The authors would like to thank David Gray from the Dundee Drug discovery unit for kindly donating firefly luciferase inhibitory compounds DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 and DDD00023047; Tibor Harkani (Medical University of Vienna) for the suggestion of oxaloacetate as a test compound; and Charlie Dear (University of Aberdeen) for illustrations. This work was funded by a BBSRC Pathfinder award (BB/FOF/PF/4/11) and the University of Aberdeen.

NOTA: Llevar a cabo todas las medidas en condiciones estériles (gabinete de flujo laminar) y con materiales de pre-esterilizados en autoclave (126 ° C, 11 min). Una placa de LB con rayas cabo E. coli OP50 mantiene a 4 ° C se requiere, raya a cabo en placas de LB fresco y restreak cada mes. 1. bacteriana Alimentos (Escherichia coli OP50) Preparación <ol><li> Día 1. Inocular 2 x 5 ml de LB en dos botellas universales con una sola colonia de E. coli OP50 y colocar en agitación incubadora a 37 ° C (220 rpm) durante 8 horas. </li><li> Después de 8 horas de incubación, utilice 2 ml de E. coli OP50 LB cultivo para inocular cada uno de 3 x 200 ml LB. Frascos lugar en agitación incubadora (220 rpm) O / N (17 horas) a 37 ° C. </li><li> Pesar 20 x 50 ml tubos de centrífuga y escribir peso en el tubo. </li><li> Día 2. Con una pipeta serológica, alícuota de 30 ml de O / N E. cultura coli OP50 en el pre pesaba tubos de centrífuga. Centrifugar a 7.741 xg, 10 ° C, 8 min. </li><li> Decantar cuidadosamente el sobrenadante, mantenga el tubo invertido con tapa y dejar reposar durante unos minutos. Con una pipeta eliminar cualquier exceso de sobrenadante que haya quedado en la tapa. Pesar el tubo y calcular el peso de la pastilla. </li><li> Calcular el volumen necesario para proporcionar una suspensión de 30 g / L y marcar este volumen en el tubo. Tubos de fecha, etiqueta y lugar a -20 ° C para su uso dentro de 1-3 meses o al - 80 ° C si va a guardar por más de 3 meses. </li><li> Preparar suspensión bacteriana para el cultivo de nematodos; permitir sedimento bacteriano para descongelar y añadir volumen requerido de S completa medio 11,12 a cada tubo y agitar suavemente para resuspender de pellets, los contenidos de la piscina de los diferentes tubos para obtener el volumen requerido. Trabajar en condiciones estériles. </li></ol> 2. Elaboración de Normas de la droga en un formato de placa de 96 pocillos NOTA: Si utiliza una biblioteca de drogas, placas de drogas se proporcionan en una solaconcentración de compuesto en DMSO. Cribado primario pondrá a prueba los compuestos a una sola concentración. Siga las instrucciones para la preparación de la placa de la droga para la prueba confirmatoria compuesto en un rango de concentraciones entre 0-160 M, seleccionado después de significación estadística a los 10 M. Los pasos siguientes pueden ser adaptados para probar otras concentraciones. ¡CUIDADO! Siga las precauciones necesarias para el manejo de medicamentos (por lo general frente a la máscara, gafas de seguridad, guantes son requeridos). <ol><li> Prepare la placa de drogas con las normas para el cribado de confirmación de trabajo: Pesar la cantidad requerida de compuesto en un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml estéril y preparar el compuesto 16 mM en DMSO (es decir, 100x concentró relación a la concentración deseada para la parte superior de la exposición). </li><li> Diluir en serie de stock 16 mM 1: 2 en DMSO para obtener 8, 4, 2, 1, 0,5 y 0,25 mm (estándares condiciones estériles). Estos son 100x concentrados y se diluyen a concentraciones finales de 0 (sólo vehículo),2,5, 5, 10, 20, 40, 80 y 160 micras (en 1% de DMSO) durante la exposición al fármaco. </li><li> En una cabina de flujo laminar, coloque el 20-50 l por pocillo de las normas de compuestos dentro de una columna de una placa de 96 pocillos, por ejemplo posición de la placa A1: 16 mM, B1: 8 mM, C1: 4 mM, D1: 2 mM, E1: 1 mM, F1: 0,5 mM, G1: drogas 0,25 mM y H1: DMSO. Utilice diferentes columnas para la serie de dilución de diferentes drogas. </li><li> Alícuota de vehículo a los pocillos de la columna 12 en la placa de drogas. NOTA: Esto facilitará las pruebas de control del vehículo por columnas, además de la prueba a lo largo de la fila H, asegurándose de que el vehículo se pone a prueba en puestos representativos de toda la placa. NOTA: Cada placa de drogas para el cribado de confirmación contiene series de dilución para un máximo de 11 fármacos diferentes para ser probados más el control del vehículo. </li><li> Etiqueta y placa de sello, cubrir con papel de aluminio y lugar a -20 ° C hasta su utilización. </li></ol> 3. Experimentos de nematodos NOTA: Llevar a cabo todas las medidas under condiciones estériles, asépticamente y con materiales de pre-esterilizados y reactivos. Mantener C. elegans cepas de forma rutinaria en placas de NGM con E. coli OP50. 12 horarios propuestos para las diferentes etapas de protocolo se presentan en la Tabla 1. <ol><li> Día 1 de tareas: configurar cultivo líquido de la cepa biosensor para la sincronización posterior. <ol><li> Recoger nematodos de una placa de NGM 6 cm (con un montón de larvas jóvenes donde la comida acaba agotado) en 2 ml S completa y transferir al frasco con 30 g / L E. coli OP50 en S completa (volumen total de 30 ml en un matraz de vidrio cónica capacidad de 250 ml). Incubar 3 días a 20 ° C, 160 rpm. </li></ol></li><li> Día 4 tarea (permita aproximadamente 30 a 35 min): la cultura de lejía para cosechar huevos y sincronizar población de gusanos. Llevar a cabo todas las etapas de centrifugación durante 1 minuto, 600 x g. <ol><li> Preparar una solución de cloro antes de su uso: para cada 16 ml de 0,156 M de KOH / NaOH añadir 4 ml de lejía. </li><li> Vierta 2 x 14 mlcultura gusano en 15 tubos de centrifugación cónicos ml. Permitir que los gusanos se asienten por gravedad (3 min). Retire y deseche líquidos nematodos anteriormente establecidas. Añadir 5 ml de solución de cloro a cada tubo y empezar temporizador. Combinar los volúmenes en un solo tubo. </li><li> Invierta tubo suavemente durante 2 minutos, revise debajo estereoscopio para la ruptura de los gusanos y la liberación de huevos en suspensión. Cuando la mayoría de los huevos son puestos en libertad o en un tiempo máximo de 2 minutos en la solución de cloro, centrífuga. </li><li> Aspirar el sobrenadante con cuidado. Lavar 1x pellets con 14 ml S completa y centrifugar. </li><li> Descartar el sobrenadante, añadir solución de cloro de 10 ml y se inicia el temporizador (esta segunda etapa de blanqueo se asegura de que la mayor parte de los cadáveres de gusanos se desintegran y ya no se ve bajo estereoscopio). Después de un tiempo máximo de solución de cloro de 2 minutos, centrifugar. </li><li> Lavar pellet 3x en S completa, decantar con cuidado el sobrenadante y pellet se resuspende en 14 ml S completas después de cada centrifugación. Después de lavado final, pellet huevo resuspender en 14 ml S completa. </li><li> Transferir el volumen a un matraz de vidrio cónico. Incubar 18-24 de hora a 20 ° C, 160 rpm. NOTA: Cosechado huevos eclosionan O / N y detienen el desarrollo en el primer estadio larval (L1), debido a la falta de alimentos, de ahí van a estar todos en la misma etapa de crecimiento. </li></ol></li><li> Día 5 tareas: configurar culturas gusano sincronizados para los ensayos de la droga. NOTA: Worms suspendidas en medio de inanición tienden a adherirse a las superficies de plástico hidrófobos tales como puntas de pipeta y tubos. 0,01% de Tween-20 es un agente tensioactivo utilizado aquí para hacer que las superficies de plástico más hidrofílico y permitir una mayor precisión en el conteo (0,01% de Triton-X100 también se puede utilizar). Cuando los nematodos se encuentran en el medio suplementado bacteriana, que no tienden a pegarse al plástico. <ol><li> Determinar el número de sombreados de L1 en el frasco, mantenga frasco de agitación plataforma (160 rpm). <ol><li> Tome 3x 100 muestras mu l del frasco (utilizar una punta limpia cada vez) en distintos ml microtubos de 1,7 con 900 l de líquido medio 0,01% de Tween-20. NOTA: Aspire 100 l de muestra en la punta limpia sólo una vez. Luego, cuando la dispensación, la pipeta hacia arriba y abajo un par de veces en el medio entre complementado para liberar cualquier gusanos que se adhieren a la punta. </li><li> Cuente los nematodos en 4x 10 l gotas de cada tubo de dilución por triplicado. Calcular el valor medio y estimar el número de gusanos presentes en el frasco de vidrio cónico. </li></ol></li><li> Calcular el volumen de tramado suspensión de nematodos necesaria para configurar una cultura 2 x 20 ml con 10 nematodos por 10 l. Aumentar el volumen calculado en un 10% para dar cuenta de cierta pérdida de nematodos posterior durante las etapas de centrifugación. </li><li> Decantar el volumen requerido en 2 x 15 ml tubos de centrifugación (pre-pesado). Pesar tubos para obtener volumen real dispensado, vórtice suavemente y ajuste para apuntar volumen eliminando el exceso de volumen con una pipeta de 5 ml (sólo la punta estéril debe entrar en el tubo). </li><li> Invente volumen a 14 ml con S frescas completas fueh nematodos. Centrífuga (1 min, 600 g). Retirar y desechar el sobrenadante con cuidado de no alterar el sedimento de los nematodos. </li><li> Añadir 5 ml de S completo con 30 g / L E. coli OP50 a los nematodos sedimentadas. La transferencia de los 5 ml en cada tubo a un matraz cónico de vidrio de 15 ml que contiene S completas con 30 g / L E. coli OP50. Nota por nematodos tiempo se proporcionaron primero con los alimentos. </li><li> Agitar frasco suavemente (160 rpm), tome 9 x 10 l gotitas sobre portaobjetos microscópicos (utilizan puntas frescas cada vez) para contar los nematodos y confirman promedio de aproximadamente 10 (± 2) por 10 l. </li><li> Coloque matraces de agitación de nematodos en incubadora a 20 ° C, 160 rpm durante 42 a 44 hr. </li></ol></li><li> Día 7 de tareas: los nematodos de transferencia a placas de 96 pocillos e iniciar la exposición al fármaco. <ol><li> Combine culturas de nematodos en un solo frasco, mantener remolinos frasco suavemente y colocar 3 x 4 ml de cultivo de nematodos en un 60 ml cubeta estéril. Coloca a través de una plataforma de agitación (160 rpm). </li><li> Uso 8 channel pipeta para alícuota de 25 mu l nematodos en suspensión por pocillo de 96 placas de microtitulación y negro con un fondo plano transparente (para la toma de ambas lecturas de luminiscencia y fluorescencia, o placas blancas para luminiscencia solamente). Cubra con una tapa de placa y dejar de lado. <ol><li> Después de puesta en marcha de cada 2 placas, colocar otros 2 x 2,5 ml nematodos en el canal para reemplazar el volumen perdido (mantener un &quot;volumen muerto&quot; en el canal de aproximadamente 7 ml). </li><li> Establecer 13/14 placas con nematodos. Se requerirán 11 placas de nematodos para probar dos placas de drogas 96 pocillos. La placa de nematodo 12 TH será cargado exclusivamente con el vehículo como control. La TH placa 13 se utiliza para establecer la fluorescencia de fondo en día 8 (véase más adelante). Un plato extra puede ser preparado para su uso deben producirse errores durante la puesta en marcha. </li></ol></li><li> Alícuotas de 74 l de S completos para cada plato bien y colocar en una cámara húmeda (véase la lista de materiales) en una incubadora de agitación (20 ° C, 160 rpm) until listo para los compuestos de ensayo alícuota en el momento del desarrollo preseleccionado (por ejemplo, 45 horas 30 minutos después de la comida incluida). [Volumen por pozo es ahora 99 l]. </li><li> Descongelar placa (s) de drogas a prueba. </li><li> Utilice una pipeta multicanal para crear placas de nematodos con la droga, cambiar las puntas cada vez. Permitir 5 min por placa de 96 pocillos de alícuotas de drogas. <ol><li> Tome 1 l de 1 columna st de la placa de drogas y añadir a las columnas 1-5 de una placa que contiene los nematodos; repetir desde la columna 2 da en la placa de la droga en las columnas 8-12 de la placa que contiene los nematodos. Añadir 1 l de vehículo para las columnas 6 y 7 de la placa de nematodos. NOTA: El volumen total por pocillo en la placa de nematodo será 100 l que resulta en una dilución 1: 100 de compuesto / vehículo. </li><li> Repita el proceso mediante la adición de 1 l de / 4ª columna de la 3ª de la placa de la droga a las columnas 1-5 / 8-12 de la segunda placa de nematodos; añadir vehículo para las columnas 6 y 7 de la placa de nematodos.</li><li> Continuar para probar columnas de placas de drogas restantes. Establecer un mínimo de una placa de nematodo con el vehículo en todos los pozos mediante el muestreo de la columna 12 de la placa de drogas. Coloque las placas traseras en cámaras húmedas en agitación incubadora (20 ° C, 160 rpm) durante 20 a 22 horas (ver nota para el día 8). </li></ol></li><li> Part-preparar el tampón de luminiscencia para el día siguiente: añadir DMSO y 10% de Triton-X-100 hasta el volumen requerido de S completa para obtener 1% de DMSO y 0,15% de Triton X-100. Permitir 5 ml por placa de lectura de luminiscencia, además de 1 ml para el cebado del inyector luminómetro. </li></ol></li><li> Día 8 de tareas: Leer extremos experimentales - fluorescencia y bioluminiscencia. (Lecturas de la fluorescencia de GFP se recomiendan como un medio para normalizar los datos de bioluminiscencia.) NOTA: Apunte a leer los puntos finales por 66 a 67 horas después de los alimentos suministrados a los nematodos con el fin de prevenir la producción de progenie significativa en las condiciones experimentales descritas. <ol><li> Configure la placa que se utiliza como control de fondo para las lecturas de las buenas prácticas agrarias. Combine así contenidos de 13 de la placa en un tubo de 15 ml. Permitir que los nematodos se asienten (2-3 min). Use el sobrenadante para cargar una microplaca (negro con fondo transparente) con 100 suspensión bacteriana l por pocillo. <ol><li> Observar la placa de control de fondo bajo el microscopio anotando pozos donde los nematodos se pueden ver. Excluir estos de la estimación de fondo utilizado en el análisis posterior de los datos. </li></ol></li><li> Leer la fluorescencia de cada placa de 96 pocillos, incluyendo el control de fondo. (Ajustes: la óptica de fondo de la placa; filtros de excitación 485/20; 528/20 emisión.) </li><li> Preparar tampón para las lecturas de luminiscencia: añadir luciferina (20 mM) a la parte preparada tampón (desde el día anterior), para obtener tampón de luminiscencia con 1% de DMSO (1x), 0,15% de Triton-X100 luciferina (3x) y 0,3 mM (3x ). Primer luminómetro 6x inyector con 150 l de tampón de luminiscencia. <ol><li> Paso anterior supone un 1% DMSO como vehículo durante la exposición al fármaco. Cuando el vehículo es agua, ajustar el concentration de DMSO en tampón de luminiscencia a 3% (es decir, 3x). </li></ol></li><li> Trabajar con una placa a la vez. Dispensar 50 l de tampón de luminiscencia por pocillo. (150 l de volumen final en bien; dilución 3x de tampón luminiscencia: 1% de DMSO, 0,05% Triton-X100 y 0,1 mM concentraciones luciferina finales.) Coloque inmediatamente sobre sacudiendo plataforma y comenzar temporizador. <ol><li> Después de 3 minutos de agitación plataforma (160 rpm), lee la luminiscencia (1 seg por medición). </li></ol></li></ol></li></ol> Análisis 4. Datos <ol><li> Restar media de fondo GFP lectura de los resultados de fluorescencia. Divida por bioluminiscencia respectiva lectura GFP. <ol><li> Cuando se detecta un alto valor de GFP para los nematodos expuestos a un compuesto, medir la fluorescencia del compuesto por sí mismo para tener en cuenta cualquier compuesto de fluorescencia. Si superior a la media, utilizar esto como el fondo en su lugar. </li></ol></li><li> Bioluminiscencia Express, GFP normalizado bioluminiscencia unND datos de fluorescencia de GFP como un porcentaje del valor medio para el control del vehículo en cada placa. </li><li> Trazar valores promedio y las barras de error para cada concentración. </li><li> Prueba de significación estadística utilizando 2-análisis de varianza (ANOVA) con efectos de &#39;concentración&#39;, &#39;Experiment&#39; y su interacción (cada punto de datos se refiere a un solo pozo), y el uso de la prueba de Dunnett como prueba post-hoc (vs . control del vehículo). NOTA: Si el &quot;experimento&quot; o los términos &quot;interacción&quot; son significativos, experimentos adicionales pueden ser necesarias para confirmar la respuesta. Donde no hay variabilidad entre los experimentos se desprende de la observación de los gráficos de datos, un ANOVA de una vía se puede realizar en los datos agrupados de experimentos independientes. <ol><li> Para el análisis estadístico de la placa (s) con sólo el vehículo, seleccionar todos los pocillos en las columnas 6 -7 y todos los pocillos en la fila H como grupo de control (éstas son las posiciones asignadas de forma rutinaria al vehículo durante las pruebas de compuesto). </li&gt; </ol></li></ol>

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R., DeVreese, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+of+aerobic+metabolism+and+superoxide+production+rate+potential+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Rate of aerobic metabolism and superoxide production rate potential in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> J Exp Zool. 274, 93-100 (1996).</li><li>Garigan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+tissue+aging+in+Caenorhabditis+elegans:+a+role+for+heat-shock+factor+and+bacterial+proliferation.">Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation.</a> Genetics. 161, 1101-1112 (2002).</li><li>Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorodeoxyuridine+affects+the+identification+of+metabolic+responses+to+daf-2+status+in+Caenorhabditis+elegans.">Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans.</a> Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).</li><li>Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+glycosyltransferase+BUS-8+has+two+distinct+and+essential+roles+in+epidermal+morphogenesis.">The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis.</a> Dev Biol. 317, 549-559 (2008).</li><li>Castro, P. V., Khare, S., Young, B. D., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+Battling+Starvation+Stress:+Low+Levels+of+Ethanol+Prolong+Lifespan+in+L1+Larvae.">Caenorhabditis elegans Battling Starvation Stress: Low Levels of Ethanol Prolong Lifespan in L1 Larvae.</a> PloS one. 7, (2012).</li><li>Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+Grow+or+Not+to+Grow:+Nutritional+Control+of+Development+During+Caenorhabditis+elegans+L1+Arrest.">To Grow or Not to Grow: Nutritional Control of Development During Caenorhabditis elegans L1 Arrest.</a> Genetics. 194, 539-555 (2013).</li><li>Baugh, L. R., DeModena, J., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Pol+II+Accumulates+at+Promoters+of+Growth+Genes+During+Developmental+Arrest.">RNA Pol II Accumulates at Promoters of Growth Genes During Developmental Arrest.</a> Science. 324, 92-94 (2009).</li><li>Maxwell, C. S., Antoshechkin, I., Kurhanewicz, N., Belsky, J. A., Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+control+of+mRNA+isoform+expression+during+developmental+arrest+and+recovery+in+C.+elegans.">Nutritional control of mRNA isoform expression during developmental arrest and recovery in C. elegans.</a> Genome Res. 22, 1920-1929 (2012).</li><li>Cressman, C. P., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+toxicants+for+toxicity+testing+using+Caenorhabditis+elegans+in+aquatic+media.">Reference toxicants for toxicity testing using Caenorhabditis elegans in aquatic media.</a> Am Soc Test Mater. 131, 518-532 (1997).</li><li>Khanna, N., Cressman, C. P., Tatara, C. P., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+to+pH,+salinity,+and+hardness+in+aquatic+media.">Tolerance of the nematode Caenorhabditis elegans to pH, salinity, and hardness in aquatic media.</a> Arch Environ Con Tox. 32, 110-114 (1997).</li><li>Benedetti, C., Haynes, C. M., Yang, Y., Harding, H. P., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-like+protein+5+positively+regulates+chaperone+gene+expression+in+the+mitochondrial+unfolded+protein+response.">Ubiquitin-like protein 5 positively regulates chaperone gene expression in the mitochondrial unfolded protein response.</a> Genetics. 174, 229-239 (2006).</li><li>Yang, W., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mitochondrial+Superoxide+Signal+Triggers+Increased+Longevity+in+Caenorhabditis+elegans.">A Mitochondrial Superoxide Signal Triggers Increased Longevity in Caenorhabditis elegans.</a> Plos Biol. 8, (2010).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar

El organismo modelo C. elegans proporciona un potente sistema experimental. Es fácil a la cultura y produce abundante descendencia genéticamente idéntica con un ciclo de vida de 3,5 días de huevo a la reproducción de los adultos (a través de las etapas larvales juveniles L1 hasta L4). Debido a su pequeño tamaño, puede ser convenientemente cultivadas en placas de 96 pocillos, lo que facilita la investigación de compuestos. Se presenta un protocolo de cribado fenotípico basado en cepas de C. elegans que actúan como sensores in vivo de los niveles de energía. 14 El protocolo es aplicable a cualquier laboratorio, aunque se requiere un luminómetro placa de 96 pocillos y un gabinete estéril. Es importante para prevenir la contaminación en ensayos mediante el uso de una buena técnica de laboratorio. Si se trabaja manualmente, el número máximo de placas de nematodos alcanzable es 13 por experimento permitiendo la prueba de 2x placas de 96 pocillos de drogas y que incluye dos placas de vehículos. Los resultados representativos se presentan para el complejo I mitocondrial inhibidor rotenone, el paraquat generador de superóxido, el oxalacetato intermedio ciclo del ácido cítrico y cuatro compuestos con conocida actividad inhibidora de la luciferasa de luciérnaga. Los dos primeros compuestos condujo a una disminución en la bioluminiscencia como se predijo mientras que oxaloacetato condujo a una mejora, es probable que el resultado de una mayor generación de ATP. Los conjuntos de datos oxaloacetato también demuestran la variabilidad intrínseca en los experimentos sobre la base de la luciferasa de luciérnaga como reportero. Un mínimo de tres experimentos independientes son aconsejables para comprobar la robustez de las respuestas a los compuestos desconocidos. La inhibición de la actividad de la luciferasa de luciérnaga era identificable con un ensayo in vitro utilizando un kit comercial. 3 Uno de los compuestos resultó en un incremento sustancial de la fluorescencia de GFP en consonancia con el inhibidor de aumentar los niveles de GFP-etiquetados luciferasa de luciérnaga mediante la unión a la de la enzima luciferasa activa sitio, y que lo hacen más estable. 15 En algunos casos(no en este caso particular) esto puede conducir a un aumento de los niveles de bioluminiscencia cuando el inhibidor se desplaza por el exceso de sustrato. 15 Es, por lo tanto, importante no interpretar los resultados erróneamente a partir de compuestos que interactúan con la enzima de luciérnaga como la disminución o el aumento de los niveles de ATP / función mitocondrial. Los cambios en la señal de luminiscencia muy a menudo se correlacionan con las mediciones adicionales de la salud tales como el movimiento, el desarrollo y el crecimiento. Como ejemplo, un compuesto es un inhibidor de la luciferasa sospechoso si se detecta una disminución dramática en la señal de bioluminiscencia pero los gusanos son indistinguibles de los controles por observación microscópica. Un aumento en la fluorescencia de GFP, no se explica por el crecimiento o autofluorescencia compuesto, también puede apuntar a un inhibidor. Una serie de inhibidores de luciferasa 15 son conocidos y se han celebrado PubChem. Por lo tanto, en primer lugar, es una buena práctica para consultar información sobre los inhibidores de la luciferasa en poder de PubChem; seguido por tresante de los efectos de compuestos en ensayos in vitro con la enzima purificada 3 y / o la confirmación de efectos sobre la función mitocondrial por medios adicionales. 16,17 Las mediciones de fluorescencia de GFP permiten la detección de los niveles de luciferasa de luciérnaga (y la detección potencial de algunos inhibidores de la enzima luciferasa como se discutió anteriormente) hacer un caso fuerte para la medición de este parámetro junto bioluminiscencia cuando sea posible. La normalización de las lecturas de bioluminiscencia a GFP es también un medio de dar cuenta de las variaciones en los números de gusano entre los pozos (aunque esto también puede lograrse mediante la inclusión de múltiples repeticiones técnica). Para mayor sensibilidad, es importante para restar la fluorescencia de fondo de las lecturas. El protocolo evalúa la contribución de la suspensión bacteriana a la fluorescencia de fondo, sin embargo autofluorescencia nematodo no se contabiliza (una limitación del ensayo actual, particularmente crítico para cualquier Stu envejecimientomuere dado que los aumentos de autofluorescencia nematodo con la edad). Autofluorescencia de compuestos de ensayo también debe evaluarse en paralelo. Normalización GFP parece indispensable donde los investigadores desean adaptar protocolo para comparar piscinas celulares de ATP en diferentes mutantes genéticos o después de silenciamiento de genes diferentes, con el fin de controlar por cualquier cepa diferencias en el nivel de expresión del transgén bioluminiscencia. Los parámetros críticos dentro del protocolo incluyen la etapa de desarrollo en que se inicia la exposición, la duración de la exposición, y la obtención de un número similar de nematodos en diferentes pocillos. La exposición puede comenzar en cualquier etapa del desarrollo de los nematodos, sin embargo fase L3 o es mayor preferible. A partir de este momento en adelante, los nematodos dependen de la fosforilación oxidativa para el desarrollo en la edad adulta, como lo demuestra un incremento muy significativo en el contenido de ADN mitocondrial, el consumo de oxígeno y los niveles de ATP. 18,19,20 El presente protocolo inicia exposUre en la etapa L4. La razón de alícuotas de nematodos a placas de 96 pocillos solamente en esta etapa (en lugar de cuando se proporcionaron primero con los alimentos en la fase L1), es que, aunque las placas se colocan en cámaras húmedas para minimizar la evaporación, un grado de evaporación todavía ocurre en nuestra incubadora de agitación, visto como gotitas muy pequeñas que se forman en las tapas (esto puede no ser un problema con otras incubadoras temblorosas). Por alícuotas de nematodos a las placas justo antes de la adición de las normas de drogas, la concentración real de drogas no se ve afectada por cualquier pequeña variación en el volumen debido a la evaporación. Cargando una placa nematodo con vehículo solamente es útil para verificar que los nematodos se distribuyeron de manera uniforme entre los pozos. Las diferencias significativas encontradas para el vehículo solamente la placa sería indicativo de una mala técnica en la dispensación de los nematodos a los pozos. La duración de la exposición es un factor importante a considerar. Si los efectos sobre el estado de la energía independientemente de crecimiento son de interés, el proprotocolo puede ser modificado para dar cabida a exposiciones más cortas (de respuestas casi inmediato a, por ejemplo, 2 h). Por otra parte, la entrada de compuestos en C. tejidos elegans puede tomar algún tiempo. Por ejemplo se requieren 12 a 24 hr para conseguir concentraciones internas máximas de resveratrol y 5-fluoro-2 &#39;desoxiuridina (FUdR). 21 Por lo tanto, una exposición más larga (18 a 24 horas) puede ser justificable para maximizar los niveles de exposición. El tiempo de exposición debe limitarse a los tiempos que no permiten niveles significativos de la reproducción que tengan lugar en el pozo. Se recomienda que el tiempo de desarrollo total de nematodos se mantiene en 66 a 67 h. Aunque conveniente, nematodos están grávidas para entonces y han iniciado de postura de. Sin embargo, encontramos lecturas de bioluminiscencia a partir de preparaciones de huevo para ser insignificante (no mostrado). El impulsada expresión transgénica sur 5-promotor se detectó por primera vez sólo dos a dos y media horas después de la fertilización en la etapa de 100 células 22 y el ccáscara de huevo hitinous es probable que limite la entrada de luciferina. Otros han encontrado que los huevos embrionados no contribuyeron significativamente al metabolismo de los adultos grávidas. 23 Sin embargo, las condiciones que permitan una producción significativa descendencia deben ser evitados. Si se prefiere, la escala de tiempo experimental se puede desplazar hacia atrás: hemos iniciado con anterioridad la exposición a una toxina ambiental en la última etapa de las larvas L3 (36 h) y llevado a cabo mediciones de bioluminiscencia y las buenas prácticas agrarias a 55 hr 2 fondos Alternativamente, genéticos que son condicionalmente estéril. se puede utilizar para prevenir la producción de progenie, como por ejemplo la fer-15 (b16) II; Fem-1 (HC17) IV doble mutante que puede mantenerse a 15 ° C, pero es estéril a 25 ° C. 24 El uso de FUDR para inducir la esterilidad no se recomienda ya que esto en sí mismo puede afectar el metabolismo de los nematodos. 25 El ensayo podría también se puede realizar en las cepas con cutículas más permeables tales como parcial pérdida de función bus-8 mutantes que son-multirresistente sensible debido a aumentar la permeabilidad de las drogas. 26 Esto facilitará exposiciones más cortas y las concentraciones de compuestos inferiores. Las condiciones para la adición de luciferina a estos nematodos también necesite ajustar es decir, 1% de DMSO y 0,05% de Triton-X100 en el búfer de luminiscencia puede no ser necesaria para mejorar la disponibilidad luciferina. El protocolo utiliza 1% de DMSO como vehículo para la entrega compuesto. Aunque no es mortal, esta concentración de DMSO tiene algunos efectos biológicos como hemos discutido en una publicación anterior. 3 Muchas de las bibliotecas de drogas disponibles se preparan en DMSO al 100%, en concentraciones que sean adecuados para ensayos basados ​​en células después de la dilución del vehículo a 0,1%. Se requieren concentraciones del compuesto más altos para obtener respuestas en C. elegans, en comparación con las células humanas, de modo que a menudo no es posible llevar a cabo ensayos a menor de un 1% de DMSO. Una vez más, el uso de cepas conmás cutículas permeables pueden conducir a pruebas con menores concentraciones de vehículo. No se recomiendan concentraciones de DMSO más alto que 1%. Un tiempo de incubación set con luciferina antes de las lecturas deben ser atendidas. Como se indica anteriormente, la luminiscencia llega a sus niveles máximos en el segundo minuto después de la adición de luciferina, permaneciendo relativamente estable durante los primeros 5 minutos, seguido de una disminución gradual lenta en la luminiscencia durante el próximo 30 min 1. Respuestas cinéticas a una sustancia química en particular puede llevar a cabo durante esta etapa inicial de 30 minutos después de la distribución inicial de luciferina. El protocolo implica una etapa de hambre después de la recogida de los huevos para conseguir la sincronización de la población de nematodos. Recomendamos la sincronización de las poblaciones de nematodos de prueba ya que diferentes etapas de desarrollo difieren en los niveles celulares de ATP y pueden responder de manera diferente a los compuestos de ensayo. Al llevar a cabo el hambre en S completamedio en comparación con M9, los nematodos incubar están provistos de una fuente de carbono (etanol), de modo que las larvas no se desarrollan completamente pero no se mueren de inanición. 27,28 También se ha demostrado que arrestado L1 de se cebó de respuesta rápida frente a la alimentación y tasa de crecimiento normal de L1 se logra dentro de 3 horas después de la comida se convierte en disponible. 29 Sin embargo, la posibilidad de que la etapa de inanición puede alterar el metabolismo de C. elegans no se puede excluir. 30 Por esta razón la longitud de la inanición no debe exceder de 24 hr (18 hr es suficiente para la sincronización). Ciertos laboratorios pueden tener la posibilidad de utilizar un Biosorter Copas para la sincronización de edad sin pasar por la etapa de inanición por completo. Otros laboratorios pueden tener una preferencia por la expansión de la población de nematodos en medios sólidos (NGM placas con OP50) antes del blanqueo (paso 3.1) y esto va a funcionar bien también. Utilizamos medio S durante la exposición al compuesto como un medio estándar para el cultivo de nematodos, however otros medios de comunicación se pueden seleccionar, por ejemplo medio K o EPA moderadamente agua dura se utilizan a menudo para estudios ecotoxicológicos. 31,32 El protocolo proporciona un medio para defender y para identificar candidatos para realizar más pruebas en cuanto a los efectos sobre la función mitocondrial. En la etapa de cribado primario es probable que algunos compuestos se han perdido debido a una sola concentración se está probando, por lo tanto, las pantallas de drogas no debe considerarse exhaustiva. Golpea pueden ser validados por el uso de técnicas para la evaluación de diferentes aspectos de la función mitocondrial para el consumo de oxígeno ejemplo, C. elegans cepas con GFP expresar las mitocondrias, las manchas de potencial de membrana mitocondrial y / o mediciones ROS. 16,33,34 La mayor importancia de la metodología es tener un medio para el cribado de gran número de compuestos y / o las condiciones a nivel del organismo multicelular, y esto es importante ser capaz de tomar ventaja de le tratabilidad genética de C. elegans para investigar mecanismos de acción. La técnica puede ayudar a acelerar y encontrar nuevas vías para el descubrimiento de compuestos y objetivos interesantes. Se prevé que la combinación del sensor con antecedentes genéticos asociados con la enfermedad humana para el cribado de bibliotecas de compuestos en un contexto relevante enfermedad tendrá mucho que ofrecer.

El propósito general de este procedimiento es la rápida cuantificación de la situación energética de C. elegans in vivo con el fin de utilizar esto como un punto final en el cribado del compuesto. El fundamento se basa en la expresión transgénica de la luciferasa de luciérnaga en el nematodo C. elegans desde 1 hasta 3 a través de la plásmido pSLGCV (1 <a href="https://www.addgene.org/49862" target="_blank">https://www.addgene.org/49862).</a> La enzima luciferasa se fusiona con el verde fluorescente GFP proteína y se expresa constitutivamente y de forma ubicua en el citoplasma (se retiró el peroxisoma luciferasa señal de orientación). Esto conduce a la emisión de luz cuando el sustrato luciferina se proporciona de forma exógena. A medida que el tornillo sin fin es transparente, la luz puede medirse en un luminómetro como unidades relativas de luz (RLU). Combustibles ATP celular la reacción de bioluminiscencia y su disponibilidad determina los niveles de luz producidos. En consecuencia, luminometría ofrece una convenient significa evaluar los niveles relativos de la ATP y por extensión de la función mitocondrial, ya que la producción de ATP se produce principalmente en las mitocondrias. Un enlace entre los niveles de función y de bioluminiscencia mitocondriales ha sido previamente demostrada a través del silenciamiento de genes de la cadena de transporte de electrones mitocondriales y concomitante salida de luz reducida. 1 Las cepas de bioluminiscencia generados fueron designados PE254 (feIs4) y PE255 (feIs5) 1 (véase la lista de materiales) y se puede utilizar indistintamente. 3 Un número de estudios han utilizado estas cepas de sensores para informar sobre los niveles celulares de ATP in vivo tras la exposición a diversos productos químicos xenobióticos tales como azida de sodio 1, cadmio 2, las aguas residuales extracto de lodos 3, 5&#39;-fluoro-2-desoxiuridina 6, y una nitrosamina específica del tabaco-7. Las cepas también han sido útiles para controlar los efectos de la exposición a la radiación ultravioleta C <sup&gt; 8 y los efectos de la interrupción de la función de la cadena respiratoria mitocondrial. 1,9 Una primera versión del sensor de luminiscencia que expresa el gen de la luciferasa sin una fusión GFP (PE39) también se ha utilizado en la investigación de los efectos de los metales pesados ​​y de un respiratoria . desacoplador 10 cepas PE254 y PE255 llevan la luciferasa: GFP fusión y GFP fluorescencia ha demostrado aumentar proporcionalmente con la masa de nematodos, que ofrece un medio conveniente para la normalización de los valores de luminiscencia 6,9 Los efectos de la cantidad diferencial de los gusanos por así también pueden ser. tenido en cuenta al incluir múltiples repeticiones técnica en el ensayo (un mínimo de 5 pozos por condición). 3 El protocolo ofrece la posibilidad de monitorización in vivo de los niveles de energía (en comparación con más técnicamente laborioso in vitro determinaciones de ATP) que permite la investigación de compuestos y reposicionamiento en el contexto fisiológico de toda una muorganismo lticellular. El procedimiento se puede extender a una variedad de orígenes genéticos de cruzar el transgén cromosómicamente integrados en cepas mutantes disponibles y / o por silenciar genes mediante ARN de interferencia; por lo tanto, aprovechando al máximo C. elegans como organismo modelo. El método debe ayudar a reducir la pérdida de fase tardía de candidatos a fármacos debido a la toxicidad mitocondrial y hacer una contribución a la reducción de la experimentación con animales superiores.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Orion II Microplate Luminometer</td>
			<td>Berthold Detection Systems</td>
			<td></td>
			<td>with injector and the Simplicity 4.2 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLx800 fluorimeter&#160;</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td>with Gen5 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ks 130 basic shaking platform</td>
			<td>Ika</td>
			<td>#0002980000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Innova 4349</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Refrigerated incubator shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf centrifuge 5804R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>with eppendorf rotor A-4-44&#160; (for 50/15ml tubes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripette, Costar</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#4489</td>
			<td>Serological pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstar 50 ml tubes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#227661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstar 15 ml tubes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstar 60 mm tissue culture plates&#160;</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#631-0909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile spatula</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#3007; #3004</td>
			<td>for weighing out chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 mM Millex GP filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>#SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen eppendorf tubes 1.5 ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#MCT-150-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96 well assay plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#3603</td>
			<td>Black plate clear bottom with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96 well assay plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#236105</td>
			<td>White plate with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir reagent 60 mL</td>
			<td>Thermo Scientific Finnpipette</td>
			<td>#9510027</td>
			<td>used as trough for nematodes&#160; in protocol section 4.4.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage box/damp chamber</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>#10 800 058 001</td>
			<td>174 x101 x 56.6 mm, used as a damp chamber with wet paper towels; 2X 96-well plates with lids can fit into one, the lower sitting on top of a microplate lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach: Sodium hypochlorite solution 4-4.99% Chlorine content</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#239305</td>
			<td>Store in aliquots at 4&#176;C,&#160; seal with parafilm to prevent loss of chlorine and cover in foil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, potassium salt</td>
			<td>Biotium Inc</td>
			<td># 10101-2</td>
			<td>Molecular Probes can also be used as supplier; prepare a 20 mM stock in ddH2O, keep at -20 &#176;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td># P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>CalBiochem</td>
			<td>#317275</td>
			<td>Purity 99.99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>#A16046</td>
			<td>Diltute to 10% in ddH20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin</td>
			<td>CalBiochem</td>
			<td>#475914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans bioluminescent strains</td>
			<td>Author&#39;s own laboratory</td>
			<td>PE254, PE255</td>
			<td>contain integrated arrays feIs4 and feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)] respectively on chromossome V and X; select for homogeneous and strong expression of luc::GFP by fluorescence microscopy (e.g. pick 15 worms) every now and then.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli OP50</td>
			<td>CGC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General chemicals</td>
			<td>Sigma Aldrich/Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a screenable in vivo assay for mitochondrial modulators using transgenic bioluminescent caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

Los resultados representativos para ilustrar el método se obtuvieron para rotenona (Figura 1), paraquat (Figura 2), el oxalacetato (Figura 3), y 4 compuestos que fueron recogidos como inhibidores de la luciérnaga luciferasa durante el cribado de una biblioteca de medicamentos 13 (Figura 4). La exposición al fármaco se inició en la etapa L4 en todos los casos, pero los experimentos de exposición de paraquat se comenzó a las 41 horas después de la comida proporcionada primero a los nematodos en comparación con, 45-46 h para los otros compuestos. El protocolo permite un grado de flexibilidad en la selección de tiempo para el inicio de la exposición al fármaco y la duración de la exposición. Sin embargo, para fines de selección, establecer tiempos deben ser atendidas una vez seleccionado, para la reproducibilidad entre los experimentos. Los puntos finales deben ser medidos por de 66-67 hr tiempo de desarrollo con el fin de prevenir extensa puesta de huevos y eclosión de la progenie en los pozos. Directrices para los tiempos se proporcionan en Tpoder 1. Rotenona, un complejo I mitocondrial inhibidor, reduce la bioluminiscencia después de que ambos relativamente cortos (2 hr) y más largas exposiciones (24 hr) a un rango de concentraciones (Figura 1). En este caso, no se tomaron medidas de buenas prácticas agrarias, pero el número de repeticiones técnica utilizados (n = 6) es suficiente para igualar las diferencias en los números de gusano entre los pozos 3. La exposición de 24 horas es una ventana de tiempo durante el cual crecen los nematodos, y el desarrollo más lento como consecuencia de la inhibición del complejo I se espera que contribuyan a la disminución de la bioluminiscencia. Esto fue confirmado por la observación visual bajo estereoscopio con retraso en el desarrollo visto, en particular en concentraciones de 20 mM y superiores; además algunos letalidad se observó a partir de 40 M (observaciones cualitativas no cuantificados). No letalidad se observó después de la exposición de 2 horas, pero se observaron efectos sobre el movimiento de gusano. Una fuerte caída de la bioluminiscencia en relación con los controles ocuRRed a la concentración más baja de rotenona probados 2,5 M, para la que no se detectaron efectos fácilmente por observación visual rápida en 2 h de exposición. Este descenso en la bioluminiscencia es consistente con la reducción de ATP celular. La inhibición máxima se logró con la concentración más baja de la rotenona utilizada (2,5 M) que indica que ningún experimentos posteriores dirigidas específicamente a la rotenona deben llevarse a cabo entre 0 y 5 mM [el intervalo de concentración desde 0 hasta 160 mM fue seleccionado como parte de una comparación con otros fármacos identificado inicialmente como tener efectos significativos en el 10 M (que se publicará en otros lugares)]. El herbicida paraquat afecta a la función mitocondrial a través del aumento de las especies reactivas del oxígeno. Aquí, nos demuestran su efecto sobre la bioluminiscencia de C. elegans cepa PE254 después de la exposición a un rango de concentraciones de 24 horas (Figura 2). Como la cepa lleva una luc :: fusión GFP, GFP fluorescencia fue del also mide como un medio de normalización. 6,9 Paraquat disminuyó la bioluminiscencia, la fluorescencia de GFP y la bioluminiscencia normalizada de manera significativa. La prueba post-hoc de Dunnet indicó que las concentraciones de paraquat con diferencias significativas en relación con el control del vehículo eran 4 y 8 mM de bioluminiscencia y bioluminiscencia normalizado, así como 2 mM de bioluminiscencia normalizado. La única concentración que reduce significativamente la fluorescencia de GFP fue de 8 mm, una concentración en la que los efectos del crecimiento y el gusano muerto ocasional se observaron (observaciones cualitativas). La disminución de la bioluminiscencia (y bioluminiscencia normalizada) fue mayor que la de la fluorescencia, en consonancia con disminución de la función y los efectos sobre la producción de ATP mitocondrial. El oxalacetato intermedio ciclo del ácido cítrico probado en C. elegans PE254 cepa a una sola concentración de 8 mM, condujo a un aumento en la bioluminiscencia (Figura 3). No es fluorescente GFPmediciones NCE se obtuvieron u observación visual adicional llevan a cabo; Sin embargo, tales respuesta a una única concentración merecería la exposición adicional confirmatorio para un intervalo de concentraciones, y las observaciones más detalladas de efectos. Una mejora de la bioluminiscencia por este compuesto no es sorprendente, ya que se puede postular a llevar a una mayor actividad del ciclo del ácido cítrico, con última instancia, una mayor producción de ATP (no obstante, sería conveniente para el control de los efectos sobre los niveles de luciferasa mediante la evaluación de la fluorescencia de GFP en experimentos posteriores). Los conjuntos de datos oxaloacetato muestran revelar el grado de variabilidad en la respuesta observada en los experimentos basados ​​en la luciferasa. En nuestra experiencia esta variabilidad es una característica del sistema de prueba en particular para las condiciones de exposición menos perjudiciales. El compuestos inhibidores luciferasa de luciérnaga DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 y DDD00023047 se pusieron a prueba tanto in vitro examinado los efectos sobre el puenzima rified e in vivo usando el C. elegans luc: GFP expresando cepa. No hubo evidencia de que cualquiera de los compuestos ensayados causado la muerte de nematodos en las condiciones de exposición. Todos los compuestos 4 afectaron a la actividad de luciferasa in vitro a las 2 concentraciones ensayadas 25 y 100 mM (Figura 4A). DDD00001434 mató a la actividad de la luciferasa purificada casi por completo, lo que proporciona una justificación creíble para la gran disminución de la bioluminiscencia in vivo (Figura 4B). Aunque, la in vitro y ensayos in vivo no son directamente comparables, la respuesta a DDD00023047 fue similar en ambos ensayos. DDD0001477 y DDD00000635 causaron una mayor disminución en vivo que en in vitro. Estos compuestos fueron proporcionados a los gusanos vivos 22 h antes de sustrato luciferina, y los resultados pueden reflejar que no fueron desplazados fácilmente desde el sitio activo de la luciferasa cuando se convirtió en luciferina available. Alternativamente, DDD0001477 y DDD00000635 pueden tener un efecto adicional en los niveles celulares de ATP. Esto tendría que ser evaluado por medios que no impliquen la luciferasa de luciérnaga. Destaca el fuerte aumento de la señal de las buenas prácticas agrarias en gusanos vivos expuestos al compuesto DDD00000635. Esto se discutirá a continuación. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig1.jpg" /> Figura 1. El complejo I mitocondrial inhibidor de rotenona disminuyó el estado de energía de C. elegans, medida por bioluminiscencia de PE254 cepa. gusanos etapa sincronizada L4 (, 45-46 hr después de la comida proporcionada a larvas L1) expuestos a 0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 y 160 mM rotenona en 1% de DMSO durante 2 hr (corto) o 24 horas (exposición larga) lecturas previas de la bioluminiscencia, respectivamente, a las 48 y 69 h de desarrollo gusano después de la comida proporcionada. Bioluminiscencia (unidad relativa Unidades de Luz, RLU) se expresó como un porcentaje del vehículo (1% DMSValores O). Las barras de error representan SEM de técnicos repeticiones a cada concentración de rotenona (n = 6). Todas las concentraciones ensayadas resultaron en una diferencia estadísticamente muy significativa en relación con el control del vehículo (p &lt;0,001). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig2.jpg" /> Figura 2. El factor de estrés oxidativo paraquat disminuyó el estado de energía de C. elegans PE254 cepa de una manera dependiente de la concentración (medida por bioluminiscencia). gusanos etapa sincronizada L4 (por conveniencia en este caso en 41 horas después de la comida proporcionada a las larvas L1) fueron expuestos a 0, 0,25, 0,5, 1, 2, 4 o 8 paraquat mM durante 24 hr. La fluorescencia de GFP (unidad unidades de fluorescencia relativa, RFU) se utilizó para normalizar los datos de bioluminiscencia (unidad RLU), ambos puntos finales obtenidos en el desarrollo 65 hr. Los datos se expresan como porcentaje de los controles (1% de DMSO). Las barras de error representan SEM de repeticiones técnica(n = 5 para diferentes concentraciones; n = 18 para los controles). ANOVA de un factor: *** p &lt;0.001 en relación con el control del vehículo. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig3.jpg" /> La Figura 3. El ciclo del ácido cítrico oxalacetato intermedio (8 mM) mejoró la bioluminiscencia de C. elegans PE254 cepa. gusanos etapa Sincronizado L4 (45-46 horas después de la comida proporcionada a las larvas L1) fueron expuestos a recién preparada oxaloacetato 8 mM durante 18 h ± 30 min. La bioluminiscencia (unidad RLU) se leyó a un tiempo de desarrollo de 63,5 ± 1 hr hr y se expresó como un porcentaje del control del vehículo (ddH 2 O). Diferentes columnas representan diferentes conjuntos de datos de 8 repeticiones técnica asignados a diferentes placas de 96 pocillos en el mismo experimento. Las barras de error representan SEM de repeticiones técnica (n = 8). 2-forma ANOVA con &#39;set&#39; y &#39;concentración&#39; como factores: ̵6; Set &#39;p&gt; 0.05,&#39; &#39;p concentración &lt;0,001 y término de interacción p&gt; 0,05. LA <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig4ahighres.jpg" width="650" /> B <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig4bhighres.jpg" width="650" /> Figura 4. Ensayo de las respuestas a 4 compuestos de la biblioteca de Dundee descubrimiento de fármacos compuesto 13 (C1: DDD00001434, C2: DDD0001477, C3: DDD00000635 y C4: DDD00023047) con conocida actividad inhibidora sobre la luminiscencia de luciferasa de luciérnaga. (A) Efecto de los compuestos sobre la actividad de la luciferasa de luciérnaga purificado (medido como unidades de luz, RLU), expresada como un porcentaje de control del vehículo. El kit CLSII bioluminiscencia de ATP (Roche, Manheim, Alemania) se utilizó según las instrucciones con la misma cantidad de enzima luciferasa en alícuotas a los pocillos blanco (96-well placas de microtitulación). ATP se proporcionó a una concentración final de 10 mM y 1 l del compuesto (concentración final indicada) o se añadió DMSO (1%). Señal de luminiscencia se integró durante 10 s. Las barras de error representan SEM de repeticiones técnica (n = 4). Análisis: un modelo lineal; * p &lt;0,05 o *** p &lt;0,001 con respecto al control del vehículo. Las diferencias entre los 25 y los 100 M altamente significativos para C1 (DDD00001434; p &lt;0,001), y significativa para C2 y C3 (respectivamente DDD0001477 y DDD00000635; p &lt;0,05). (B) in vivo mediciones de la bioluminiscencia, la bioluminiscencia normalizaron a la fluorescencia de GFP y GFP fluorescencia de C. elegans PE254 deformación a 67 horas el tiempo de desarrollo tras la exposición a los compuestos de ensayo durante 22 horas. Las barras de error representan SEM de repeticiones técnica (n = 8). El análisis estadístico (Una forma-ANOVA) lleva a cabo sobre los datos agrupados de 3 conjuntos de datos (3 xn = 8). * p &lt;0,05 o *** p &lt;0,001 con respecto al control de vehículo respectivo. Differences entre 25 y 100 mM única estadísticamente significativa (p &lt;0,05) para la bioluminiscencia normalizado tras la exposición a C4 (DDD00023047). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Hora del día </td><td> Día 1 </td><td> Dia 2 </td><td> Día 3 </td><td> Día 4 </td><td> Día 5 </td><td> Día 6 </td><td> Día 7 </td><td> Día 8 </td></tr><tr><td> 9-10 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Paso 5 </td></tr><tr><td> 10-11 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Paso 5 </td></tr><tr><td> 11-12 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Etapa 4 </td><td> Paso 5 </td></tr><tr><td> 12-13 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Etapa 4 </td><td></td></tr><tr><td> 13-14 </td><td&gt; </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 14-15 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15-16 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 16-17 </td><td> Paso 1 </td><td></td><td></td><td></td><td> Paso 3 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 17-18 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 18-19 </td><td></td><td></td><td></td><td> Paso 2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1. Descripción general de los pasos del protocolo que se lleva a cabo en cada día de los experimentos de nematodos (Sección 3) y sugirió tiempos.

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A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

Un rastreable<em&gt; En Vivo</em&gt; Ensayo para mitocondrial Moduladores Usando transgénico bioluminiscente<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

9.9K vistas.  University of Aberdeen. A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function. 

Video: A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Generación de transgénicos estable C. elegans con microinyección

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Investigación

Biología

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system is valuable for the pre-clinical in vivo evaluation of putative antitumor compounds.
The 4T1 cell line has been engineered to constitutively express the firefly luciferase gene (luc2). When mice carrying 4T1-luc2 tumors are injected with Luciferin the tumors emit a visual light signal that can be monitored using a sensitive optical imaging system like the IVIS Spectrum. The photon flux from the tumor is proportional to the number of light emitting cells and the signal can be measured to monitor tumor growth and development. IVIS is calibrated to enable absolute quantitation of the bioluminescent signal and longitudinal studies can be performed over many months and over several orders of signal magnitude without compromising the quantitative result.
Tumor growth can be monitored for several days by bioluminescence before the tumor size becomes palpable or measurable by traditional physical means. This rapid monitoring can provide insight into early events in tumor development or lead to shorter experimental procedures.
Tumor cell death and necrosis due to hypoxia or drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This cell death might not be accompanied by a reduction in tumor size as measured by physical means. The ability to see early events in tumor necrosis has significant impact on the selection and development of therapeutic agents.
Quantitative imaging of tumor growth using IVIS provides precise quantitation and accelerates the experimental process to generate results.

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Mammary tumor cells expressing luciferase are implanted subcutaneously in mice and visualized using optical imaging to monitor tumor growth and development non-invasively in a longitudinal study.

En vivo bioluminiscente de imágenes de tumores de mama mediante el espectro de IVIS

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Generación de transgénicos C. elegans Por la transformación biolística

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Time-lapse microscopía de embriogénesis temprana en Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the environment, but also determines body shape and plays a role in motility4-6. Several layers secreted by epidermal cells comprise the cuticle, including an outermost lipid layer7.
Circumferential ridges in the cuticle called annuli pattern the length of the animal and are present during all stages of development8. Alae are longitudinal ridges that are present during specific stages of development, including L1, dauer, and adult stages2,9. Mutations in genes that affect cuticular collagen organization can alter cuticular structure and animal body morphology5,6,10,11. While cuticular imaging using compound microscopy with DIC optics is possible, current methods that highlight cuticular structures include fluorescent transgene expression12, antibody staining13, and electron microscopy1. Labeled wheat germ agglutinin (WGA) has also been used to visualize cuticular glycoproteins, but is limited in resolving finer cuticular structures14. Staining of cuticular surface using fluorescent dye has been observed, but never characterized in detail15. We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. This optimized protocol for DiI staining is a simple, robust method for high resolution fluorescent visualization of annuli, alae, vulva, male tail, and hermaphrodite tail spike in C. elegans.

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. With this optimized protocol, alae and annular cuticular structures are stained by DiI and observed using compound microscopy.

La visualización de Caenorhabditis Elegans Estructuras de la cutícula uso del colorante lipofílico Vital, DII

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in the brain, heart, skeletal muscle and endocrine tissue1,2. GIRK channels become activated following the binding of ligands (neurotransmitters, hormones, drugs, etc.) to their plasma membrane-bound, G protein-coupled receptors (GPCRs). This binding causes the stimulation of G proteins (Gi and Go) which subsequently bind to and activate the GIRK channel. Once opened the GIRK channel allows the movement of K+ out of the cell causing the resting membrane potential to become more negative. As a consequence, GIRK channel activation in neurons decreases spontaneous action potential formation and inhibits the release of excitatory neurotransmitters. In the heart, activation of the GIRK channel inhibits pacemaker activity thereby slowing the heart rate.
GIRK channels represent novel targets for the development of new therapeutic agents for the treatment neuropathic pain, drug addiction, cardiac arrhythmias and other disorders3. However, the pharmacology of these channels remains largely unexplored. Although a number of drugs including anti-arrhythmic agents, antipsychotic drugs and antidepressants block the GIRK channel, this inhibition is not selective and occurs at relatively high drug concentrations3.
Here, we describe a real-time screening assay for identifying new modulators of GIRK channels. In this assay, neuronal AtT20 cells, expressing GIRK channels, are loaded with membrane potential-sensitive fluorescent dyes such as bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol [DiBAC4(3)] or HLB 021-152 (Figure 1). The dye molecules become strongly fluorescent following uptake into the cells (Figure 1). Treatment of the cells with GPCR ligands stimulates the GIRK channels to open. The resulting K+ efflux out of the cell causes the membrane potential to become more negative and the fluorescent signal to decrease (Figure 1). Thus, drugs that modulate K+ efflux through the GIRK channel can be assayed using a fluorescent plate reader. Unlike other ion channel screening assays, such atomic absorption spectrometry4 or radiotracer analysis5, the GIRK channel fluorescent assay provides a fast, real-time and inexpensive screening procedure.

A real-time screening procedure for identifying drugs that interact with G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels is described. The assay utilizes membrane potential-sensitive fluorescent dyes to measure GIRK channel activity. This technique is adaptable for use on a number of cell lines.

Un ensayo de cribado para la identificación de moduladores fluorescente de canales GIRK

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos de sincronización y de observación

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Extracción y análisis de prostaglandina en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media (mCeHR). Additionally, the steps for exposing and acclimatizing C. elegans grown on E. coli to axenic liquid media are described. Finally, downstream experiments that utilize axenic C. elegans illustrate the benefits of this procedure. The ability to analyze and determine C. elegans&#160;nutrient requirement was illustrated by growing N2 wild type worms in axenic liquid media with varying heme concentrations. This procedure can be replicated with other nutrients to determine the optimal concentration for worm growth and development or, to determine the toxicological effects of drug treatments. The effects of varied heme concentrations on the growth of wild type worms were determined through qualitative microscopic observation and by quantitating the number of worms that grew in each heme concentration. In addition, the effect of varied nutrient concentrations can be assayed by utilizing worms that express fluorescent sensors that respond to changes in the nutrient of interest. Furthermore, a large number of worms were easily produced for the generation of transgenic C. elegans using microparticle bombardment.

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

C. elegans is usually grown on solid agar plates or in liquid cultures seeded with E. coli. To prevent bacterial byproducts from confounding toxicological and nutritional studies, we utilized an axenic liquid medium, CeHR, to grow and synchronize a large number of worms for a range of downstream applications.