#34;. Contar los huevos bajo el alcance de la disección y diluir la solución de huevo con M9 hasta alcanza una concentración de aproximadamente 5-6 huevos sanos por μl. Utilizando una pipeta, dispensar 20 μl de muestra que contenga aproximadamente 30 huevos en plato NGM preparado, en el área entre el cultivo bacteriano y el lado de la placa (huevos y comida de gusano, OP50, están en dos lugares distintos).</li>
		<li>Incubar las placas a 20 ° C durante 48 h. Debajo de un microscopio de disección, cuenta el número de gusanos vivos y muertos adultos en cada plato, así como el número de gusanos con Dar. Registrar el porcentaje con Dar.</li>
		<li>Considerar un animal muerto si no responde al ser golpeada en la cabeza por un alambre de aluminio o golpear ligeramente en la plancha.</li>
		<li>Día, transferencia gusanos adultos restantes por selección como se describe en el paso 5, de protocolo &#34; Chunking y recogiendo gusanos, &#34; en un plato nuevo de infección o control. En este punto, si es necesario, realizar un análisis de supervivencia mediante el seguimiento del número de gusanos vivos, muertos y desaparecidos cada día. 
		Nota: Este ensayo puede funcionar durante dos semanas, comenzando con la preparación de huevo. Además, la solución de huevo debe no distribuirá en el cultivo bacteriano, como la solución puede contener trazas de cloro que puede matar el OP50. La solución también debe ser despachado aproximadamente 0,5 cm del borde de la placa, como huevos pueden atorarse entre los lados de la placa y el agar. Además, debido a la rápida proliferación de gusanos adultos en nuevas placas de transferencia es fundamental para separarlos de su progenie.</li>
	</ol></li> <li>Analizar la supervivencia <ol><li>analizar los resultados utilizando el software de análisis de curva de supervivencia (véase lista de materiales).</li>
		Curvas de <li>compara la supervivencia mediante el método de Breslow-Grehan-Wilcoxon (suponiendo que los datos de los primeros tiempos de supervivencia son más precisos que tiempos posteriores, los datos de peso por consiguiente) así como herramientas estadísticas de rango logarítmico 45. 
		Nota: Por ejemplo, en la Figura 4B -C, la supervivencia de gusanos tratados con mutantes de C. albicans es comparada con aquellos tratados con controles de tipo salvaje isogénicas o complementarystrains.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los métodos de ensayo de infección de C. elegans y supervivencia sobre exposición de por vida a C. albicans que hemos descrito pueden ser modificados para probar otro patógeno. Cultivos líquidos de otra bacteria u hongo pueden hechos y alimenta a C. elegans de manera similar. Además, pueden ensayarse la serie infecciones exponer primero la larva a un patógeno como se describe, y luego transferir los animales en un nuevo plato que contiene un patógeno independiente después de alcanzar l...

C. elegans se ha utilizado como organismo modelo de gran alcance para más de 50 años. En la década de 1960, biólogo sudafricano Sydney Brenner pionero en el uso de C. elegans a estudiar desarrollo neuronal, allanando el camino para un largo linaje de científicos para estudiar diversos aspectos de la biología celular y animal de nematodos. Este linaje incluye a galardonados con el Premio Nobel Craig Mello y Andrew Fire para su trabajo de ARNi1, Robert Horvitz y John Sulston por su trabajo en el desarrollo de órganos y apoptosis2,3,4, Martin Chalfie por sus trabajos sobre la proteína fluorescente verde5. Aunque este organismo modelo se ha utilizado tradicionalmente para el estudio de biología molecular y del desarrollo, en los últimos 15 años, los investigadores han comenzado a utilizar C. elegans para investigar la biología de los patógenos humanos diversos incluyendo Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella entericay Serratia marcescens6,7,8,9,10. Estos estudios revelaron que muchos de los mecanismos implicados en la interacción de patógenos humanos se conservan en nemátodos, pero también que hay algunos mecanismos de inmunidad que son exclusivos de este organismo modelo11,12. En la naturaleza, C. elegans se encuentra con una variedad de amenazas de los agentes patógenos presentes en el suelo y esto ha proporcionado una fuerte presión selectiva para evolucionar y mantener un sistema inmune innato sofisticado en su lumen intestinal. Muchos de los genes y mecanismos involucrados en la protección de la luz intestinal están orquestados por elementos altamente conservadas que también existen en los mamíferos superiores11,13. C. elegans , por tanto, representa un gran modelo para el estudio de patógenos gastrointestinales como Salmonella enterica14, Shigella boydii15o16de cólera del vibrión.
Aquí destacamos la notable versatilidad de C. elegans como anfitrión modelo para el estudio de agentes infecciosos tales como C. albicans. C. elegans como anfitrión modelo permite la detección de alto rendimiento de virulencia que es menos costoso y desperdiciador de tiempo que un modelo de ratón, que se utiliza comúnmente para el estudio de la candidiasis42.
En este estudio, mostramos que este modelo y el análisis de supervivencia assosiated pueden ser confiablemente utilizados para estudiar efectores inmune innata del huésped importantes para contrarrestar infecciones, determinantes patógenos que virulencia, y compuestos farmacológicos que pueden intervienen en la patogénesis. Diferentes ensayos anteriormente descritos, este método proporciona un medio de estudiar la exposición a un patógeno durante la vida del animal, desde el estado larvario a la edad adulta, en lugar de sólo la edad adulta a muerte43,44. En Resumen, nuestro C. elegans - modelo de C. albicans es una herramienta versátil y poderosa que puede utilizarse no sólo para estudiar las bases genéticas que conducen a la infección y la inmunidad, sino para identificar nuevos compuestos para la intervención terapéutica.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar (granulated, bacterilogical grade)</td>
			<td>Apex BioResearch Products</td>
			<td>20-248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-1M32P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovision Zeiss Inverted Microscope</td>
			<td>Axiovision Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-Peptone</td>
			<td>Fisher BioReagants</td>
			<td>BP1420-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain Bli-3</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>Bli-3(e767) CB767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP51-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol, Sigma Grade, minimum 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm)</td>
			<td>FIsherBrand</td>
			<td>14-961-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator)</td>
			<td>Nikon Instrument Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software)</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Miller&#39;s)</td>
			<td>Apex BioResearch Products</td>
			<td>11-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10034-99-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium Petri Dishes (35 X 10 mm)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wildtype C. albicans SC5314</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SC5314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wildtype C. elegans</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>N2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the nematode caenorhabditis elegans - a versatile in vivo model to study host-microbe interactions

Demostrar un método usando Caenorhabditis elegans como anfitrión modelo para estudiar la interacción microbiana. Microbios se introducen a través de la dieta haciendo que el intestino la ubicación primaria de la enfermedad. El intestino nemátodo estructural y funcionalmente imita los intestinos mamíferos y es transparente lo que es susceptible de estudio microscópico de la colonización. Aquí mostramos que el patógeno pueden causar enfermedad y muerte. Somos capaces de identificar a mutantes microbianos que muestran alteración de la virulencia. Su respuesta innata conservado a estreses bióticos hace C. elegans un excelente sistema para sondear facetas de interacción inmune innata de host. Mostramos que hosts con mutaciones en el gen de la oxidasa dual no pueden producir especies reactivas de oxígeno y son incapaces de resistir el insulto microbiano. Además demostramos la versatilidad del ensayo de supervivencia presentado mostrando que puede ser utilizado para estudiar los efectos de los inhibidores del crecimiento microbiano. Este ensayo también puede ser usado para descubrir factores de virulencia de hongos como dianas para el desarrollo de nuevos antifúngicos, así como proporcionar una oportunidad para descubrir otras interacciones host-microbio. El diseño de este ensayo presta bien a alto rendimiento pantallas de todo el genoma, mientras que la capacidad de gusanos de crio-conservar para uso futuro, es un modelo rentable y atractivo todo animal para el estudio.

Un análisis de la patogenia (figura 1) con C. albicans y C. elegans se ha descrito previamente por nuestro laboratorio17,18 y otros laboratorios19,20. Demostramos la receptividad del uso de C. elegans para el estudio de virulencia de C. albicans que demuestran que las células de C. albicans son in...

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The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

El nematodo Caenorhabditis Elegans - un modelo versátil en Vivo para el estudio de las interacciones huésped-microbio

Aquí, presentamos el nematodo Caenorhabditis elegans como modelo para estudiar la interacción microbiana host versátil.

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

the-nematode-caenorhabditis-elegans-versatile-vivo-model-to-study

Research

JoVE Journal

Genetics

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

9.3K vistas.  Worcester Polytechnic Institute. Aquí, presentamos el nematodo Caenorhabditis elegans como modelo para estudiar la interacción microbiana host versátil.

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Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the replacement of the entire gene with a selectable marker via homologous recombination. During homologous recombination, exchange of DNA takes place between sequences with high similarity. Therefore, linear genomic sequences flanking a target gene can be used to specifically direct a selectable marker to the desired integration site. Blunt ends of the deletion construct activate the cell&#39;s DNA repair systems and thereby promote integration of the construct either via homologous recombination or by non-homologous-end-joining. In organisms with efficient homologous recombination, the rate of successful gene deletion can reach more than 50% making this strategy a valuable gene disruption system. The smut fungus Ustilago maydis is a eukaryotic model microorganism showing such efficient homologous recombination. Out of its about 6,900 genes, many have been functionally characterized with the help of deletion mutants, and repeated failure of gene replacement attempts points at essential function of the gene. Subsequent characterization of the gene function by tagging with fluorescent markers or mutations of predicted domains also relies on DNA exchange via homologous recombination. Here, we present the U. maydis strain generation strategy in detail using the simplest example, the gene deletion.

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

We describe a robust gene replacement strategy to genetically manipulate the smut fungus Ustilago maydis. This protocol explains how to generate deletion mutants to investigate infection phenotypes. It can be extended to modify genes in any desired way, e.g., by adding a sequence encoding a fluorescent protein tag.

La manipulación genética del patógeno de la planta<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Estudiar biología de hongos y plantas Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Investigación

Genética

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

Optogenética aleatoria de mutagénesis, utilizando la histona-miniSOG en<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.

Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.

Conjugación de apareamiento Los ensayos para el análisis específico de la secuencia de proteínas de transferencia que participan en la conjugación bacteriana

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation became a valuable experimental tool to investigate the DNA damage response (DDR) in vivo. It allows real-time high-resolution single-cell analysis of macromolecular dynamics in response to laser-induced damage confined to a submicrometer region in the cell nucleus. However, various laser conditions have been used without appreciation of differences in the types of damage induced. As a result, the nature of the damage is often not well characterized or controlled, causing apparent inconsistencies in the recruitment or modification profiles. We demonstrated that different irradiation conditions (i.e., different wavelengths as well as different input powers (irradiances) of a femtosecond (fs) near-infrared (NIR) laser) induced distinct DDR and repair protein assemblies. This reflects the type of DNA damage produced. This protocol describes how titration of laser input power allows induction of different amounts and complexities of DNA damage, which can easily be monitored by detection of base and crosslinking damages, differential poly (ADP-ribose) (PAR) signaling, and pathway-specific repair factor assemblies at damage sites. Once the damage conditions are determined, it is possible to investigate the effects of different damage complexity and differential damage signaling as well as depletion of upstream factor(s) on any factor of interest.

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

The goal of this protocol is to describe how to use laser microirradiation to induce different types of DNA damage, including relatively simple strand breaks and complex damage, to study DNA damage signaling and repair factor assembly at damage sites in vivo.

Microirradiation láser para estudiar In Vivo las respuestas celulares al daño en el ADN Simple y complejo

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has been associated with both the progression of cancer and the development of drug resistance. Until now, it has not been feasible to easily manipulate the ploidy of a multicellular animal without generating mostly sterile progeny. Presented here is a simple and rapid protocol for generating tetraploid Caenorhabditis elegans animals from any diploid strain. This method allows the user to create a bias in chromosome segregation during meiosis, ultimately increasing ploidy in C. elegans. This strategy relies on the transient reduction of expression of the rec-8 gene to generate diploid gametes. A rec-8 mutant produces diploid gametes that can potentially produce tetraploids upon fertilization. This tractable scheme has been used to generate tetraploid strains carrying mutations and chromosome rearrangements to gain insight into chromosomal dynamics and interactions during pairing and synapsis in meiosis. This method is efficient for generating stable tetraploid strains without genetic markers, can be applied to any diploid strain, and can be used to derive triploid C. elegans. This straightforward method is useful for investigating other fundamental biological questions relevant to genome instability, gene dosage, biological scaling, extracellular signaling, adaptation to stress, development of resistance to drugs, and mechanisms of speciation.

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

This method allows for the generation of tetraploid and triploid Caenorhabditis nematodes from any diploid strain. Polyploid strains generated by this method have been used to study chromosome interactions in meiotic prophase, and this method is useful for examining important basic questions in cell, developmental, evolutionary, and cancer biology.

Manipulación de ploidía en Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus allowing a single investigator to screen more treatments or conditions over the same amount of time without loss of data quality. The method requires common equipment found in most laboratories working with C. elegans and is thus simple to adopt. The approach centers on assaying independent samples of a population at each observation point, rather than a single sample over time as with traditional longitudinal methods. Scoring entails adding liquid to the wells of a multi-well plate, which stimulates C. elegans to move and facilitates quantifying changes in healthspan. Other major benefits of the Replica Set method include reduced exposure of agar surfaces to airborne contaminants (e.g. mold or fungus), minimal handling of animals, and robustness to sporadic mis-scoring (such as calling an animal as dead when it is still alive). To appropriately analyze and visualize the data from a Replica Set style experiment, a custom software tool was also developed. Current capabilities of the software include plotting of survival curves for both Replica Set and traditional (Kaplan-Meier) experiments, as well as statistical analysis for Replica Set. The protocols provided here describe the traditional experimental approach and the Replica Set method, as well as an overview of the corresponding data analysis.

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Here we describe the Replica Set method, an approach to quantitatively measure C. elegans lifespan/survival and healthspan in a high-throughput and robust manner, thus allowing screening of many conditions without sacrificing data quality. This protocol details the strategy and provides a software tool for analysis of Replica Set data.

El método de conjunto de réplica: Un enfoque de alto rendimiento para cuantitativamente medida Caenorhabditis elegans vida útil

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and effect sizes of regulatory elements to a target gene. Some progress has been made with the bioinformatic prediction of the existence and function of proximal epigenetic modifications associated with activated gene expression using conserved transcription factor binding sites. Chromatin conformation capture studies have revolutionized our ability to discover physical chromatin contacts between sequences and even within an entire genome. Circular chromatin conformation capture coupled with next-generation sequencing (4C-seq), in particular, is designed to discover all possible physical chromatin interactions for a given sequence of interest (viewpoint), such as a target gene or a regulatory enhancer. Current 4C-seq strategies directly sequence from within the viewpoint but require numerous and diverse viewpoints to be simultaneously sequenced to avoid the technical challenges of uniform base calling (imaging) with next generation sequencing platforms. This volume of experiments may not be practical for many laboratories. Here, we report a modified approach to the 4C-seq protocol that incorporates both an additional restriction enzyme digest and qPCR-based amplification steps that are designed to facilitate a greater capture of diverse sequence reads and mitigate the potential for PCR bias, respectively. Our modified 4C method is amenable to the standard molecular biology lab for assessing chromatin architecture.

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

The identification of physical interactions between genes and regulatory elements is challenging but has been facilitated by chromosome conformation capture methods. This modification to the 4C-seq protocol mitigates PCR bias by minimizing over-amplification of PCR templates and maximizes the mappability of reads by incorporating an addition restriction enzyme digest step.

Captura de alto rendimiento identificación de secuencias reguladoras de genes utilizando secuenciación de próxima generación de conformación Circular cromosoma (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human genetics research. Although a number of in silico algorithms have been developed to predict the pathogenicity of variants identified in these datasets, functional studies are critical to determining how specific genomic variants affect protein function, especially for missense variants. In the Undiagnosed Diseases Network (UDN) and other rare disease research consortia, model organisms (MO) including Drosophila, C. elegans, zebrafish, and mice are actively used to assess the function of putative human disease-causing variants. This protocol describes a method for the functional assessment of rare human variants used in the Model Organisms Screening Center Drosophila Core of the UDN. The workflow begins with gathering human and MO information from multiple public databases, using the MARRVEL web resource to assess whether the variant is likely to contribute to a patient&#39;s condition as well as design effective experiments based on available knowledge and resources. Next, genetic tools (e.g., T2A-GAL4 and UAS-human cDNA lines) are generated to assess the functions of variants of interest in Drosophila. Upon development of these reagents, two-pronged functional assays based on rescue and overexpression experiments can be performed to assess variant function. In the rescue branch, the endogenous fly genes are &#34;humanized&#34;&#160;by replacing the orthologous Drosophila gene with reference or variant human transgenes. In the overexpression branch, the reference and variant human proteins are exogenously driven in a variety of tissues. In both cases, any scorable phenotype (e.g., lethality, eye morphology, electrophysiology) can be used as a read-out, irrespective of the disease of interest. Differences observed between reference and variant alleles suggest a variant-specific effect, and thus likely pathogenicity. This protocol allows rapid, in vivo assessments of putative human disease-causing variants of genes with known and unknown functions.

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

The goal of this protocol is to outline the design and performance of in vivo experiments in Drosophila melanogaster to assess the functional consequences of rare gene variants associated with human diseases.

En Vivo Estudio Funcional de Variantes Humanas Raras Asociadas a la Enfermedad Usando Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental methods to study protein-nucleic acid interactions require the use of fluorescent tags, radioactive isotopes, or other labels to detect and analyze specific target molecules. Biotin, a non-radioactive nucleic acid label, is commonly used in electrophoretic mobility shift assays (EMSA) but has not been regularly employed to monitor protein activity during nucleic acid processes. This protocol illustrates the utility of biotin labeling during in vitro enzymatic reactions, demonstrating that this label works well with a range of different biochemical assays. Specifically, in alignment with previous findings using radioisotope 32P-labeled substrates, it is confirmed via biotin-labeled EMSA that MEIOB (a protein specifically involved in the meiotic recombination) is a DNA-binding protein, that MOV10 (an RNA helicase) resolves biotin-labeled RNA duplex structures, and that MEIOB cleaves biotin-labeled single-stranded DNA. This study demonstrates that biotin is capable of substituting 32P in various nucleic acid-related biochemical assays in vitro.&#160;

Presented here are protocols for in vitro biochemical assays using biotin labels that may be widely&#160;applicable for studying protein-nucleic acid interactions.

Ensayos bioquímicos in Vitro utilizando etiquetas de biotina para estudiar las interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The large body of work on C. elegans makes it an ideal candidate to integrate into large-population, whole-animal studies to dissect the complex biological components and their relationships with another organism. In order to use C. elegans in collaborative -omics research, a method is needed to generate large populations of animals where a single sample can be split and assayed across diverse platforms for comparative analyses.
Here, a method to culture and collect an abundant mixed-stage C. elegans population on a large-scale culture plate (LSCP) and subsequent phenotypic data is presented. This pipeline yields sufficient numbers of animals to collect phenotypic and population data, along with any data needed for -omics experiments (i.e., genomics, transcriptomics, proteomics, and metabolomics). In addition, the LSCP method requires minimal manipulation to the animals themselves, less user preparation time, provides tight environmental control, and ensures that handling of each sample is consistent throughout the study for overall reproducibility. Lastly, methods to document population size and population distribution of C. elegans life stages in a given LSCP are presented.

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

To use Caenorhabditis elegans (C. elegans) in omics research, a method is needed to generate large populations of worms where a single sample can be measured across platforms for comparative analyses. Here, a method to culture C. elegans populations on large-scale culture plates (LSCPs) and to document population growth is presented.

Cultivo Y Ensayo De Las Poblaciones De Caenorhabditis elegans De Etapa Mixta A Gran Escala

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

El nematodo Caenorhabditis Elegans - un modelo versátil en Vivo para el estudio de las interacciones huésped-microbio

Resumen

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La manipulación genética del patógeno de la planta

Optogenética aleatoria de mutagénesis, utilizando la histona-miniSOG en