MT es apoyado por una beca de doctorado [ref. 092839/Z/10/Z] y CR por un nuevo Premio Investigador [ref. 095623/Z/11/Z] de la Wellcome Trust.

1. Opcional: Preparar Beads Heparina Affi-gel (perlas de gel) para FBM Ensayo de atracción NOTA: preparar perlas de gel de al menos 1 día antes de comenzar el procedimiento de explante. <ol><li> Lavar 100 l de gel de heparina suspensión de perlas con PBS estéril durante 20 min en un rodillo a temperatura ambiente (RT). </li><li> Perlas de pellets en una centrífuga de mesa durante 5 minutos a 13.000 x g. Añadir PBS estéril y repetir el proceso de lavado de 4x. </li><li> Después del lavado final, quitar PBS y remojar los granos en un pequeño volumen de una solución estéril que contiene la proteína recombinante de elección, teniendo cuidado de cubrir las perlas con la solución. Este protocolo utiliza 100 ng / l VEGF165 humana recombinante en PBS para reproducir un experimento publicado previamente 16. </li><li> Incubar las perlas de gel de heparina con la solución de proteína recombinante durante un mínimo de 12 horas y un máximo de 1 semana en un rodillo a 4 º C. </li></ol> 2. Revestimiento de la Cultura Insertars Explantes cerebro posterior se cultivan en la cultura Corning inserta con un tamaño de poro de 8 micras o inserciones equivalentes. Insertos de cultivo se pueden reutilizar después de la finalización del protocolo, siempre que se lavan con agua destilada, esterilizados con etanol, y se almacenan en etanol al 70% hasta que se necesite. NOTA: Los siguientes pasos deben llevarse a cabo en una campana de flujo en condiciones estériles. <ol><li> Preparar los medios de cultivo de explante que consiste en medio Neurobasal suplementado con B27 (20 l / ml), glucosa (6 mg / ml) y penicilina / estreptomicina (5 mg / l). </li><li> Cultura de lavado inserta con PBS estéril durante 5 min y seco durante 5-10 min bajo la campana de flujo. </li><li> Coloque un inserto de cultivo en cada pocillo individual de una placa 12well. Nota: Las inserciones pueden necesitar un pequeño empujón para encajar perfectamente en el pozo. </li><li> Cubrir los insertos de cultivo con 10-20 mg / ml de laminina de ratón en medio Neurobasal y colocarlos en una incubadora de cultivo de tejidos (37 º C, 5% de CO <sub&gt; 2) durante 1 hora. Nota: revestimiento debe llevarse a cabo en el día de la explantación. </li></ol> 3. Disección de Hindbrains de E11.5 embriones de ratón <ol><li> Cull temporizado ratón hembra embarazada con un procedimiento éticamente aprobado el día embrionario (E) 11,5 y colocar el útero que contiene los embriones en un plato de plástico de 100 mm con medio L15 enfriado en hielo. NOTA: Todos los pasos de disección se deben realizar en L15 enfriado en hielo. </li><li> Utilizando un microscopio de disección y Dumont relojero fórceps número 5, rasgar la pared muscular del útero para exponer los embriones, suelte cada embrión, cortar el cordón umbilical, y cuidadosamente quite el saco vitelino. </li><li> Usando una pipeta Pasteur de plástico con una abertura de gran calibre, transferir cada embrión en una placa de plástico limpio con L15 enfriado en hielo. </li><li> Con unas pinzas Dumont, decapitar al embrión justo por encima de las extremidades anteriores. Si el experimento requiere el genotipado de los embriones, recolectar muestras de tejido para el aislamiento del ADN genómico (por ejemplo, una pequeña piece del saco vitelino o punta de la cola 16,20). </li><li> Gire la parte dorsal de la cabeza y de identificar el 4 º ventrículo, que está cubierto por una delgada capa de tejido (Figura 2B). Perforar con cuidado el roofplate y empezar a pelar lejos caudalmente a lo largo de la línea media sobre la parte posterior del cerebro posterior y la médula espinal, y el rostral sobre el cerebro medio. El cerebro posterior ahora debe ser expuesto (Figura 2C). </li><li> Burlarse cuidadosamente lejos la mesénquima de la cabeza restante y cualquier meninges que se adjuntan a la parte pial de la parte posterior del cerebro (Figura 2D). </li><li> Retire el tejido del cordón del cerebro medio y la médula para que el cerebro posterior se despliega y se acueste en una preparación a libro abierto (Figura 2E). </li><li> El uso de un gran calibre Pasteur plástico pipeta, transferir cada cerebro posterior diseccionado a una placa de 12 pocillos que contiene helado L15 y guardarlos en hielo hasta que todos hindbrains se han disecado. </li><li> El uso de un de gran calibre Pasteur plástico pipeta, transferir un pecadogle cerebro posterior a un plato vacío, manteniendo una preparación de libro abierto, cara ventricular hacia arriba, en una gota de aproximadamente 100 l L15. </li><li> Transferencia de unos pocos microlitros de las perlas de gel de heparina incubadas a la misma gotita. Nota: Debido a que los tamaños de los granos son variables, es aconsejable transferir alrededor de 10 cuentas y luego elegir un tamaño óptimo para el trasplante en el cerebro posterior. </li><li> Hacer un pequeño desgarro en el tejido de cerebro posterior y insertar cuidadosamente 1-3 perlas de gel en el tejido cerebro posterior en el nivel de R5 / 6, a mitad de camino entre la línea media y el borde lateral de la parte posterior del cerebro, disminución de los mismos en el tejido de modo que el talón se coloca justo debajo de la superficie posterior del cerebro. NOTA: El procedimiento de disección puede tardar entre 5-20 min / cerebro posterior, dependiendo de la experiencia, y puede prolongarse durante un período prolongado si camadas son grandes, en todo caso, hindbrains deben estar en la cultura de no más de 3 horas post-mortem para la buena resultados. </li></ol> 4. RombencéfaloExplante Cultura <ol><li> Retire la placa que contiene los insertos de cultivo de la incubadora, aspirar la solución de revestimiento laminina. </li><li> Coloque un inserto de cultivo en una placa de cultivo separado lleno de helado L15 y, con un diámetro ancho Pasteur plástico pipeta, transferir cada lado ventral posterior del cerebro para arriba sobre la inserción del cultivo (Figura 2G). El cerebro posterior debe quedar completamente plana sobre la membrana de inserción. </li><li> Levante con cuidado la inserción del cultivo de la antena y aplíquelo varias veces en un pañuelo de papel limpio para eliminar el exceso de líquido. Este proceso asegura que el cerebro posterior se adhiere a la inserción de la cultura en una preparación a libro abierto plana. Si el cerebro posterior se queja, su tejido puede irreversiblemente crecer juntos. </li><li> Llene la placa de 12 pocillos original con 500 l de medios de cultivo precalentado y coloque el inserto de nuevo en este pozo. Ajustar cuidadosamente el volumen con otro 400-600 l de los medios de comunicación para cubrir sólo la parte posterior del cerebro, lo que garantiza que el cerebro posterior no flotafuera de la membrana. Si flota, vuelva al paso 4.4 y repetir hasta que la parte posterior del cerebro se mantiene unida a la membrana. </li><li> En esta etapa, es posible añadir inhibidores biológicos de interés para los medios de comunicación para estudiar su efecto sobre la migración de las neuronas FBM. NOTA: Si va a implantar cuentas o administrar otros tratamientos, se recomienda mantener al menos 2 explantes de control bajo condiciones normales de crecimiento por experimento para asegurar que el experimento ha sido creado con éxito. </li><li> Incubar explantes durante 24-30 horas en un incubador de cultivo de tejidos (37 º C, 5% de CO 2). </li></ol> 5. Wholemount Inmunofluorescencia tinción de Rombencéfalo explantes <ol><li> Aspirar los medios de comunicación de cada pocillo, enjuagar en PBS y fijar, por 2 horas a 4 ° C con agitación suave en frío de hielo 4% de formaldehído (recién preparada o recién descongelado 4% de paraformaldehído disuelto en PBS). Nota: No intente retirar cerebro posterior de la inserción del cultivo antes de la fijaciónes completa. </li><li> Enjuague 3 veces con PBS. Retire con cuidado los hindbrains de los insertos de cultivo utilizando pinzas Dumont. Algunos explantes son difíciles de pelar, pero por lo general se pueden levantar aplicando presión suave a través de la expulsión repetida PBS de una pipeta. </li><li> Transfiera los hindbrains a 2,0 ml tubos de fondo redondo para el etiquetado de inmunofluorescencia. Permeabilizar hindbrains durante 30 min a temperatura ambiente (TA) en PBS que contenía 0,1% de Triton X-100 (PBT) con suave de rodillo. </li><li> Incubar durante 1 hora a TA en PBT que contiene 10% de suero de cabra normal inactivado por calor con balanceo suave. </li><li> Incubar explantes con balanceo suave a 4 ° C durante 5 días con el anticuerpo primario específico para ISL1, diluido 1:100 en PBT que contiene 1% de suero de cabra normal inactivado por calor. </li><li> Lave los explantes a TA 4x con PBT durante 15 min cada uno. </li><li> Incubar explantes con suave balanceo a temperatura ambiente durante 3 h con fluoróforo conjugado de cabra anti-ratón (por ejemplo, Alexa Fluor 488 cabra antiratón, diluido 1:200) en PBT que contiene 1% de suero de cabra normal inactivado por calor. </li><li> Lave los explantes 4x a TA con PBT durante 15 min cada uno con suave balanceo. </li><li> Postfix los explantes en formaldehído al 4% durante 30 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Cubra una placa de vidrio con 3 capas de cinta aislante color negro y los impuestos especiales con un bisturí a una pequeña plaza de la cinta en capas para crear un bolsillo para los explantes, como alternativa, utilizar un portaobjetos de vidrio depresión. </li><li> Monte cada cerebro posterior en el reactivo SlowFade en un bolsillo y cubrir con un cubreobjetos de vidrio, evitando cuidadosamente para atrapar burbujas de aire y la imagen usando un microscopio confocal de barrido láser. NOTA: Como alternativa a la inmunotinción, la hibridación in situ con ribosondas que reconocen FBMS (es decir ISL1 o PHOX2B) puede ser utilizado para visualizar las neuronas FBM 16,21. </li></ol> Resumen de los pasos y el calendario ~ 14 días: el apareamiento para obtener embarazos E11.25 temporizado Opcional: Bead preparación (PROTOCOLO DEl 1): ~ 2 horas, el día antes del aislamiento del embrión Preparar insertos de cultivo y medios de comunicación (Protocolo 2): ~ 30 min, antes del aislamiento del embrión Aislamiento de embriones y la disección posterior del cerebro (pasos 3.1 a 3.4): ~ 10 min / embriones Disección Rombencéfalo (pasos 3.5 a 3.7): ~ 5-10 min / rombencéfalo Procedimiento de explante (pasos 3.8 a 3.9): ~ 5-10 min / rombencéfalo Opcional: la implantación de bolas (pasos 3.10-3.11): ~ 5-10 min / rombencéfalo Cultura explante (paso 4.7): 24 horas Fijación para la tinción de anticuerpos (paso 5.1): 2 hr Procedimiento de tinción y de imagen (Protocolo 5): 5 días

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Ninguno de los autores tiene intereses o conflictos de intereses en competencia.

Este protocolo describe la cultura wholemount de hindbrains E11.5 ratón en un sistema transwell para estudiar la migración de las neuronas FBM. Este protocolo permite a neuronas motoras del cerebro posterior ratón para mantenerse con vida y la migración por un período de 24 horas, lo que permite la manipulación ex vivo. Este método tiene numerosas ventajas experimentales para los investigadores que tratan de identificar los mecanismos moleculares y celulares de la migración neuronal. Considerando que los ensayos de migración tradicionales explante pequeñas piezas de tejido neural en la matriz en placas de cultivo y permiten la observación de las neuronas individuales, ya que responden a estímulos exógenos, una gran ventaja del ensayo Transwell es su idoneidad para manipular las neuronas que migran dentro del entorno de órganos anfitrión y por lo tanto una más contexto fisiológico. Es importante destacar que las sustancias se pueden aplicar fácilmente a los explantes in vivo del cerebro posterior ex para probar su efecto sobre la migración neuronal, evitando los posibles efectos secundarios asociados con administesonar estas sustancias a un ratón embarazada. Por último, el modelo in vivo ex también permite el ensayo de sustancias que no cruzan la barrera placentaria, tales como anticuerpos función de bloqueo. Debido a estas ventajas, el cerebro posterior cultivo ex vivo proporciona un método alternativo y complementario a la utilización de embriones de pez cebra, que pueden ser tratados con moléculas pequeñas solubles en agua en el agua del acuario, o en el útero de la electroporación de cerebros de embriones, que requiere el uso de especializada equipo y es más difícil de dominar que la técnica de cultivo descrito aquí. Otra ventaja del protocolo descrito aquí es su susceptibilidad a la implantación de perlas empapadas en proteína recombinante u otros reactivos, por lo tanto, permite la aplicación de un método embriológico estándar desarrollado para manipular los embriones de pollo a un modelo de ratón de la migración neuronal. En particular, el modelo in vivo ex cultivo puede ser aplicado a hindbrains de ratones modificados genéticamente defectuosativa en moléculas específicas implicadas en la migración neuronal, tales como receptores de crecimiento o el factor de orientación, y en combinación con implantes de talón para probar si se pierde la capacidad de respuesta a los ligandos. Además de la manipulación farmacológica, el protocolo in vivo ex cultura también podría ser adaptado para electroporar vectores de expresión que podrían manipular la expresión de genes de interés; métodos apropiados para la electroporación se han descrito previamente 22,23. Este protocolo también puede estar adaptado para visualizar la migración de las neuronas por microscopía de lapso de tiempo en explantes de cerebro posterior de los ratones transgénicos que contienen las neuronas FBM marcados con fluorescencia, por ejemplo ISL1-Cre; Rosa26Yfp 21. Finalmente, este protocolo también se puede usar para estudiar otros tipos de neuronas que migran en el cerebro posterior, tales como los que forman la oliva inferior, aunque esto requeriría el uso de hindbrains en las etapas embrionarias de edad avanzada y puede requerir la cultura para un máximo de 48 h, dependiendo de la viabilidad neuronal <em&gt; Ex vivo. Los pasos críticos y solución de problemas Para el éxito de este protocolo, es crucial que los embriones se recogen temprano en E11.5 día, más cerca de E11.25, cuando FBM la migración de las neuronas recién ha comenzado. Sin embargo, no siempre es posible coger embriones en esta etapa del desarrollo debido a la variabilidad de apareamiento natural de los ratones, y, en consecuencia, puede haber algo de variabilidad en la extensión de FBM migración entre diferentes experimentos. La variabilidad en la migración FBM también se puede observar si el experimento no se completa dentro del marco de tiempo asignado, alrededor de 3 horas, como se puede ver en la figura 3E. Tejido Rombencéfalo de embriones de ratón E11.25 es delicado. Cuando la disección y durante todo el procedimiento de explante, es importante no romper el tejido cerebro posterior en las áreas de R4-R6 donde se encuentran las neuronas FBM. Debido a la naturaleza delicada de la Tesisproceso exión, y debido a la velocidad a la que hindbrains se colocan en la cultura influye en los resultados, el procedimiento puede tardar un par de la práctica funciona de dominar, en particular, antes de que se utilizaron muestras preciosas o reactivos. Por último, es importante que el tejido de cerebro posterior se coloca en una configuración libro abierto en la inserción del cultivo, porque el plegado de la parte posterior del cerebro durante el cultivo de tejido evitará la migración normal de FBM (véase la figura 3F).

Neuronas embrionarias nacen en la zona ventricular del cerebro, pero posteriormente migran a nuevos destinos para llegar a las regiones de destino apropiados que se encuentran a una gran distancia. El correcto posicionamiento de los cuerpos celulares neuronales en lugares apropiados a lo largo de los ejes dorso-ventral y anterior-posterior del cerebro en desarrollo es esencial para el cableado correcto, la supervivencia, y la función de estas neuronas después de la etapa migratoria 1-4. De manera similar a los mecanismos moleculares que controlan axón orientación 5-7, se cree conjuntos combinatorios de las señales de atracción y repulsión para guiar las neuronas que migran 1,8. Sin embargo, debido a las interacciones de múltiples tipos de células, las señales que controlan la migración neuronal han sido estudiados con menos intensidad que los involucrados en el direccionamiento del axón, que se puede estudiar la célula autónoma. El cerebro posterior desarrollo de los vertebrados se ha utilizado en varios estudios recientes para entender los mecanismos moleculares y celularesde la migración neuronal, por ejemplo en la chica, el ratón y el pez cebra 1-4,9. Este órgano contiene varios tipos diferentes de neuronas, incluyendo varios subtipos de precerebellar y neuronas motoras 5,7,10,11. Motorneuron Rombencéfalo nacen en la zona ventricular cerca de la placa del piso, y se diferencian en subconjuntos específicos de acuerdo a su rhombomere de origen 1,12. El branchiomotor facial (FBM), las neuronas se generan en rombómero (R) 4 en el cerebro posterior y se extienden sus axones dorsalmente a través de un punto de salida R4 en el segundo arco branquial para inervar los músculos faciales 2,9,13. Neuronas FBM de pez cebra y ratones proporcionan excelentes modelos para estudiar los mecanismos moleculares y celulares de la migración neuronal en un proceso que se visualiza fácilmente, debido a que estas neuronas reproducible translocan su cuerpos celulares en un proceso espaciotemporalmente bien definida. En ratones, las neuronas migran FBM primera cauDally través de R5 y entonces tanto en sentido caudal y ventral para alcanzar su posición final en el lado pial del cerebro posterior en el territorio de r6, donde forman los núcleos apareados del nervio craneal VII (Viin) 10,11,14. En el pez cebra, las neuronas migran ventralmente FBM inicialmente y luego cambian de dirección en el límite de la R4-R5 continuar migrando hacia la superficie pial de una manera dependiente de la laminina 4,12,15,16. Esta migración procede durante un período de varios días en el desarrollo y se puede dividir en fases de la migración tangencial y radial, lo que permite la identificación de moléculas que median estos dos procesos distintos. En contraste, las neuronas FBM de la parte posterior del cerebro de embriones de pollo permanecen en R4 3,13,17-19. Durante su migración, las neuronas FBM se pueden identificar, al igual que otros tipos o neuronas motoras, a través de su expresión del factor de transcripción de los islotes homoeodomain 1 (ISL1) 14. Por lo tanto, Mayoristasla tinción de inmunofluorescencia emount o hibridación in situ para este marcador en diferentes etapas de desarrollo revela la corriente migratoria distinta de FBM somas se extiende desde R4 a R6 en el pez cebra o el ratón 4,15,16. Por otra parte, los reporteros transgénicos fluorescentes tales como ISL1-GFP se han utilizado como herramientas adecuadas para visualizar la migración de neuronas en el pez cebra FBM 3,17-19. Además de su idoneidad para la formación de imágenes, muchos investigadores han estudiado la migración de las neuronas FBM en el desarrollo de pez cebra, porque sus embriones de vida libre se pueden manipular fácilmente con técnicas de trasplante de células y compuestos farmacológicos aplicados directamente al agua del acuario. En contraste, el embrión de ratón desarrolla encerrado en el útero, lo que impide la implantación de perlas que transportan las señales de orientación o la administración de anticuerpos de la función de bloqueo que no cruzan la barrera placentaria. Además, los compuestos farmacológicos administrados a la madre embarazada puede tener sinefectos secundarios deseados que pueden afectar indirectamente la embriogénesis. Eludir esta limitación, hemos desarrollado un método ex vivo para la cultura posterior del cerebro del ratón todo que es compatible con la migración de las neuronas FBM y la supervivencia durante 24 horas después de la explantación 7,16. Este método permite la manipulación farmacológica fácil, la implantación de los granos que llevan las señales de orientación o la administración de anticuerpos de la función de bloqueo y también podría ser adaptado para estudiar la migración de otros subtipos neuronales en el cerebro posterior en diferentes etapas de desarrollo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="575">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Eppendorf round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock)</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">211-2120</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Cell culture plates, 12 well</td>
			<td style="width:111px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:104px;">150628</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Plastic cell culture dish, 100 mm</td>
			<td style="width:111px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:104px;">150288</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">15 mm Netwell insert with Mesh Polyester Membrane</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:104px;">3477</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Watchmaker forceps, no. 5</td>
			<td style="width:111px;">Dumont</td>
			<td style="width:104px;">91150-20</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">P4417</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Laminin mouse protein</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">23017-015</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:215px;">Primary antibody, Isl1</td>
			<td style="width:111px;">Developmental Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:104px;">39.4D5</td>
			<td style="width:147px;">Dilution 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">AlexaFluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">A11029</td>
			<td style="width:147px;">Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">21103</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">B27 supplement (50x)&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">17504-044</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Leibovitz&#8217;s L-15</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">21083-027</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Penicillin/ streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">15070</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Glucose</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">101174Y</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Heat-inactivated goat serum</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">G9023</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">T8787</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">P6148</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Slowfade Antifade Kit</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">S-2828</td>
			<td style="width:147px;">Alternative mounting solutions may be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">631-0912</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Cover glass</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">631-0137</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:215px;">Affi-Gel Heparin Beads</td>
			<td style="width:111px;">Biorad</td>
			<td style="width:104px;">153-6173</td>
			<td style="width:147px;">Glass, latex, or coloured beads may be used alternatively</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:215px;">Recombinant human VEGF165</td>
			<td style="width:111px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:104px;">293-VE</td>
			<td style="width:147px;">Resuspend in PBS, store aliquots at -80oC</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Stereo Microscope, Leica MZ16</td>
			<td style="width:111px;">Leica</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Confocal laser scanning microscope&#160; LSM710</td>
			<td style="width:111px;">Zeiss</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse hindbrain ex vivo culture to study facial branchiomotor neuron migration

Neuronas embrionarias nacen en la zona ventricular del cerebro, pero posteriormente migran a nuevos destinos para alcanzar los objetivos adecuados. Por lo tanto, Descifrar las señales moleculares que guían la migración de manera cooperativa neuronal en el cerebro embrionario es importante entender cómo las complejas redes neuronales se forman que luego sostener la vida postnatal. Branchiomotor facial (FBM), las neuronas en el cerebro posterior embrión de ratón migran desde rombómero (R) 4 caudalmente para formar los núcleos faciales apareados en la región derivada-R6 de la parte posterior del cerebro. Aquí le ofrecemos un protocolo detallado para wholemount cultivo ex vivo de hindbrains embrión de ratón adecuados para investigar las vías de señalización que regulan la migración FBM. En este método, hindbrains de embriones E11.5 ratón se disecan y se cultivaron en una preparación de libro abierto en insertos de cultivo celular de 24 horas. Durante este tiempo, las neuronas FBM migran caudalmente hacia R6 y pueden estar expuestos a anticuerpos función de bloqueo y los pequeños moleculES en los medios de cultivo o perlas de heparina cargadas con proteínas recombinantes para examinar las funciones para las vías de señalización implicadas en la orientación de la migración neuronal.

En esta sección se ilustra ejemplos de los resultados que se pueden obtener mediante el estudio de FBM migración de neuronas en el cerebro posterior del ratón a través de la cultura ex vivo. Se demuestra que las neuronas FBM en hindbrains explantadas de día 11 embriones de ratón primera experimentan una migración tangencial (Figura 3 A) y luego comienzan a montar el núcleo facial del motor (Figura 3B), similar a su comportamiento en el útero (ver Figura 1). Además, demuestran que la implantación de un cordón VEGF165-empapado atrae neuronas FBM (Figuras 3C y 3D), como se muestra anteriormente 16. Es importante destacar que, este protocolo permite estudiar la migración FBM en la ausencia de vasos sanguíneos o los vasos factores derivados que pueden influir en la migración FBM en el útero, porque la vasculatura nonperfused degenera en la cultura 16. De este modo, en el etiquetado de glóbulos inespecífico observado cuando se utiliza el anticuerpo ISL1 ratón en reciénhindbrains aislados de ratón (Figura 1) ya no está presente en el tejido posterior del cerebro después de 24 horas en cultivo (Figuras 3A-F). Finalmente, se muestran dos ejemplos de hindbrains que no fueron explantados correctamente y por lo tanto contienen neuronas FBM en una distribución anormal, ya sea porque el cerebro posterior no fue explantó muy pronto después del aislamiento del embrión (Figura 3E) o porque el tejido de cerebro posterior plegado en el transwell ( Figura 3F). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51397/51397fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51397/51397fig1.jpg" /> Figura 1. FBM migración neuronal confocal z-stack de hindbrains wildtype ratón después ISL1 immunolabeling wholemount y flatmounting;.. La línea media posterior del cerebro está indicado con un asterisco en todos los paneles (A) superficie ventricular de un cerebro posterior E11.5 en el<html> área que contiene neuronas FBM ISL1-positiva (flecha), lo que demuestra su migración tangencial de R4 a R6;. la posición de R4, R5 y R6 se indica (A &#39;) superficie pial de la mitad de la misma cerebro posterior en el área que contiene el Anlage . de uno de los núcleos FBM emparejados (indicados con Viin), así como otras poblaciones de neuronas ISL1-positivo (B) la superficie ventricular de un cerebro posterior E12.5 neuronas que contienen FBM que están migrando tangencialmente (flecha); la punta de flecha indica un ejemplo de un vaso sanguíneo que contiene las células circulantes que se inespecíficamente etiquetados por la reacción cruzada del anticuerpo secundario anti-ratón utilizado para detectar el anticuerpo IgG de ratón ISL1. (B &#39;) superficie pial de la mitad de la misma rombencéfalo E12.5, que contiene uno de los núcleos FBM emparejados. La línea media se indica con un asterisco en cada panel. La barra de escala (todas las hojas): 200 m. V, ventral, P, de la pía madre./ 51397fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver la imagen más grande. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51397/51397fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51397/51397fig2.jpg" /> Figura 2. E11.5 ratón disección posterior del cerebro y vivo la cultura ex. (AE) Los pasos claves en el protocolo de disección de cerebro posterior E11.5; barra de escala:. 1 mm (A) Jefe del embrión después de que se corta, junto con el resto del embrión en el nivel de la extremidad anterior (B) La parte rostral del. la cabeza se eliminó y el resto de la tejido de la cabeza de modo que el 4 º ventrículo (flecha) estaba orientado hacia arriba. (C) El techo de la 4 ª ventrículo se desprendió, y el cerebro posterior fue expuesto por pelado tejido debajo de la parte posterior del cerebro de distancia rostral y caudal. (D) Se eliminó la membrana pial (nótese que en este examplio, algunos médula espinal cervical (SC) de tejido ha permanecido unido a la parte posterior del cerebro). (E) El exceso de cerebro medio (MB) y la médula espinal (SC) de tejido se ha eliminado para retener sólo el cerebro posterior. (insertos F) Cultura se recubrieron con laminina y se colocan en una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos. (G) Cada cerebro posterior se colocó sobre un inserto y se cubre con los medios de comunicación. (H) Representación esquemática de la trayectoria seguida por la migración de las neuronas FBM (azul) durante 24 horas de cultivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51397/51397fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51397/51397fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51397/51397fig3.jpg" /> Figura 3. Ratón cerebro posterior ex vivo la cultura. (A, B) Un cerebro posterior E11.5 se cultivó durante 24 horas y immunofluoresc<html> temente etiquetados para ISL1 para ilustrar FBM la migración de neuronas en un explante; tanto ventricular (A) y (B) de la pía madre lados de la parte posterior del cerebro se muestran (C, D) hindbrains littermate E11.5 se cultivaron en presencia de heparina implantado grano empapado. en PBS (C) o VEGF165 (D); en cuenta que las neuronas FBM migran hacia y en la perla VEGF165, y por lo tanto la corriente de migración ampliado aún más caudalmente en comparación con el lado no tratado de la misma rombencéfalo o el cerebro posterior que contiene la bola de control (E. , F) Ejemplos de explantes insatisfactorios cerebro posterior E11.5, en la que CESM no han emigrado de r4 (E), o en el que el tejido cerebro posterior doblado durante el cultivo (F). La línea media se indica con un asterisco en cada panel. La barra de escala (para todos los paneles): 200 m. V, ventral, P, de la pía madre.&quot;&gt; Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

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Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Neuronas embrionarias nacen en la zona ventricular del tubo neural, pero migran a alcanzar los objetivos adecuados. Branchiomotor facial (FBM), las neuronas son un modelo útil para estudiar la migración neuronal. Este protocolo describe la cultura wholemount ex vivo de hindbrains embrión de ratón para investigar los mecanismos que regulan la migración FBM.

Ratón Rombencéfalo<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura para el Estudio de la Migración facial Branchiomotor Neurona

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

mouse-hindbrain-ex-vivo-culture-to-study-facial-branchiomotor-neuron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

11.1K vistas.  University College London.  Neuronas embrionarias nacen en la zona ventricular del tubo neural, pero migran a alcanzar los objetivos adecuados. Branchiomotor facial (FBM), las neuronas son un modelo útil para estudiar la migración neuronal. Este protocolo describe la cultura wholemount ex vivo de hindbrains embrión de ratón para investigar los mecanismos que regulan la migración FBM. 

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Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

Ex vivo de imágenes en vivo de las divisiones sola celda en ratón neuroepitelio

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Investigación

Neurociencias

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted area of the brain, neural stem cells proliferate and constantly generate neuroblasts that migrate tangentially in chains along the rostral migratory stream (RMS) to reach the olfactory bulb (OB). Once in the OB, neuroblasts switch to radial migration and then differentiate into mature neurons able to incorporate into the preexisting neuronal network. Proper neuroblast migration is a fundamental step in neurogenesis, ensuring the correct functional maturation of newborn neurons. Given the ability of SVZ-derived neuroblasts to target injured areas in the brain, investigating the intracellular mechanisms underlying their motility will not only enhance the understanding of neurogenesis but may also promote the development of neuroregenerative strategies.
This manuscript describes a detailed protocol for the transfection of primary rodent RMS postnatal neuroblasts and the analysis of their motility using a 3D in vitro migration assay recapitulating their mode of migration observed in vivo. Both rat and mouse neuroblasts can be quickly and efficiently transfected via nucleofection with either plasmid DNA, small hairpin (sh)RNA or short interfering (si)RNA oligos targeting genes of interest. To analyze migration, nucleofected cells are reaggregated in &#39;hanging drops&#39; and subsequently embedded in a three-dimensional matrix. Nucleofection per se does not significantly impair the migration of neuroblasts. Pharmacological treatment of nucleofected and reaggregated neuroblasts can also be performed to study the role of signaling pathways involved in neuroblast migration.

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Neuroblast migration is a crucial step in postnatal neurogenesis. The protocol described here can be used to investigate the role of candidate regulators of neuroblast migration by employing DNA/small hairpin RNA (shRNA) nucleofection and a 3D migration assay with neuroblasts isolated from the rodent postnatal rostral migratory stream.

Nucleofection de roedores neuroblastos para el Estudio de la Migración Neuroblast<em&gt; In vitro</em

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

La manipulación genética de las neuronas cerebelosa gránulo<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em&gt; Estudiar Neuronal Morfología y Migración

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then radial migration in the molecular layer and the Purkinje cell layer to reach the internal granular layer of the cerebellar cortex. Default in migratory processes induces either cell death or misplacement of the neurons, leading to deficits in diverse cerebellar functions. Centripetal granule cell migration involves several mechanisms, such as chemotaxis and extracellular matrix degradation, to guide the cells towards their final position, but the factors that regulate cell migration in each cortical layer are only partially known. In our method, acute cerebellar slices are prepared from P10 rats, granule cells are labeled with a fluorescent cytoplasmic marker and tissues are cultured on membrane inserts from 4 to 10 hr before starting real-time monitoring of cell migration by confocal macroscopy at 37 &#176;C in the presence of CO2. During their migration in the different cortical layers of the cerebellum, granule cells can be exposed to neuropeptide agonists or antagonists, protease inhibitors, blockers of intracellular effectors or even toxic substances such as alcohol or methylmercury to investigate their possible role in the regulation of neuronal migration.

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

Ex Vivo Imaging de Postnatal cerebelosa gránulo migración celular utilizando confocal Macroscopía

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

Baja densidad primaria del hipocampo Neurona Cultura

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded forebrain neuroepithelium is not amenable to wholemount analysis to examine organ-wide neurogenesis patterns. Moreover, defining the mechanisms of forebrain neurogenesis is not necessarily predictive of neurogenesis in other parts of the brain; for example, due to the presence of forebrain-specific progenitor subtypes. The mouse hindbrain provides an alternative model for studying embryonic neurogenesis that is amenable to wholemount analysis, as well as tissue sections to observe the spatiotemporal distribution and behavior of neural progenitors. Moreover, it is easily dissected for other downstream applications, such as cell isolation or molecular biology analysis. As the mouse hindbrain can be readily analyzed in the vast number of cell lineage reporter and mutant mouse strains that have become available, it offers a powerful model for studying the cellular and molecular mechanisms of developmental neurogenesis in a mammalian organism. Here, we present a simple and quick method to use the mouse embryo hindbrain for analyzing mammalian neural progenitor cell (NPC) behavior in wholemount preparations and tissue sections.

This article demonstrates how the mouse embryonic hindbrain can be used as a model for studying developmental neurogenesis in both whole organ and tissue section preparations.

El cerebelo de ratón como modelo para el estudio de la neurogénesis embrionaria

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, very few have been widely accepted. Here, we propose&#160;a new procedure&#160;adapted from the well-known ex vivo brain slice technique, which offers a closer in vivo-like scenario than in vitro preparations, for investigating the early events triggering cell degeneration, as observed in Alzheimer&#39;s disease (AD). This variation consists of simple and easily reproducible steps, which enable preservation of the anatomical cytoarchitecture of the selected brain region and its local functionality in a physiological milieu. Different anatomical areas can be obtained from the same brain, providing the opportunity to perform multiple experiments with the treatments in question in a site-, dose-, and time-dependent manner. Potential limitations&#160;which could affect the outcomes related to this methodology are related to the conservation of the tissue, i.e., the maintenance of its anatomical integrity during the slicing and incubation steps and the section thickness, which can influence the biochemical and immunohistochemical analysis. This approach can be employed for different purposes, such as exploring molecular mechanisms involved in physiological or pathological conditions, drug screening, or dose-response assays. Finally, this protocol could also reduce the number of animals employed in behavioral studies. The application reported here has been recently described and tested for the first time on ex vivo rat brain slices containing the basal forebrain (BF), which is one of the cerebral regions primarily affected in AD. Specifically, it has been demonstrated that the administration of a toxic peptide derived from the C-terminus of acetylcholinesterase (AChE) could prompt an AD-like profile, triggering, along the antero-posterior axis of the BF, a differential expression of proteins altered in AD, such as the alpha7 nicotinic receptor (&#945;7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau), and amyloid beta (A&#946;).

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

We present a method which can&#160;provide further insights into the early events underlying neurodegeneration and based on the established ex-vivo brain technique, combining the advantages of in vivo and in vitro experiments. Moreover, it represents a unique opportunity for direct comparison of treated and untreated group in the same anatomical plane.

Un enfoque alternativo para estudiar acontecimientos primarios en neurodegeneración con rodajas de cerebro de rata Ex Vivo

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

Facial Nerve Surgery in the Rat Model to Study Axonal Inhibition and Regeneration

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial nerve can be manipulated along its entire length, from its intracranial segment to its extratemporal course. There are three primary types of nerve injury used for the experimental study of regenerative properties: nerve crush, transection, and nerve gap. The range of possible interventions is vast, including surgical manipulation of the nerve, delivery of neuroactive reagents or cells, and either central or end-organ manipulations. Advantages of this model for studying nerve regeneration include simplicity, reproducibility, interspecies consistency, reliable survival rates of the rat, and an increased anatomic size relative to murine models. Its limitations involve a more limited genetic manipulation versus the mouse model and the superlative regenerative capability of the rat, such that the facial nerve scientist must carefully assess time points for recovery and whether to translate results to higher animals and human studies. The rat model for facial nerve injury allows for functional, electrophysiological, and histomorphometric parameters for the interpretation and comparison of nerve regeneration. It thereby boasts tremendous potential toward furthering the understanding and treatment of the devastating consequences of facial nerve injury in human patients.

This protocol describes a reproducible approach to facial nerve surgery in the rat model, including descriptions of various inducible patterns of injury.

Cirugía de nervios faciales en el modelo de rata para estudiar la inhibición y regeneración axonal

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial ...

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and cardiac arrest are remarkably sexually dimorphic diseases, and both induce cerebral ischemia. However, progress in understanding the vascular cognitive impairment, and then developing sex-specific treatments, has been partly limited by challenges in investigating the brain microcirculation from mouse models in functional studies. Here, we present an approach to examine the capillary-to-arteriole signaling in an ex vivo hippocampal capillary-parenchymal arteriole (HiCaPA) preparation from mouse brain. We describe how to isolate, cannulate, and pressurize the microcirculation to measure arteriolar diameter in response to capillary stimulation. We show which appropriate functional controls can be used to validate the HiCaPA preparation integrity and display typical results, including testing potassium as a neurovascular coupling agent and the effect of the recently characterized inhibitor of the Kir2 inward rectifying potassium channel family, ML133. Further, we compare the responses in preparations obtained from male and female mice. While these data reflect functional investigations, our approach can also be used in molecular biology, immunochemistry, and electrophysiology studies.

The present manuscript details how to isolate hippocampal arterioles and capillaries from the mouse brain and how to pressurize them for pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

Ex Vivo Presurizado Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparación para Estudio Funcional

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using calcium as a proxy for neuronal activity, these techniques provide a way to monitor the responses of individual cells within large neuronal ensembles to a variety of stimuli in real time. We, and others, have applied these techniques to image the responses of individual geniculate ganglion neurons to taste stimuli applied to the tongues of live anesthetized mice. The geniculate ganglion is comprised of the cell bodies of gustatory neurons innervating the anterior tongue and palate as well as some somatosensory neurons innervating the pinna of the ear. Imaging the taste-evoked responses of individual geniculate ganglion neurons with GCaMP has provided important information about the tuning profiles of these neurons in wild-type mice as well as a way to detect peripheral taste miswiring phenotypes in genetically manipulated mice. Here we demonstrate the surgical procedure to expose the geniculate ganglion, GCaMP fluorescence image acquisition, initial steps for data analysis, and troubleshooting. This technique can be used with transgenically encoded GCaMP, or with AAV-mediated GCaMP expression, and can be modified to image particular genetic subsets of interest (i.e., Cre-mediated GCaMP expression). Overall, in vivo calcium imaging of geniculate ganglion neurons is a powerful technique for monitoring the activity of peripheral gustatory neurons and provides complementary information to more traditional whole-nerve chorda tympani recordings or taste behavior assays.

Here we present how to expose the geniculate ganglion of a live, anesthetized laboratory mouse and how to use calcium imaging to measure the responses of ensembles of these neurons to taste stimuli, allowing for multiple trials with different stimulants. This allows for in depth comparisons of which neurons respond to which tastants.

Imágenes de calcio in vivo de las respuestas de las neuronas ganglionares geniculadas de ratón a los estímulos del gusto

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...