Este trabajo fue apoyado por el NIH Grant HL093196 (RCR) y el Centro de Atlanta y la Fundación de Educación (AREF).

I. La sensibilización alérgica y el desafío (ver Figura 1) A. Para Challenge intratraqueal <ol><li> Por sensibilización inicial, inyectar macho o hembra C57BL / 6 o ratones BALB / c (6-8 semanas de edad) por vía intraperitoneal el día 0 y de nuevo el día 7 con 20 mg de ovoalbúmina (OVA; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) emulsionado en 0,2 ml de fosfato de solución salina estéril tamponada (PBS) que contenía 2 mg de hidróxido de aluminio (Sigma-Aldrich) o con 2 mg de hidróxido de aluminio en 0,2 ml de PBS estéril como control. </li><li> Desafío con el antígeno como apropiado (por ejemplo, en los días 14, 16, 18 y 20). Desafío procedimiento siguiente. </li><li> Anestesie ratón con una inyección intraperitoneal (ip) de inyección de una mezcla de ketamina (90 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg). Asegúrese de que el ratón está totalmente anestesiado durante al menos 10 minutos. </li><li> La superficie de operación de ángulo a 45 grados o más. Coloque el cursor sobre esta superficie de mantenimiento de la parte ventral hacia arriba y la cabeza en la parte superior. </li><li> Hook tHRead en los incisivos delanteros para mantener la cabeza hacia atrás. Nivel de las patas entre sí para garantizar la tráquea es recta y use cinta de etiquetas para mantener las piernas. Remoje sitio quirúrgico con EtOH 70% y el hisopo. </li><li> Aplicar bupivicaína (0,1 a 0,2 ml de solución al 0,25%) por vía tópica en el sitio de la incisión. </li><li> Nip piel de la garganta con unas pinzas y tirar suavemente hacia afuera. Hacer una pequeña incisión vertical con unas tijeras quirúrgicas. Reducir al mínimo el tamaño de la incisión. </li><li> Preparar una jeringa de 1 ml con 50 l de PBS o el 0,1% OVA en PBS y se inserta en una pipeta repetitiva (Tridak paso a paso, Torrington, CT). Tomar la pipeta en una mano y usar la otra para mantener el tejido de vuelta con las pinzas y exponer la tráquea. </li><li> Sosteniendo la jeringa como paralela a la tráquea como sea posible, insertar la aguja a través de la tráquea pared e inyectar la solución. </li><li> Mantener el ratón en una inyección de la orientación vertical de las siguientes para dar tiempo a la solución para resolver en los pulmones. </li><li> La herida suavemente y cerca estéril área conpinzas y sello con sutura. </li><li> Coloque el ratón el esternón hacia abajo en un cojín de calefacción y permitir su recuperación hasta que esté completamente ambulatoria. Después de la recuperación, devolver el ratón para la instalación de cuidado de los animales y monitorear diariamente para detectar signos de seroma, inflamación o infección, y la dehiscencia de la herida hasta que la herida haya cicatrizado completamente. </li></ol> B. Para Challenge por nebulización <ol><li> Sensibilizar ratones en el día 0 por inyección intraperitoneal de 20 mg de OVA (Sigma-Aldrich) emulsionado en 0,2 ml de PBS estéril que contiene 2 mg de hidróxido de aluminio (Sigma-Aldrich) o con 2 mg de hidróxido de aluminio en 0,2 ml de PBS estéril como control . </li><li> En el día 14, aumentar la sensibilización por inyección ip como se describió anteriormente. </li><li> El día 21, 22 ª, 23 ª, 24 ª y 25 ª después de la sensibilización inicial, los ratones desafío por la exposición durante 30 minutos a la OVA nebulizada al 1% o PBS solo entrega a través de un nebulizador ultrasónico (Buxco de Investigación de Sistemas, Wilmington, Carolina del Norte). </li><li> Los ratones lugar en la cámara principal de WBP; aclimatarlos dentro de la cámara pletismografía por lo menos durante 10 minutos. </li><li> Colocar 1 ml de 0,1% OVA en PBS estéril o PBS estéril solo, como se describe en los pasos 4-6 abajo, a través de un nebulizador. Nebulizar durante 30 min. </li><li> Retire del nebulizador y descartar cualquier solución restante. </li><li> Nebulización puede realizarse en todos los ratones simultáneamente mediante el uso de una cámara de nebulización. </li></ol> II. Determinación de la hiperreactividad bronquial a la metacolina A. no invasiva de medición de la hiperreactividad de la vía aérea mediante pletismografía corporal (WBP; Buxco de Investigación de Sistemas, de Wilmington, Carolina del Norte) <ol><li> Dejar que la botella metacolina en polvo a calentar a temperatura ambiente antes de la apertura (metacolina es muy higroscópico y formar montones inútiles si se permite que absorben agua). Preparar una 200 mg / ml de solución madre en PBS estéril, a continuación, hacer serie 2-diluciones (por ejemplo, 100, 50, 25, 12,5 y 60,25 mg / ml). Mantenga las soluciones de frío. </li><li> Instale el equipo de la siguiente manera: conectar la entrada principal de WBP de nebulizador, el sesgo de flujo de entrada a la bomba de aire, y la salida a la trampa de gas WBP utilizando ajustada tubo de goma. Coloque el transductor de presión para reducir las salidas de las principales cámaras y referencia de la WBP. Conecte el transductor de presión para el preamplificador con los cables suministrados, y conectar a la PC usando preamplificador específico de adquisición de datos de la tarjeta. </li><li> Calibrar el preamplificador utilizando el software de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. </li><li> Los ratones lugar en la cámara principal de WBP; aclimatarlos dentro de la cámara pletismografía por lo menos durante 10 minutos, a continuación, registrar lecturas de referencia (Penhbase) durante 3 min. </li><li> Colocar 1 ml de PBS estéril en el vaso del nebulizador. Nebulizar durante 2 minutos y luego monitorear las variables respiratorias durante 6 minutos durante la fase de secado. Retire del nebulizador y descartar cualquier resto de PBS. </li><li> Colocar 1 ml de 6,25 mg / ml de metacolina en la taza del nebulizador y rEPEAT nebulización durante 2 minutos más un ciclo de seguimiento de 6 min. </li><li> Repita la medición con 12,5, 25, 50 y 100 mg / ml de metacolina, con el mismo período de 2 minutos de la nebulización y la 6-min ciclo de supervisión. </li><li> Retire los ratones de las cámaras y devolverlos a sus jaulas. </li><li> Vuelva a llenar la taza del nebulizador con 1 ml de PBS estéril y ejecutar otra secuencia para limpiar la tubería. </li><li> Apague los flujos de aire, desmontar, y limpie todas las cámaras antes de ejecutar un segundo grupo de animales. </li></ol> B. invasiva de medición de la capacidad de respuesta por la vía aérea controlada por ordenador Ventilador (flexiVent; SCIREQ Inc., Montreal, Canadá) <ol><li> Pesar el ratón y anestesiar por vía intraperitoneal (ip) la inyección de 60 mg por kg de peso corporal de sodio pentobarbital. </li><li> Después de la anestesia adecuada posición, los ratones ventro-dorsal de la traqueostomía. </li><li> Desinfecte la piel del cuello con un 70% de etanol. Aplicar bupivicaína (0,1 a 0,2 ml de solución al 0,25%) por vía tópica en el incision sitio. Una incisión y abrir la piel del cuello. Separe los músculos del cuello y exponer la tráquea. </li><li> Haga un 1 - a 2 mm de incisión en la tráquea con tijeras finas (estar seguro de no cortar la tráquea) e introduzca el tubo traqueal con cautela. Atar una sutura alrededor de la tráquea para evitar una fuga de aire. </li><li> Coloque el ratón en la cámara de pletismógrafo corporal y conectar el tubo que se inserta la tráquea al respirador. </li><li> Iniciar la ventilación mecánica. Establezca la frecuencia respiratoria adecuada y el volumen corriente / carrera (150 golpes por minuto y 200 l, respectivamente, para un ratón de 20 g). Asegúrese de que el tórax se mueve en sincronía con el ventilador. Si el ratón está &quot;luchando&quot; con el respirador (auto-respiración), inyectar más anestesia y esperar a la sincronización. </li><li> Después de las mediciones de referencia, mantener los ratones en la ventilación de referencia para otros 3 minutos, y luego tomar un 2 º conjunto de las mediciones de impedancia. Este 2 º conjunto de mediciones de referencia se utiliza para calcmular los valores basales medias. </li><li> Entregar PBS o metacolina (MM) retos (6,25, 12,5, 25, 50 y 100 mg / ml) por canalizar el flujo inspiratorio del respirador a través de un nebulizador ultrasónico. </li><li> Después de cada reto con MM (6,25, 12,5, 25, 50 y 100 mg / ml), se devolverá el pistón a la entrega de un Vt de 10 ml / kg a 120 respiraciones por minuto y tomar las mediciones de impedancia. </li></ol> III. La medición de la infiltración celular en el espacio aéreo A. Realice el lavado broncoalveolar (LBA) <ol><li> Después de la medición de la AHR, la eutanasia a los ratones con el CO 2, y la posición de cada ratón en su parte posterior en la plataforma quirúrgica. </li><li> Remoje el área con 70% de EtOH. </li><li> Comenzando en la parte inferior del abdomen, corte la cavidad abdominal y remover la piel / superior de los músculos, moviéndose hacia arriba, hacia las costillas. </li><li> Una vez que las costillas son visibles, con unas tijeras cuidadosamente perforar el diafragma. Los pulmones deben colapsar lejos del diafragma. Tenga especial careful de no dañar los pulmones o el corazón. </li><li> Corte la caja torácica para exponer completamente los pulmones o del corazón (evitar cortar cualquier principales vasos sanguíneos para que la sangre se llene el lugar). </li><li> Con una jeringa de 1 ml con una aguja de calibre 27 (BD jeringas, Franklin Lakes, NJ), la punción de los ventrículos del corazón y poco a poco y con cuidado tire hacia atrás de la jeringa para recoger la sangre. Tenga cuidado para evitar el colapso del corazón. </li><li> Recoger el suero de la sangre utilizando este protocolo estándar. Almacenar a -70 ° C hasta su uso. </li><li> Corte y retire la piel y el tejido de la garganta hasta la tráquea se revela. Borrar el tejido suficiente para trabajar con facilidad en el campo (de nuevo, evitar cortar cualquier principales vasos sanguíneos). </li><li> Con unas tijeras curvas, cortados en la tráquea para despejar el camino. </li><li> Pase el punto de un fórceps curvados bajo la tráquea y sujete el extremo de un trozo de hilo de sutura. Tire del hilo de sutura en la tráquea. </li><li> Haga un medio nudo suelto sobre la tráquea, la baja en la garganta. </li><li> CAREFUlly cortar una muesca, un tamaño suficiente para que la cánula, por encima del hilo de sutura. </li><li> Cuidadosamente insertar la cánula en el agujero y abajo de la tráquea más allá del punto del hilo de sutura. Presione suavemente hacia adelante hasta que la cánula sale justo a la entrada a los pulmones (demasiado lejos: pulmones punzantes, demasiado cortos: la tráquea colapso cuando se trata de recuperar BAL). </li><li> Apretar hilo de sutura y el nudo completo para sellar alrededor de la tráquea cánula. </li><li> Bloqueo de la jeringa (que contiene 1 ml de PBS) en la cánula, y presione suavemente el líquido en el pulmón. Lóbulos pulmonares de forma individual debe inflar lentamente. No llene excesivamente. Para un total de ratón cultivadas 0,9-1,0 ml es el máximo absoluto. 0,8 ml puede ser más seguro. Bloqueo de la jeringa a la cánula sin apretar, de lo contrario es probable que cause daños al tratar de desactivar. </li><li> Retirar el líquido de los pulmones. Si se encuentra resistencia (tejido aspirado dentro de la cánula), presione lentamente la cánula más allá en el pulmón y volver a remover. También pruebe a girar la cánula en su lugar. Si todos los ELSe no, retirar la cánula parte del camino, la tráquea es mucho más probable que se hunda en este caso. </li><li> Retire la jeringa de la cánula, el líquido depositado en el contenedor BAL, y repetir 2 veces con solución de PBS fresca. </li><li> Mantenga la solución BAL en hielo hasta centrifugarse. </li><li> Usar el líquido de BAL y el suero para medir la OVA de IgE específica mediante disponible en el mercado del ratón IgE kits de ELISA (Bioproductos MD, St. Paul, MN). </li></ol> B. Contar las células y determinar Diferenciales <ol><li> Centrifugar el líquido de BAL 5 minutos a ~ 600 × g, 4 ° C. </li><li> Resuspender el sedimento celular suavemente en PBS y mantener en hielo. </li><li> Cargar un estándar hemacitómetro Neubauer con la suspensión celular diluida y contar las células. </li><li> Retire las alícuotas de 2 × 10 4 células en 10 a 40 l de volumen de cytospins. Diluir las células, si es necesario. </li><li> Para cytospins, mezcle 2 × 10 4 células, 130 l de PBS y el FBS al 10 l. Agregue la mezcla de célula entera de doubLe citospina embudo y centrifugar 10 min a 700 rpm, utilizando cytoslides dobles para las muestras duplicadas. </li><li> Permitir que los portaobjetos se seque a temperatura ambiente durante 1 h antes de la tinción. </li><li> Mancha de las diapositivas mediante el uso de Diff-Quick mancha (Siemens, Newark, DE). </li></ol> IV. Los resultados representativos Constricción de las vías respiratorias después de estímulos provocadores excesiva es una característica prominente de asma clínica. Se describen dos métodos para la medición de la hiperreactividad bronquial a la metacolina como en ratones OVA-sensibilizado y desafiado: Pletismografía del cuerpo entero (Figura 2) y oscilación forzada utilizando el sistema de flexiVent (Figura 3). Ambos métodos demuestran que la OVA de sensibilización y desafío produce hiperreactividad bronquial en los ratones. Rica en eosinófilos inflamación de las vías es otra característica destacada de tanto clínico del asma y la enfermedad de las vías respiratorias alérgicas en ratones. Como se muestra en la Figura 4 </strong&gt;, OVA de sensibilización y el desafío aumenta considerablemente el número total de células que pueden ser recuperados de las vías respiratorias por el BAL. El número de eosinófilos y, en menor medida, los neutrófilos son especialmente aumentado. La evidencia indica que los resultados de las vías respiratorias alérgicas enfermedades de la sobreproducción de anticuerpos IgE frente a antígenos de sensibilización. La sensibilización y el desafío con OVA utilizando los protocolos que describen aumenta los niveles de IgE en suero y líquido de BAL de ratones tratados (Figura 5). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3771/3771fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema experimentales para OVA inducida por el asma alérgica. Ratones se sensibilizaron dos veces ip con 20 mg de OVA emulsionado en 2 mg de hidróxido de aluminio en 0,2 ml de PBS estéril, o 2 mg de hidróxido de aluminio en 0,2 ml de estéril solo PBS, seguido en el los puntos indicados por el tiempo que desafían con un 0,1% OVA o solución estéril de PBS o por el ex diario<html> POSICION durante 30 minutos a la OVA nebulizado 1% en PBS o PBS solo entrega a través de un nebulizador ultrasónico (Buxco). Veinticuatro horas después de la exposición OVA final, se determinó la capacidad de respuesta las vías respiratorias. Posteriormente, el líquido de BAL, muestras de sangre, células de pulmón, y los tejidos se recogieron para su posterior análisis. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3771/3771fig2.jpg" /> Figura 2. Los ratones de evaluación de la inducida por alergenos hiperreactividad bronquial por un método no invasivo. (N = 4/group) fueron sensibilizados y desafiados con OVA. Veinticuatro horas después del último desafío, la hiperreactividad bronquial a la metacolina inhalada se determinó a través de todo el cuerpo pletismografía como se describe en el protocolo. Penh se determinó y expresó como Penh relación (promedio Penh durante el intervalo de tiempo 8-min con metacolina dividido por el promedio Penh durante el intervalo de 8-min con PBS). *, P &lt;0,05 vs PBS. iles/ftp_upload/3771/3771fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. Los ratones de evaluación de la inducida por alergenos hiperreactividad bronquial por un método no invasivo (oscilación forzada). (N = 4/group) fueron sensibilizados y desafiados con OVA. Veinticuatro horas después del desafío último, hiperreactividad bronquial a concentraciones crecientes de metacolina inhalada se determinó por la oscilación forzada (flexiVent) método descrito en el protocolo. A, B) la vía aérea de resistencia; C) elastancia del pulmón. *, P &lt;0,05 vs PBS. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3771/3771fig4.jpg" /> Figura 4. Recuento de células BAL fluido. Los ratones (n = 4/group) fueron sensibilizados y desafiados con OVA. Veinticuatro horas después del último reto, (Arriba) BAL células se recogieron y se contaron las células totales, como se describe en el protocolo. (Abajo) Cytospin diapositivas fueron pREPARADO y se tiñeron con Diff-Quick. Total = total de células; Eos = eosinófilos; Neu = neutrófilos, macrófagos, Mac = LYM = linfocitos. *, P &lt;0,05 vs PBS. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3771/3771fig5.jpg" /> Figura 5. OVA-IgE específica. Los ratones (n = 4/group) fueron sensibilizados y desafiados con OVA. Veinticuatro horas después del desafío último, la IgE se midió en el líquido de BAL y en el suero de la sangre recogida por punción cardiaca como se describe en el protocolo. *, P &lt;0,05 vs PBS.

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Los experimentos en animales se realizaron de conformidad con las directrices y regulaciones establecidas por el Comité Atlanta VAMC IACUC bajo el protocolo # V010-10.

Los modelos animales de enfermedad de las vías respiratorias alérgicas constituyen instrumentos importantes para los estudios pertinentes para el asma clínica. Una serie de modelos diferentes, que emplean diferentes especies y antígenos, se han desarrollado. El ratón, una especie de laboratorio atractivas y de uso frecuente, también ofrece una serie de ventajas para los modelos de la enfermedad de las vías respiratorias alérgicas. 9,10 Aunque estos modelos no asemejar al asma en todos los aspectos, <s...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del Material </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Ovoalbúmina </td><td> Sigma-Aldrich St. Louis, MO </td><td> A5503 </td><td></td></tr><tr><td> Hidróxido de aluminio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 239186 </td><td></td></tr><tr><td> Acetil-β-methylcholine cloruro de </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A2251 </td><td></td></tr><tr><td> Sal de sodio pentobarbital </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3761 </td><td></td></tr><tr><td> Pletismografía de cuerpo entero (WBP) del sistema </td><td> Buxco de Investigación de Sistemas Wilmington, Carolina del Norte </td><td></td><td> <a href="http://www.buxco.com" target="_blank">http://www.buxco.com</a> </td></tr><tr><td> FlexiVent </td><td>SCIREQ, Inc. Montreal, Canadá </td><td></td><td> <a href="http://www.scireq.com" target="_blank">http://www.scireq.com</a> </td></tr><tr><td> Microscopio de luz </td><td> Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cytospin 4 </td><td> Thermo Scientific Asheville, Carolina del Norte </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Diff-Quick mancha </td><td> Siemens Newark, DE </td><td> B4132-1A </td><td></td></tr><tr><td> Pipeta repetitiva </td><td> Tridak Torrington, CT </td><td> STP4001-0025 </td><td></td></tr></tbody></table>

murine model of allergen induced asthma

El asma es una causa importante de morbilidad y mortalidad, que afecta a unos 300 millones de personas en todo el mundo. 1 Más de un 8% de la población de EE.UU. tiene asma, con la creciente prevalencia. 2 Al igual que con otras enfermedades, los modelos animales de enfermedad de las vías respiratorias alérgicas facilitan en gran medida comprensión de la fisiopatología subyacente, ayudan a identificar posibles dianas terapéuticas, y permitir que las pruebas preclínicas de posibles nuevas terapias. Los modelos de la enfermedad de las vías respiratorias alérgicas se han desarrollado en varias especies animales, pero los modelos murinos son particularmente atractivas debido al bajo costo, disponibilidad, y bien caracterizados sistema inmunológico de estos animales. 3 Disponibilidad de una gran variedad de cepas transgénicas aumenta aún más el atractivo de estos modelos. 4 A continuación se describen dos modelos murinos de enfermedad de las vías respiratorias alérgicas, tanto en el empleo de la ovoalbúmina como antígeno. Después de sensibilización inicial por inyección intraperitoneal, un modelo Delivres la exposición al antígeno por nebulización, el otro por la entrega intratraqueal. Estos dos modelos ofrecen ventajas complementarias, con cada imitando las características principales de asma humano. 5 Las principales características de asma aguda incluyen una respuesta exagerada a los estímulos vía aérea, tales como la metacolina (hiperreactividad de las vías respiratorias; AHR) y eosinófilos rica inflamación de las vías. Estos son también efectos importantes de la exposición al alérgeno en los modelos murinos, 5,6, y se describen las técnicas para su medición y por lo tanto la evaluación de los efectos de la manipulación experimental. En concreto, se describen ambos invasivos y no invasivos 7-8 técnicas para la medición de la hiperreactividad de las vías respiratorias, así como los métodos para evaluar la infiltración de células inflamatorias en las vías respiratorias y el pulmón. Las vías respiratorias células inflamatorias son recogidos por lavado broncoalveolar, mientras que la histopatología de pulmón se utiliza para evaluar los marcadores de inflamación en todo el órgano. Estostécnicas proporcionan herramientas poderosas para el estudio del asma en formas que no serían posibles en los seres humanos.

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Murine Model of Allergen Induced Asthma

Los modelos experimentales de ratón de asma alérgica ofrecen nuevas posibilidades para el estudio de patogénesis de la enfermedad y el desarrollo de nuevas terapias. Estos modelos se adaptan bien a los factores de medición que regulan la respuesta inmune alérgica, inflamación de las vías, y la fisiopatología pulmonar.

Modelo murino de asma inducida por alergenos

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, ...

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40.0K vistas.  Emory University and Atlanta VA Medical Center. Los modelos experimentales de ratón de asma alérgica ofrecen nuevas posibilidades para el estudio de patogénesis de la enfermedad y el desarrollo de nuevas terapias. Estos modelos se adaptan bien a los factores de medición que regulan la respuesta inmune alérgica, inflamación de las vías, y la fisiopatología pulmonar.

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Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

Modelo murino de CD40-activación de las células B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Investigación

Inmunología e Infección

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

Pseudomonas aeruginosa inducida por la lesión pulmonar Modelo

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

Un modelo murino de Grupo B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Colonización vaginal

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in diameter. In addition to a characterization of forward and sideward scatter properties, it enables the use of fluorescent labeled markers like antibodies to detect respective structures. Using indirect antibody staining, flow cytometry is employed here to quantify birch pollen allergen (precisely Bet v 1)-loaded particles of 0.5 to 10 &#181;m in diameter in inhalable particulate matter (PM10, particle size &#8804;10 &#181;m in diameter). PM10 particles may act as carriers of adsorbed allergens possibly transporting them to the lower respiratory tract, where they could trigger allergic reactions.
So far the allergen content of PM10 has been studied by means of enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) and scanning electron microscopy. ELISA measures the dissolved and not the particle-bound allergen. Compared to scanning electron microscopy, which can visualize allergen-loaded particles, flow cytometry may additionally quantify them. As allergen content of ambient air can deviate from birch pollen count, allergic symptoms might perhaps correlate better with allergen exposure than with pollen count. In conjunction with clinical data, the presented method offers the opportunity to test in future experiments whether allergic reactions to birch pollen antigens are associated with the Bet v 1 allergen content of PM10 particles &#62;0.5 &#181;m.

Here, we present a protocol to quantify allergen-loaded particles by flow cytometry. Ambient particulate matter particles may act as carriers of adsorbed allergens. We show here that flow cytometry, a method widely used to characterize suspended solids &#62;0.5 &#181;m in diameter, can be used to measure these allergen-loaded particles.

Análisis de citometría de flujo de partículas unida a Bet v 1 de alérgenos en el MP10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro by activating them in the presence of the polarizing cytokines IL-1&#946;, IL-6, IL-23, and TGF&#946;. Th17 cells orchestrate immunity against extracellular bacteria and fungi, but their aberrant activity has also been associated with several autoimmune and inflammatory diseases. Th17 cells are identified by the chemokine receptor CCR6 and defined by their master transcription factor, ROR&#947;t, and characteristic effector cytokine, IL-17A. Optimized culture conditions for Th17 cell differentiation facilitate mechanistic studies of human T cell biology in a controlled environment. They also provide a setting for studying the importance of specific genes and gene expression programs through RNA interference or the introduction of microRNA (miRNA) mimics or inhibitors. This protocol provides an easy to use, reproducible, and highly efficient method for transient transfection of differentiating primary human Th17 cells with small RNAs using a next generation electroporation device.

Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.

Small RNA Transfección en células primarias Th17 humano por Next Generation electroporación

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the analysis of immune mediators in fluid eluates for the study of the airway topical immune signature, without the need for stimulation procedures (often used by other techniques). The mucosal lining fluid is sampled on a strip of filter paper placed at the anterior part of the inferior turbinate and left for 2 min of absorption. Analytes are eluted from the filter papers, and the extracted protein-based eluates are analyzed by an electrochemiluminescence-based immunoassay, allowing for the high-sensitivity quantification of low- and high-level analytes in the same sample. We measured the in vivo levels of 20 preselected immune mediators related to specific immune signaling pathways in the upper airway mucosa, but the technique is not limited to that specific panel or sampling site. The technique was first implemented in 7-year-old children from the Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) cohort with allergic rhinitis. It was thereafter used in the longitudinal COPSAC2010 birth cohort, sampled at 1 month, 2 years, and 6 years of age and at instances of acute respiratory symptoms. We successfully obtained and analyzed samples from 620 (89%) of 700 1-month-old children; a few samples were below the assay detection limit (reported as the median (Inter-Quartile Range (IQR)). The number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the set point for the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5). This technique enables the quantification of the in vivo airway mucosal immune profile from birth, can be applied longitudinally, and can be applied to studies on the effect of genetics and early-life environmental exposures, pathophysiology, endotyping, and monitoring of respiratory diseases, and development and evaluation of novel therapeutics.

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes a noninvasive technique for the sampling of undisturbed mucosal lining fluid from the upper airways. It can be used to perform the quantification of in vivo levels of protein mediators, such as cytokines and chemokines, in subjects of all ages.

Muestreo no invasivo de revestimiento mucoso líquido para la cuantificación In Vivo de la vía aérea superior mediador inmune niveles

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, MZBs must migrate up the shear force of blood flow. We present here a method for analyzing this flow-induced MZB migration in vitro. First, MZBs are isolated from the mouse spleen. Second, MZBs are settled on integrin ligands in flow chamber slides, exposed to shear flow, and imaged under a microscope while migrating. Third, images of the migrating MZBs are processed using the MTrack2 automatic cell tracking plugin for ImageJ, and the resulting cell tracks are quantified using the Ibidi chemotaxis tool. The migration data reveal how fast the cells move, how often they change direction, whether the shear flow vector affects their migration direction, and which integrin ligands are involved. Although we use MZBs, the method can easily be adapted for analyzing migration of any leukocyte that responds to the force of shear flow.

Marginal zone B cells (MZBs) respond to the force of shear flow by re-orienting their migration path up the flow. This protocol shows how to record and analyze the migration using a fluidics unit, pump, microscope imaging system, and free software.

Análisis de cortante inducida por el flujo de migración de las células B de zona Marginal de Murine In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

A Murine Model of Dengue Virus-induced Acute Viral Encephalitis-like Disease

Dengue virus (DENV), an arthropod-borne virus transmitted by mosquitoes, may cause the severe disease known as dengue hemorrhagic fever, which is characterized by lethal complications due to plasma leakage, ascites, pleural effusion, respiratory distress, severe bleeding, and organ impairment. A few cases of DENV infection present neurological manifestations; however, studies have not explored DENV-induced neuropathogenesis further. In this study, we present a protocol to use an immunocompetent outbred ICR (Institute of Cancer Research) mouse for investigating the induction of central nervous system (CNS) infection with DENV, followed by the progression of acute viral encephalitis-like disease.

Here, we present a protocol for creating an immunocompetent ICR (Institute of Cancer Research) murine model of central nervous system infection to display the development of neuropathy. Monitoring acute viral encephalitic disorders by identical disease scores could be performed for showing dengue virus-induced neuropathy in vivo.

Un modelo murino de enfermedad similar a la encefalitis vírica aguda inducida por el virus del dengue

Dengue virus (DENV), an arthropod-borne virus transmitted by mosquitoes, may cause the severe disease known as dengue hemorrhagic fever, which is ...

Robust Ligature-Induced Model of Murine Periodontitis for the Evaluation of Oral Neutrophils

The main advantages of studying the pathophysiology of periodontal disease utilizing murine models are the reduced cost of animals, array of genetically modified strains, the vast number of analyses that can be performed on harvested soft and hard tissues. However, many of these systems are subject to procedural criticisms. As an alternative, the ligature-induced model of periodontal disease, driven by the localized development and retention of a dysbiotic oral microbiome, can be employed, which is rapidly induced and relatively reliable. Unfortunately, the variants of ligature-induced murine periodontitis protocol are isolated to focal regions of the periodontium and subject to premature avulsion of the installed ligature. This minimizes the amount of tissue available for subsequent analyses and increases the number of animals required for study. This protocol describes the precise manipulations required to place extended molar ligatures with improved retention and usage of a novel rinse technique to recover oral neutrophils in mice with an alternative approach that mitigates the aforementioned technical challenges.

This article presents a protocol for establishing a ligature-induced model of murine periodontitis involving multiple maxillary molars, resulting in larger areas of the involved gingival tissue and bone for subsequent analysis as well as reduced animal usage. A technique to assess oral neutrophils in a manner analogous to human subjects is also described.

Modelo robusto inducido por la ligatura de la periodontitis murina para la evaluación de los neutrófilos orales

The main advantages of studying the pathophysiology of periodontal disease utilizing murine models are the reduced cost of animals, array of genetically ...

Systematic Scoring Analysis for Intestinal Inflammation in a Murine Dextran Sodium Sulfate-Induced Colitis Model

Murine colitis models are tools that are extensively employed in studies focused on understanding the pathobiology of inflammatory intestinal disorders. However, robust standards for objective and reproducible quantification of disease severity remain to be defined. Most colitis analysis methods rely on limited histological scoring of small segments of intestine, leading to partial or biased analyses. Here, we combine high-resolution image acquisition and longitudinal analysis of the entire colon to quantify intestinal injury and ulceration in the dextran sodium sulfate (DSS) induced model of murine colitis. This protocol allows for the generation of objective and reproducible results without extensive user training. Here, we provide comprehensive details on sample preparation and image analysis using examples of data from DSS induced colitis. This method can be easily adapted to other models of murine colitis that have significant inflammation associated with mucosal injury. We demonstrate that the fraction of inflamed/injured and eroded/ulcerated mucosa relative to the complete length of the colon closely parallels clinical findings such as weight loss amid DSS-induced disease progression. This histological protocol provides a reliable time and cost-effective aid to standardize analyses of disease activity in an unbiased way in DSS colitis experiments.

Systematic scoring of intestinal inflammation using a free computer-assisted system is a powerful tool to quantitatively compare histopathological changes in colitis models characterized by the presence of ulcers and inflammatory changes. Histological colitis score evaluation strengthens clinical observations and facilitates data interpretation.

Análisis sistemático de puntuación para la inflamación intestinal en un modelo de colitis inducida por sulfato de sodio de dextrano de murina

Murine colitis models are tools that are extensively employed in studies focused on understanding the pathobiology of inflammatory intestinal disorders. ...