저자는이 프로젝트의 핵심 및 기술 지원을 제공하는 동물 용 의약품의 VA-MD 지역 대학 감사합니다. 이 작품은 NIH 경력 개발 상 (K01DK092355)에 의해 지원된다.

모든 연구는 버지니아 공대의 기관 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인하에 및 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 국립 연구소에 따라 수행 하였다. 1. 구인두 관리를 사용하여 LPS의 기관 내 (IT) 예방 접종 <ol><li> 각 동물의 고유 귀 펀치, 귀 태그, 또는 다른 제도적으로 승인 된 방법 중 하나를 사용하여 식별되어 있는지 확인합니다. </li><li> 기준 체중과 각각의 동물에 대한 몸의 온도를 기록한다. </li><li> LPS의 작업 주식을 준비합니다. 각 마우스 1X 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) 1 ㎎ / ㎏ LPS의 50 μL의 복용량을 받게됩니다. 모의 치료 동물은 1X PBS의 50 μl의 선량을 받게됩니다. </li><li> 다음 드롭 방법을 사용하여 이소 플루 란을 투여에 적합한 실을 준비합니다. 기관 지침으로 시작할 수있는 이소 플루 란과 다른 마취제와 이전의 사용에 관한 다양어떤 연구를 보내고, 사람은 모든 지침을 적절하게 충족 보장하기 위해 동물 보호 / 복지의 자신의 기관의 부서에 문의해야합니다. 드롭 방법 이소 플루 란이 옵션을 선택하지 않으면, 다른 마취제는 대체가 있습니다. <ol><li> 적절한 안전 캐비닛에, 500 ㎖ 비커의 바닥에 접혀 흡수 종이 타월과 장소에 이소 플루 란의 약 3 ㎖를 적용합니다. </li><li> 종이 타월 위에 알루미늄 호일의 작은 조각을 놓고 투명 뚜껑이있는 비이커를 포함한다. </li></ol></li><li> 그것은 접종시 활용 될 도구와 시약을 준비합니다. 동물 삽관 스탠드에 머리를 확보 고무 밴드를 배치합니다. 이 절차는 직선 포셉 한 쌍의 각도 또는 곡선 포셉 한 쌍의와 팁 P200 피펫을 필요로 할 것이다. </li><li> 삽관 스탠드 옆에 쉽게 액세스 할 수있는 위치에있는 피펫 팁과 장소에 부하 LPS의 50 μl를. </li><li> 마우스를 마취이소 플루 란 챔버에 동물을 배치하고 투광성 덮개와 챔버를 덮는 따라. 첫 번째 챔버에 배치 할 때 신속하고 얕은 될, 동물의 호흡 패턴을 관찰한다. 호흡 속도는 일반적으로 챔버에 배치하는 30 초 이내에 도달 한 호흡 / 2 초를 접근 할 때 동물이 충분히 마취됩니다. 드롭 방법 이소 플루 란을 사용하여 승인 된 동물 프로토콜에 명시된 바와 같이 마우스를 마취해야합니다. </li><li> 챔버에서 마취 된 쥐를 제거하고 그 앞니 대기 삽관에 동물을 일시 중지합니다. 동물이 안전하게 억제하고 입과 혀에 액세스 할 수있는 것을 확실히한다. </li><li> 부드럽게 직선 집게로 혀를 고정합니다. 각진 집게로 혀를 잡고 약간의 저항이 느껴질 때까지 부드럽게 입에서 빼냅니다. 이 조치는 후두개 블록 및 기관지에 액세스하기에 충분하다. </li><li> 에 혀를 잡고 계속하면서확장 된 위치는 목의 뒷면에 LPS의 50 μL 용량을 관리하고 즉시 장갑을 낀 손가락으로 동물의 콧 구멍을 커버합니다. 마우스를 흡입 할 때까지 LPS는 목구멍의 뒤쪽에서 볼 수 있습니다. </li><li> 콧 구멍을 커버 5-10 추가 호흡 연장 혀를 계속 누르고 있습니다. </li><li> 삽관 대에서 마우스를 제거하고 마취에서 회복 될 때까지 새 케이지에 동물을 배치합니다. </li><li> 질병의 진행과 관련된 대리 마커를 모니터링합니다. 체중과 체온은 연구 기간 동안 매 4-8 시간 감시되어야한다. 마찬가지로, 행동 특성 및 사망률 증가와 관련된 임상 증상을 평가. </li><li> LPS에 노출 다음과 같은 특정 시간 지점에서 질병의 진행, 수확 마우스를 평가합니다. LPS 노출 다음 수확에 대한 일반적인 시간 포인트는 0, 6, 12, 18, 24, 및 48 시간이 (가) 있습니다. 회복과 생존을 평가하기 위해, 7 다의 쥐를 평가YS 후 접종. </li></ol> 2. 혈청 및 기관지 세척 유체 (BALF) 컬렉션 <ol><li> 제도적으로 승인 된 방법을 사용하여 마우스를 희생. </li><li> 그 뒷면에 동물을 배치하고 높이 (1.27 cm)에 이상적으로 0.5, 부검 보드에 고정합니다. </li><li> 70 % 에탄올로 전체 마우스를 적셨다. </li><li> 27 G 바늘로 1 ML의 주사기를 사용하여 이전의 어떤 절개를 만들기 위해 심장 천자를 실시하고 있습니다. 그것은 하나의 마우스에서 전체 혈액의 500 ~ 800 μl를 철회 할 수 있어야한다. </li><li> 주사기에서 바늘을 제거하고 prelabeled 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 전체 혈액을 전송합니다. 혈청 수집을 위해 전체 혈액은 실온에서 적어도 30 분 동안 응고 할 수 있습니다. 혈청 컬렉션에 더하여,이 절차는 또한 이전에 면역 세포를 순환 공부, 전혈을 수집하는 관과 주사기로 항응고제를 통합함으로써 수정 될 수있다. </li><li> 수평 절개를합니다마우스의 아래턱에 복강의 길이 및 복강으로부터 수직 절개를 건너. </li><li> 집게를 사용하여 절개의 양면을 잡고 가볍게 멀리 내부 복막 및​​ 흉부 캐비티로부터 피부를 당겨. </li><li> 다이어프램을 절단하지 않도록주의하면서, 성기에서 흉골에 복강의 길이를 따라 큰 절개를합니다. 부드럽게 신장 중 하나에 대한 액세스를 허용하도록 복강 창자 시프트. </li><li> 관류에 대한 배수 지점 역할을하는 신장으로 이어지는 신장 정맥을 잘라. </li><li> 닉 다이어프램은, 가위를 사용하여 심장의 좌측을 노출, 폐 및 심장을 피하도록주의하면서. </li><li> 수동으로 27 G 바늘과 1X PBS 용액 10 ㎖ 주사기를 사용하여 마음을 perfuse. 식염수가 폐에 강제되지 않도록 재관류시 무리한 힘을 가하지 마십시오. 남아있는 혈액이 포털 정맥 절개로부터 배출한다.</li><li> 조심스럽게 심장과 폐를 절단되지 않도록주의하면서, 무딘 / 무딘 가위를 사용 흉골을 따라 갈비뼈를 잘라. 실수로이 절차를 수행하는 동안 폐를 절단하는 것은 상당히 수집 BALF의 양을 줄일 수 있고 제대로 정착과 폐를 팽창 할 수없는 결과를 초래할 것입니다. </li><li> 부드럽게 마음과 멀리 집게를 이용하여 흉곽에서 폐를 분리. 조심스럽게 가능한 한 척추에 가까운 무딘 / 무딘 가위를 이용하여 흉곽의 각 부분을 잘라 완전히 두 섹션을 제거합니다. </li><li> 집게를 사용하여 침샘을 분리하거나 가위를 사용하여 제거, 기관을 노출. </li><li> 조심스럽게 가위를 사용하여기도를 오버레이 근육을 잘라. 이 기관은이 과정에서 절단하지 않는 것이 중요합니다. </li><li> 가위를 사용하여 기관을 덮는 쇄골을 구분합니다. </li><li> 부드럽게 집게를 사용하여 흉선을 단단히 잡고 마음에서 조직을 올립니다. 에주의하면서, 가위를 사용 흉선을 제거심장이나 폐를 절단하지 마십시오. </li><li> 1-2 링 각도 가위 (45 ~ 90 º 각도, 샤프 / 샤프)를 사용하여 후두 아래의 기관에있는 작은 수평 절개를합니다. 절개 단단히 정맥을 확보 할 수있을만큼 충분히 커야합니다. </li><li> 테이퍼 끝이 절개 아래에 2 ~ 3 기관 반지를 나오도록 캐뉼라를 삽입하고 실크 봉합사를 사용하는 곳에서 정맥을 확보. 봉합은 기관과 식도 사이를 통과하고, 정맥에 꽉 뽑아되어 있는지 확인합니다. </li><li> 행크스 버퍼 식염수 (HBSS) 1 ㎖에 1 ML의 주사기를 입력하고 조심스럽게 캐 뉼러에의 루어를 삽입합니다. </li><li> 천천히, 그러나 지속적인 운동을 사용하여 폐를 팽창, 기관에 ~ 900 μl를 주입, 즉시 HBSS를 철회. 15 ML 원뿔 관에 복구 BALF를 놓습니다. </li><li> 미래 분석 BALF 약 3 ㎖를 수집하기 위해 세척을 2 회 추가를 반복합니다. 사용 준비가 될 때까지 얼음에 4 º C에서 BALF를 저장합니다. </li></ol><ol><li> 폐의 팽창 대에 10 ML의 주사기를 삽입합니다. 루어, 코크에 루어, 주사기로 꼭지에 호스를 조립합니다. 마개가 닫힌 위치에 있는지 확인합니다. 10 ML의 주사기는 중력 흐름 저수지 역할을합니다. 저수지는 동물의 위의에 4.75을 서서 저수지의 상단이 동물의 위 10.5을 확장해야합니다 인플레이션에 연결해야합니다. </li><li> 중성 포르말린 용액을 주사기를 채우십시오. 주사기가 완전히 정착 가득되어 있는지 확인합니다. </li><li> 튜브의 개방 단부에서 흡수 수건을 놓고 정착이 튜브를 채울 수 있도록 꼭지를 엽니 다. 정착이 튜브에서 흐르는 시작되면, 즉시 마개를 닫고 정착과 상단에 주사기를 리필. 이것은 주사기 완전히 폐 인플레이션 압력의 적절한 양을 제공하기 위해 충전하는 것이 중요하다. </li><li&gt; 부드럽게 약 1 ~ 2 기관 반지 정맥의 끝 아​​래, 기관에서 봉합 실의 두 번째 조각을 전달합니다. </li><li> 봉합에 하나의 느슨한 매듭을 짓고; 그러나, 매듭 꽉 잡아 당기지 마십시오. </li><li> 정맥에 서 마우스 인플레이션 튜브를 삽입합니다. </li><li> 마개를 열고 폐 중력 인플레이션을 작성 할 수 있습니다. </li><li> 폐는 자신의 최대 인플레이션 수준에 도달하면, 봉합 꽉 끌어와 두 번째 매듭을 짓고. </li><li> 마개를 닫고 정맥에서 튜브를 제거합니다. </li><li> Gently 포셉 한 쌍 봉합사을 잡고 손가락 캐뉼라 잡고 기관에서 캐뉼라 제거합니다. 단단히 흉강 다시 마우스의 코쪽으로 정맥을 향해 아래로 봉합을 당깁니다. </li><li> 부드럽게 집게로 기관 또는 봉합을 단단히 잡고 목 공동의기도를 올립니다. </li><li> 무딘 가위를 사용하여 연결 봉합에 기관의 꼬리를 절단. </li><li> 일단 trache이 기본 조직에서 무료로, 마우스에서 멀리 기관을 끌어 시작합니다. 부드럽게 흉강 중 폐를 들어 올립니다. </li><li> 조심스럽게 흉강에 폐를 유지하는 결합 조직을 잘라. 멀리 마우스의 몸에서기도를 당겨 계속 기본 연결을 절단하면서 꾸준히 상향 력을 적용합니다. 폐를 절단하지 않도록주의하십시오. 심장이 왼쪽으로이 방법을 사용하여 폐에 연결해야합니다. </li><li> 폐를 제거하고 나면, 포르말린 10 ㎖에 배치합니다. </li><li> 유전자형에 대한 마우스의 꼬리 부분을 제거합니다. </li><li> 해당 기관의 지침에 따라 마우스의 시체를 폐기하십시오. </li></ol> 4. 사이토 카인의 평가 <ol><li> 혈청을 분리하기 위해 5 분 동안 12,000 XG에서 2.5 단계에서 수집 된 전혈을 원심 분리기. -80 ° C에서 prelabeled 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브 및 저장소에 혈청을 전송 </li><li> 오는 평가ELISA 또는 다른 유사한 분석에 의해 m 사이토 카인 수준. 혈청 1:5 희석 - 다음, 분석에 따라 적절한 희석 버퍼에 1:20 지침을 제조하고 있습니다. 이러한 희석은 실험적으로 이전 샘플의 부피를 실행으로 결정되어야한다. </li><li> 때문에 수집 된 혈청의 낮은 볼륨으로, 반으로 ELISA 플레이트에 장착 된 샘플 볼륨을 줄일 수 있습니다. 예를 들어, 대부분의 상업적 ELISAs는 표준 및 샘플을 100 μL 부피를 이용한다. 표본 표준 부하 50 μl를 희석 혈청을 절약마다 잘합니다. </li><li> 원심 분리기 5 분 200 XG에 냉장 테이블 탑 원심 분리기에서 BALF. 두 가지로 세포 상등액을 전송 -80 ° C에서 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브 및 저장소를 prelabeled </li><li> 희석하지 않고 ELISA 또는 다른 유사한 분석에 의해 BALF 사이토 카인을 평가합니다. </li><li> C. ° -80에서 보관되지 않은 혈청 및 BALF </li></ol> 5. 차동 염색 및 BAL 세포질 평가 <ol><li> BALF 원심 HBSS하고 완전한 제거에 따라, 저장성 염수를 사용하여 펠렛 화 적혈구를 용해. 증류수 900 μL에 세포를 재현 탁. 즉시 배 PBS 100 μl를 추가합니다. </li><li> 개별적으로 각각의 샘플을 용해. 샘플은 적혈구의 과도한 양을 포함하는 경우, 세포를 5 분 및 적혈구 세포 용해 프로토콜이 반복 될 수있다 400 XG에서 테이블 탑 원심 분리기에서 펠렛 화 될 수있다. </li><li> 트리 판 블루 염색과 10X 20 X 배율에서 hemacytometer를 사용하여 1 ㎖ 서스펜션 총 BALF의 세포질을 결정합니다. 평가 및 세포 / ml로 이러한 데이터를 제공. </li><li> cytospin 및 차등 염색 재료를 준비합니다. 연필이나 용매 저항하는 펜을 사용하여 표준 현미경 슬라이드 레이블을 지정합니다. cytospin 브래킷 및 깔때기에 슬라이드를 고정합니다. cytospin의 회 전자에 슬라이드 어셈블리를 고정합니다. </li><li> 5 분 100 XG에 BALF의 Cytospin 150 μL. 세포 밀도 효과적으로 너무 크면, 세포 형태를 평가 슬라이드에 스핀 다운 볼륨을 줄일 수 있습니다. 슬라이드 밤새 건조 공기를 허용합니다. </li><li> 차등 제조 프로토콜 다음 슬라이드를 얼룩. 슬라이드 밤새 건조 공기를 허용합니다. 글라스를 덮고 퍼 마운트로 봉입을 사용하여 슬라이드를 커버 슬립하고 20X 및 40X 대물 탑재 현미경을 사용하여 슬라이드를 평가한다. </li><li> 그러한 FACS, 전자 현미경, 공 초점 현미경, 유전자 발현의 평가를 위해 RNA 추출 및 / 또는 웨스턴 블롯에 대한 단백질 추출 등의 후속 분석을 위해 남아있는 세포를 수확. </li></ol> 6. 조직 병리학의 평가 <ol><li> 조직 병리학 평가를위한 폐를 준비합니다. 포르말린 고정의 24-48 시간 후, 배쪽으로 전체 비정상적으로 폐의 방향과 파라핀. 메인 전도기도를 노출하는 결과 블록을 잘라. </li><li> 채점의 정확도를 개선하기 위해, 동일한 위치에있는 폐 위치 및 t의 최대 길이 시각화를 수득 각 블록 트림그는 주요 축기도를 폐내. 이 시점에서, 5 미크론 시리얼 섹션과 헤 마톡 실린과 에오신 (H &amp; E)와 얼룩을 잘라. 추가 부분은 잘라 표준 프로토콜을 사용하여 현장 하이브리드 화에 대한 제조 할 수있다. </li><li> 0 (결석) 및 3 (중증) 사이에 득점하는 다음과 같은 염증 매개 변수에 기초하여 반 정량적 평가 시스템 사용 조직 병리를 평가 : 단핵구와 다형 핵 세포 침윤; 상피 세포의 증식과 부​​상을기도; 넘쳐; 혈관 주위와 peribroncheolar 바지를 접; 염증과 관련된 폐의 비율. 폐 조직 병리는 경험 병리학 자에 의해 평가되어야한다. </li><li> 총 조직 병리학 점수를 생성하거나 질병의 진행의 특정 측면을 정량화 개별 점수를 사용하는 매개 변수의 점수 모두 평균. 유전자형과 치료에 모두 눈을 멀게 검토와 함께, 이중 맹검 방식으로 모든 채점을 실시한다. 이 채점 시스템은 previousl왔다Y는 6,7,10을 설명했다. </li></ol>

<ol>
	<li>Matute-Bello, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+official+American+Thoracic+Society+workshop+report:+features+and+measurements+of+experimental+acute+lung+injury+in+animals.">An official American Thoracic Society workshop report: features and measurements of experimental acute lung injury in animals.</a> Am. J. respir. Cell Mol. Biol. 44, 725-738 (2011).</li><li>Egger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+bleomycin+via+the+oropharyngeal+aspiration+route+leads+to+sustained+lung+fibrosis+in+mice+and+rats+as+quantified+by+UTE-MRI+and+histology.">Administration of bleomycin via the oropharyngeal aspiration route leads to sustained lung fibrosis in mice and rats as quantified by UTE-MRI and histology.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Rayamajhi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonsurgical+intratracheal+instillation+of+mice+with+analysis+of+lungs+and+lung+draining+lymph+nodes+by+flow+cytometry.">Nonsurgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Revelli, D. 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저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

다음과 같이 성공적으로 마우스의 폐에서 호스트 면역 반응을 평가하기위한 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 1) 평가중인 모델에 대한 적절한 마우스 긴장과 섹스를 선택; 2) 폐에 PAMP 전달을 최적화; 3) 제대로 수집하고 BALF를 처리; 4) 제대로 해결 및 조직 병리학 적 평가를위한 폐의 준비. 마우스 균주의 선택은 숙주의 면역 반응을 평가하는 중요한 요소이다. C57BL / 6 마?...

병원성 박테리아 종과 관련된 폐 감염은 글로벌 병적 상태와 사망률의 흔한 원인이다. 이들 병원균에 대한 숙주 면역 반응을 구동 메커니즘을 결정하는 것은 이러한 감염의 영향을 약하게 할 신규 예방 전략 및 치료제의 개발을 촉진 할 것이다. 여기에 설명 된 프로토콜의 전반적인 목표는 생균에 대한 대리 병원체 관련 분자 패턴 (PAMP)를 사용하여 병원균 감염에 대한 숙주 선천성 면역 반응을 평가하기 위해 유연한 방식으로 사용자에게 제공하는 것이다. 박테리아 숙주 선천성 면역 반응을 평가하기 이전 연구의 대부분은 의한 실행의 상대적 용이성 복막 모델에 초점을 맞추고있다. 이 모델은 매우 유용하고 호스트 병원체 상호 작용과 전신 염증의 분야에서 상당한 발전시킬 수도 있지만,이 모델에서 생성 된 데이터는 항상 연구에 적합하지 involvi호흡기를 겨. 여기서, 급성 폐 염증의 폐 모델은 고전 복강 내 (IP) 주입 모델과 실제 임상 적으로 관련된 확장으로서 제안되어있다. 제안 된 기술은 특정 장기 모델 시스템에서의 선천성 면역 반응의 평가를 위해 로컬 허용한다. 여기서 설명한 방법은 사용자가 공통 PAMP이다 LPS에 숙주 면역 반응을 평가할 수있는 간단하고 강력한 기술을 제공하도록 설계된다. 방법은 기관 내 마우스 및 호흡기 질환 및 급성 폐 손상 1에서 고통받는 인간의 환자에서 관찰되는 병리 생리 학적 기능의 많은 모방의 폐에 강력한 선천성 면역 반응을 유도 LPS의 (IT) 점안을 기반으로합니다. 이 기술의 주요 장점은 사용자가 생체 내 연구에서 수행과 관련된 교란 변수 및 안전 우려없이 숙주 면역 반응을 평가할 수 있다는 것이다살아있는 박테리아를 사용하여. 마찬가지로,이 프로토콜에 설명 된 노출의 인두 IT 관리 경로 관리 (의) 비강 수술 IT 관리 등 다른 일반적으로 사용 기술에 비해 상당한 장점이 있습니다. 예를 들어, 인두 IT 관리는 일반적으로 인해 비강에있는 에이전트의 손실로 폐 증착의 변동성이 증가 시달리고 2-4 부비동 관리,의에 비해 상대적으로 정확한 dosaging과 폐 증착 할 수 있습니다. 그것의 투여 경로는 이러한 충치를 우회하고 기관과기도에 직접 액세스 할 수 있습니다. 마찬가지로, 수술의 IT 접근 방식은 훨씬 더 병적 관리 방법 및 마스터에 광범위한 교육이 필요합니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 또한 일반적인 기술 및 염증의 진행을 평가하고 LU를 제조하는데 적절한 기술을 설명하는 프로토콜을 종료하는 데 사용되는 대리 마커 설명을 포함조직 병리학 평가를위한 NGS. 이러한 프로토콜은 각각의 동물에서 생성 된 데이터를 최대화함으로써 각각의 연구에 필요한 생쥐의 수를 최소화하는 데 초점을 맞추고있다. 설명하는 프로토콜은 매우 유연하고 쉽게 다양한 범위의 PAMPS 손상 관련 분자 패턴 (감쇠)을 평가하기 위해 수정 될 수 있습니다. 또한, 몇 가지 추가 수정,이 프로토콜은 또한 알레르기 성기도 질환의 진행 또는 살아있는 박테리아, 바이러스 또는 곰팡이 5-10와 호스트 병원체 상호 작용을 평가하는 연구에 적용될 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="596">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:269px;">C57Bl/6J</td>
			<td style="width:181px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:147px;">Stock 000664</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:269px;">Compact Scale</td>
			<td style="width:181px;">Ohaus Scale Corporation</td>
			<td style="width:147px;">71142845</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Small Animal Rectal Thermometer</td>
			<td style="width:181px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:147px;">TH 5</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Rectal Probe for Rodents</td>
			<td style="width:181px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:147px;">RET 3</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Ear Punch</td>
			<td style="width:181px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:147px;">EP-S 901</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4</td>
			<td style="width:181px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:147px;">LPS-EB</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">1x Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:181px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">10010-023</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:181px;">Baxter</td>
			<td style="width:147px;">40032609</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand</td>
			<td style="width:181px;">ICAP Manufacturing</td>
			<td style="width:147px;">n/a</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Rodent Intubation Stand</td>
			<td style="width:181px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:147px;">RIS 100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scissors (blunt/sharp)</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">13-806-2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">forceps (straight)</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>22-327-379</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">forceps (45&#186;, curved)</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10-275</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scissors (blunt/blunt)</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>08-940</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Pipette (200 &#181;l Capacity)</td>
			<td style="width:181px;">Gilson</td>
			<td style="width:147px;">F123601</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Ethanol</td>
			<td style="width:181px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">459844</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">&#160;1 ml Syringe</td>
			<td style="width:181px;">BD Medical</td>
			<td style="width:147px;">301025</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">10 ml Syringe</td>
			<td style="width:181px;">BD Medical</td>
			<td style="width:147px;">301604</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">27 G x 0.5 in. needle</td>
			<td style="width:181px;">BD Medical</td>
			<td style="width:147px;">305109</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Refrigerated Microcentrifuge</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">13-100-676</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter</td>
			<td style="width:181px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:147px;">732836</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:181px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">14025-076</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">4-0 Silk Braided Surgical Suture</td>
			<td style="width:181px;">Ethicon</td>
			<td style="width:147px;">A183</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Luer to Tube Connector Kits</td>
			<td style="width:181px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:147px;">721406</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Luer Stopcock Kit</td>
			<td style="width:181px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:147px;">721664</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Tygon formula E-3603 laboratory tubing</td>
			<td style="width:181px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">R-3603</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:181px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">HT501128-4L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Mouse IL-1&#946; OptEIA ELISA Kit</td>
			<td style="width:181px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:147px;">559603</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit</td>
			<td style="width:181px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:147px;">550950</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Mouse TNF-&#945; OptEIA ELISA Kit</td>
			<td style="width:181px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:147px;">560478</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:181px;">Hausser Scientific</td>
			<td style="width:147px;">3520</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Hemacytometer Cover Glasses</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">22-021-801&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">SV3008401</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytology Funel Clips</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10-357</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytology Funels</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10-354</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter Cards</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>22-030-410</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Microscope Slides</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">12-544-1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Cover Glasses</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">12-540A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Cytospin Cytocentrifuge</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">A78300003&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Diff Quick Staining Kit</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">47733150</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Permount Mounting Medium</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">SP15-500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the utilization of oropharyngeal intratracheal pamp administration and bronchoalveolar lavage to evaluate the host immune response in mice

병원체에 대한 숙주 면역 반응은 복잡한 생물학적 과정이다. 생체 내 연구의 대부분은 고전적인 호스트 병원체 상호 작용이 생쥐를 선택 세균이나 병원균 관련 분자 패턴 (PAMPS)의 복강 내 주사의 장점을 특성화하기 위해 사용. 이러한 기술은 감염증 한테 진찰 Pathobiology와 관련된 엄청난 데이터를 산출하고 있지만, 복강 내 주사 모델은 항상 폐에 호스트 병원체 상호 작용 연구에 적합하지 않다. 생쥐의 급성 폐 염증 모델을 이용해서, 그 선천적 면역 반응은 리포 폴리 사카 라이드 (LPS)를 이용하여 호스트의 고해상도 분석을 수행 할 수있다. 여기서는, 비수술 인두 기관 내 투여를 이용하여 LPS를 관리 질병 병인과 관련된 임상 매개 변수를 모니터링하고, 숙주 면역 반응을 평가하기 위해 기관지 세정액을 활용하는 방법을 설명한다. 설명하는 기술PAMPS 및 병원균의 다양한 범위에 호스트 타고난 면역 반응을 연구하는데 널리 적용 할 수있다. 마찬가지로, 약간의 수정과 함께, 이들 기술은 또한 알레르기 성기도 염증을 평가 연구 및 약리학 애플리케이션에 적용될 수있다.

그람 음성 박테리아의 세포벽은 환경에 매우 풍부 LPS로 구성된다. 민감한 인간의 인구에 LPS를 흡입하면기도 반응성을 악화하고 강력한 면역 response11을 트리거 할 수 있습니다. LPS는 또한 강력한 선천성 면역 반응을 유도하도록 마우스 모델에서 사용되는 일반적인 PAMP이다. 프로토콜이 여기에 설명에서는, 마우스는 E.에서 격리 LPS의 그것의 복용량을받은 대장균 : 인두 IT 관리를 사용...

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The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

병원균 감염에 대한 숙주 면역 반응은 긴밀하게 규제 과정이다. 생쥐의 리포 다당류 폐 노광 모델을 이용해서, 그 질병 병인과 관련된 복잡한 메커니즘은 고해상도 평가를 수행하는 것이 가능하다.

마우스의 호스트 면역 반응을 평가하기 위해 구인두 기관 내 PAMP 관리 및 폐포의 활용

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

the-utilization-oropharyngeal-intratracheal-pamp-administration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.5K 조회수.  Virginia Polytechnic Institute and State University.  병원균 감염에 대한 숙주 면역 반응은 긴밀하게 규제 과정이다. 생쥐의 리포 다당류 폐 노광 모델을 이용해서, 그 질병 병인과 관련된 복잡한 메커니즘은 고해상도 평가를 수행하는 것이 가능하다. 

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Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

감염된 마우스에 세균 하중과 면역 응답 측정 리스테리아 monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

연구

면역학 및 감염병학

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

의 기생충 말벌에 대한 소개<em&gt; Drosophila</em&gt; 그리고 Antiparasite 면역 반응

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

면역 반응과 수면에서의 양적 측정<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ROS are toxic and function to kill phagocytized microorganisms. In vivo quantification of phagocyte-derived ROS provides information regarding an organism's ability to mount a robust innate immune response. Here we describe a protocol to quantify and compare ROS in whole zebrafish embryos upon chemical induction of the phagocyte respiratory burst. This method makes use of a non-fluorescent compound that becomes fluorescent upon oxidation by ROS. Individual zebrafish embryos are pipetted into the wells of a microplate and incubated in this fluorogenic substrate with or without a chemical inducer of the respiratory burst. Fluorescence in each well is quantified at desired time points using a microplate reader. Fluorescence readings are adjusted to eliminate background fluorescence and then compared using an unpaired t-test. This method allows for comparison of the respiratory burst potential of zebrafish embryos at different developmental stages and in response to experimental manipulations such as protein knockdown, overexpression, or treatment with pharmacological agents. This method can also be used to monitor the respiratory burst response in whole dissected kidneys or cell preparations from kidneys of adult zebrafish and some other fish species. We believe that the relative simplicity and adaptability of this protocol will complement existing protocols and will be of interest to researchers who seek to better understand the innate immune response.

The innate immune response protects organisms against pathogen infection. A critical component of the innate immune response, the phagocyte respiratory burst, generates reactive oxygen species that kill invading microorganisms. We describe a respiratory burst assay that quantifies reactive oxygen species produced when the innate immune response is chemically induced.

제브라 피쉬의 선천성 면역 건강의 지표로 호흡 버스트 응답의 정량화

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

마우스 대 식세포의 타고난 면역 반응을 조사하기 위해 RNA 간섭을 사용하여

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

웨스트 나일 바이러스 돌연변이 균주의 감염에에서 MyD88 매개 세포 면역 반응의 생체 외 분석

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data have encouraged pulmonary tuberculosis vaccines as a promising strategy to prevent pulmonary disease, which is responsible for transmission. In this work, we describe the methodology used to demonstrate in the mouse model the benefits of intranasal BCG vaccination when compared to subcutaneous. Our data revealed greater protective efficacy following intranasal BCG administration. In addition, our results indicate that pulmonary vaccination triggers a higher immune response in lungs, including Th1 and Th17 responses, as well as an increase of immunoglobulin A (IgA) concentration in respiratory airways. Our data show correlation between protective efficacy and the presence of IL17-producing cells in lungs post-Mycobacterium tuberculosis challenge, suggesting a role for this cytokine in the protective response conferred by pulmonary vaccination. Finally, we detail the global workflow we have developed to study respiratory vaccination in the mouse model, which could be extrapolated to other tuberculosis vaccines, apart from BCG, targeting the mucosal response or other pulmonary routes of administration such as the intratracheal or aerosol.

We herein detail the methodology followed to compare protective efficacy and lung immune response induced by intranasal and subcutaneous immunization with BCG in mouse model. Our results show the benefits of pulmonary vaccination and suggest a role for IL17-mediated response in vaccine-induced protection.

보호 효능 및 폐 면역 반응은 마우스에 피하 및 비강 BCG 관리에 따라

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data ...

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is based on the injection of non-pathogenic particles into insects, as the particles will be detected by the immune system and will induce the production of immune effectors. We focus here on the stimulation of the melanization response in the mosquito Anopheles gambiae. The melanization response results in the encapsulation of foreign particles and parasites with a dark layer of melanin. To stimulate this response, mosquitoes are inoculated with beads in the thoracic cavity using microcapillary glass tubes. Then, after 24 hr, the mosquitoes are dissected to retrieve the beads. The degree of melanization of the bead is measured using image analysis software. Beads do not have the pathogenic effects of parasites, or their capacity to evade or suppress the immune response. These injections are a way to measure immune efficacy and the impact of immune stimulations on other life history traits, such as fecundity or longevity. It is not exactly the same as directly studying host-parasite interactions, but it is an interesting tool to study immunity and its evolutionary ecology.

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

Through inoculation with beads, the described technique enables the stimulation of the mosquito melanization response in the hemolymph circulating system. The amount of melanin covering the beads can be measured after dissection as a measure of the immune response.

접종<em&gt; 아노 펠 레스 gambiae</emMelanization 면역 반응을 유도하고 측정하는 비즈&gt; 모기

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain insight into an ongoing disease state.
Here, a simple and efficient method is described to perform BAL on murine lungs without the need of special tools or equipment. BAL fluid is isolated by inserting a catheter in the trachea of terminally anesthetized mice, through which a saline solution is instilled into the bronchioles. The instilled fluid is gently retracted to maximize BAL fluid retrieval and to minimize shearing forces. This technique allows the viability, function, and structure of cells within the airways and BAL fluid to be preserved.
Numerous techniques may be applied to gain further understanding of the disease state of the lung. Here, a commonly used technique for the identification and enumeration of different types of immune cells is described, where&#160;flow cytometry is combined with a select panel of fluorescently labeled cell surface-specific markers. The BAL procedure presented here can also be used to analyze infectious agents, fluid constituents, or inhaled particles within murine lungs.

The health status of the lung is reflected by the type and number of immune cells that are present in the bronchioles of the lung. We describe a bronchoalveolar lavage technique that allows the isolation and study of nonadherent cells and soluble factors from the lower respiratory tract of mice.

쥐 폐의 기관지 폐포 세척은 염증성 세포의 침윤을 분석하는

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during physiological and pathological states. The isolation of EVs continues to be a major challenge in this field, due to limitations intrinsic to each technique. The differential ultracentrifugation with density gradient centrifugation method is a commonly used approach and is considered to be the gold standard procedure for EV isolation. However, this procedure is time-consuming, labor-intensive, and generally results in low scalability, which may not be suitable for small-volume samples such as bronchoalveolar lavage fluid. We demonstrate that an ultrafiltration centrifugation isolation method is simple and time- and labor-efficient yet provides a high recovery yield and purity. We propose that this isolation method could be an alternative approach that is suitable for EV isolation, particularly for small-volume biological specimens.

Here, we describe two extracellular vesicle isolation protocols, ultrafiltration centrifugation and ultracentrifugation with density gradient centrifugation, to isolate extracellular vesicles from murine bronchoalveolar lavage fluid samples. The extracellular vesicles derived from murine bronchoalveolar lavage fluid by both methods are quantified and characterized.