Los modelos animales fiables son componentes cruciales de la investigación básica. Nuestro enfoque murino permite responder preguntas inmunológicas sobre la mecanicismo y la cinética del desarrollo de lesiones pulmonares agudas en mamíferos. La mínima invasividad, el manejo sencillo, así como la buena reproducibilidad son las principales ventajas de esta técnica.
Además, con la valoración de la dosis, podemos modular el efecto clínico. Esta técnica refleja la situación clínica de los pacientes con lesión pulmonar grave y permite investigar los mecanismos subyacentes. Almacene lipopolisacárido, o LPS, en alícuotas a una concentración de cinco miligramos por mililitro a menos 20 grados centígrados.
Para la instilación intratraqueal, diluir el LPS descongelado en solución salina tamponada de fosfato estéril a una concentración final de 2.000 microgramos por mililitro. Corte un catéter venoso de calibre 22 a una longitud de 20 milímetros. Coloque el ratón en la posición propensa sobre una mesa de temperatura controlada para mantener una temperatura corporal de 37 grados centígrados.
Después de la anestesia como se describe en el protocolo de texto, aplicar lubricante oftálmico estéril para prevenir la desceración de las córneas bajo anestesia. Levante los incisivos de la cabeza y el gancho en una barra horizontal situada aproximadamente cinco centímetros por encima de la mesa, mientras que las sierras delanteras permanecen en estrecho contacto con la mesa. Súper extender el cuello en un ángulo de 90 grados en relación con la mesa.
Coloque una fuente de luz fría sobre la piel por encima de la laringe para ayudar a visualizar las cuerdas vocales y apuntar a la tráquea. Sostenga la lengua con fórceps para enderezar la garganta para condiciones de intubación más fáciles. La visualización e identificación adecuadas de la laringe son fundamentales para asegurar la correcta colocación intratraqueal del catéter.
Una fuente de luz fría externa ayuda en este paso. Inserte el catéter aproximadamente 10 milímetros en la tráquea. Asegúrese de que la inserción no es demasiado profunda, ya que esto resultará en una instilación unilateral de líquido en el bronquio principal derecho o izquierdo.
Si se produce resistencia a la laringe, retraiga el catéter unos milímetros antes de volver a avanzar. Ahora, inyecte el MPBS diluido por LPS con una pipeta. El volumen inyectado depende del peso corporal del ratón.
Conecte una jeringa y añada un bolo de 50 microlitros de aire para garantizar que el volumen completo del líquido se distribuya en los pulmones. Retire lentamente el catéter. Mantenga la parte superior del cuerpo del ratón en posición vertical durante 30 segundos para evitar la fuga del líquido de la tráquea.
Fije el ratón eutanizado con cinta adhesiva en una mesa de operaciones y desinfecte el pelaje sobre el abdomen con 70% de etanol. Abra la cavidad abdominal cuidadosamente en la línea mediana con tijeras y pinzas. Retirar partes del intestino para lograr el acceso a la vena cava inferior derecho a la columna vertebral en la aorta abdominal.
Localice las venas renales e inserte una cánula doblada de calibre 23 conectada a una jeringa de un mililitro en la vena cava inferior, directamente debajo de la confluencia de las venas. Aspirar 250 microlitros de sangre y transferirlos a un tubo de 1,5 mililitros lleno de 20 microlitros de 0,5 molares de solución EDTA. Agitar suavemente para facilitar la mezcla de EDTA y poner el tubo sobre hielo.
Para el lavado broncoalveolar, prepare tres jeringas de un mililitro, cada una con 0,5 mililitros de PBS estéril y 0,1 mililitros de aire. Desinfectar el pelaje de la garganta con 70%etanol y exponer cuidadosamente la tráquea con tijeras y pinzas. Moviliza la tráquea y envuelve una sutura alrededor de ella.
Perfore la tráquea con microc tijeras e inserte un catéter venoso del calibre 22, cortado a una longitud de 20 milímetros. Fije el catéter con una sutura e instilo 0,5 mililitros de PBS estéril y 0,1 mililitro de aire. Aspirar el líquido después de 60 segundos.
Repita el procedimiento con las dos jeringas adicionales y recoja todo el aspirado en un tubo de 15 mililitros sobre hielo. Abra cuidadosamente el tórax con tijeras y pinzas para cosechar los pulmones. Corte el diafragma a lo largo del margen costal y corte las costillas con dos incisiones laterales.
Evite perforar cuidadosamente los pulmones. Levante el esternón y fíjelo o retírelo. Prepare dos jeringas de 10 mililitros con PBS caliente de 37 grados centígrados.
Haga una pequeña incisión en el ventrículo izquierdo. Perforar el ventrículo derecho con una cánula de calibre 26. Luego, enjuague la circulación pulmonar con un PBS precalecado.
Tenga en cuenta que los pulmones se vuelven pálidos durante el procedimiento. Retire el lóbulo derecho de los pulmones y córtelo en mitades. Enganche en nitrógeno líquido seguido de almacenamiento a largo plazo a menos 80 grados Celsius para una mayor expresión génica y análisis de proteínas.
Retire todo el pulmón izquierdo y homogeneizarlo en una placa de 48 pozos picando el tejido con tijeras y pinzas. Incubar el tejido en dos mililitros de tampón de digestión a 37 grados Celsius durante 60 minutos. Realizar una mayor homogeneización pipeteando cuidadosamente las piezas del tejido pulmonar hacia arriba y hacia abajo.
Transfiera las muestras de sangre a tubos FACS de cinco mililitros y mezcle suavemente la sangre con dos mililitros de tampón de lelisis de glóbulos rojos. Ponga los tubos sobre hielo y termine la reacción después de dos minutos añadiendo dos mililitros de PBS helado. Centrifugar la muestra durante cinco minutos a 400 g y deseche el sobrenadante.
Resuspender el pellet celular con 60 microlitros de tampón FACS y proceso para la posterior tinción FACS de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente. Centrifugar el líquido BAL durante cinco minutos a 400 veces g. Aspirar el sobrenadante y congelarlo en nitrógeno líquido seguido de almacenamiento a largo plazo a menos 80 grados Celsius para un análisis de proteínas adicionales.
Después de resuspender el pellet de la célula BAL con dos mililitros de tampón FACS frío, transfiera la suspensión a un tubo FACS de cinco mililitros utilizando un filtro de malla de 100 micras para sujetar los cabellos. Después de centrifugar la muestra de nuevo, resuspender el pellet con 60 microlitros de tampón FACS y procesar para la tinción FACS posterior de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente. Ahora, transfiera el tejido pulmonar izquierdo digerido a un tubo FACS de cinco mililitros usando un filtro de malla de 100 micras para extraer grumos.
Termine el proceso de digestión añadiendo dos mililitros de tampón FACS helado antes de centrifugar la muestra durante cinco minutos a 400 veces g. Deseche el sobrenadante y resusppend el pellet con 60 microlitros de tampón FACS y procese para la posterior tinción FACS de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente. Para un análisis FACS, agregue 20 microlitros de solución de bloqueo de anticuerpos CD16/CD32 a 60 microlitros de células en un tubo de cinco mililitros.
Incubar las células a cuatro grados centígrados durante 15 minutos para bloquear la unión inespecífica de inmunoglobulina a los receptores Fc. Mientras tanto, prepare una mezcla maestra con búfer FACS y anticuerpos, como se describe en el protocolo de texto. Después del bloqueo, no lave las células.
Añadir 20 microlitros de mezcla maestra de anticuerpos por muestra para obtener un volumen final de 100 microlitros. Incubar las muestras durante 20 minutos, en la oscuridad, a cuatro grados centígrados. Lave cada muestra con un mililitro de tampón FACS y centrífuga como antes.
Deseche el sobrenadante y resuspender el pellet con tampón FACS a la concentración celular adecuada para las mediciones de FACS. Por último, agregue números fijos de perlas de calibración acopladas al fluorocromo disponibles comercialmente a cada muestra para determinar los números de celda absolutos. Realice la citometría de flujo utilizando la estrategia de medición que se muestra en el protocolo de texto para células de sangre, BAL y tejidos.
24, así como 72 horas después de la instilación intratraqueal, la expresión de TNF-alfa en el tejido pulmonar se reguló significativamente, alcanzando un aumento sostenido y más de 50 veces en comparación con los animales de control. La invasión de leucocitos en el tejido y el espacio alveolar es una característica y característica para el desarrollo de lesiones pulmonares agudas. El análisis del FACS reveló una infiltración significativa de granulocitos neutrófilos en el intersticio pulmonar, con un recuento celular absoluto que aumentó casi nueve veces en comparación con los controles después de 24 horas.
El recuento absoluto de granulocitos neutrófilos disminuyó ligeramente después de 72 horas, sin embargo, el aumento del factor en comparación con los controles se mantuvo. En consonancia con la infiltración intersticial de granulocitos neutrófilos, la expresión de MMP-9 en todo el tejido pulmonar también se incrementó significativamente durante el período de observación total. Los granulocitos neutrófilos no sólo aumentaron en el tejido pulmonar, sino también en el líquido BAL.
El aumento del pliegue en comparación con los animales de control fue más pronunciado que en el tejido pulmonar. El edema pulmonar debido a un deterioro grave de la barrera alveolocapillaria es patognomónico para el desarrollo de lesiones pulmonares agudas. El análisis del contenido de albúmina en fluido BAL por ELISA reveló una pérdida significativa de la función de barrera a las 24 horas y 72 horas después de la instilación de LPS.
La colocación adecuada del catéter es crucial para la instilación bilateral de LPS. A menudo, los cambios en los patrones respiratorios, como toser o jadear, indican una instilación intratraqueal correcta del líquido. Después de la inducción de la lesión pulmonar aguda, se pueden realizar una serie de pasos posteriores, como el análisis FACS, la PCR, una detección de proteínas, para responder a las preguntas de investigación respectivas.
