Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Defensa de Grant PT074620 (SLJ) y de Subvenciones del NIH R01NS245014 (SLJ).

1. Preparación de los reactivos <ol><li> Descongele Matrigel en hielo, dejando tiempo suficiente antes del experimento (no acelerar el proceso de calentamiento activo). Matrigel se utiliza para establecer un entorno 3D muy parecidas a una matriz extracelular propicio para la migración de las células. Se provee a las células con los dos mecánicos y un sustrato encierra. Matrigel se almacena congelado a -20 ° C. Antes de su uso, debe ser llevado gradualmente a la temperatura de 0-4 ° C, es decir, descongeladas en hielo o en un refrigerador. Matrigel irreversible conjuntos para formar un gel en la temperatura de incubación (37 ° C). Por lo tanto, no se recomienda para acelerar la descongelación sumergiendo el recipiente en agua caliente. </li><li> Fracciones de proteínas son preparados por isoelectroenfoque (IEF) del extracto de proteína total de la corteza cerebral del día postnatal 0 (P0) hurón. Después de la separación, las fracciones se dializó durante la noche contra 20 mM Tris-HCl pH 7.2 para limpiar los extractos de los componentes de amortiguación de enfoque, que podría ser tóxico para el tejido. </li><li> Sistema de la proteína de entrega. Proteínas extraídas de la corteza cerebral son absorbidos por las gotas de látex fluorescentes que se liberan lentamente de las proteínas a la environment.We declara que la fluorescencia de ayuda en el manejo visual de las microesferas y permite una fácil detección de los efectos secundarios mínimos, incluso desde el lugar de de cuentas de depósito, cuando se observan bajo el microscopio de fluorescencia. <ol class="lalpha"><li> Añadir 10μl de bolas fluorescentes para 100-200μl de solución de proteína </li><li> Incubar durante 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente en un agitador </li><li> Girar las bolas en una centrífuga de mesa durante 1 hora a la velocidad máxima </li><li> Aspirar el sobrenadante </li><li> Vuelva a suspender en un vórtice con 10μl de medio fresco </li><li> Añadir 30μl de Matrigel a la suspensión, mezcle bien y coloque en el hielo. </li></ol></li><li> Tampones y medios <ol><li> Preparar y esterilizar filtración-líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF, NaCl 124 mm, 26 mm de NaHCO3, NaH 2 PO 4 1,2 mm, 3,2 mm de KCl, MgSO4 1,2, CaCl2 2,4, glucosa 10 mM). Sobornos a congelar la LCRa de antemano, para que esté listo en el momento de la disección de los tejidos. Para hacerlo, coloque un recipiente de plástico llena de LCRa estéril en un congelador -80 ° C. Monitor de congelación de vez en cuando, así que cuando una capa de hielo se acumula en el interior de la pared, se rompen y se mezclan con el líquido. Repita hasta que el frasco contiene sobre todo un hielo derretido. Tampón preparado de esta forma no sólo es compatible con la supervivencia del tejido, sino que también llevará a cabo a baja temperatura ya, y es mecánicamente menos perjudiciales para el tejido de los cubos de hielo en trozos. </li><li> Preparar el medio Neurobasal con N-2 y B-27 suplementos agregados de acuerdo a las sugerencias del fabricante, así como 1mg/100ml gentamicina, 2 mM L-glutamina, y el 0,6% de glucosa. Esterilizar por filtración a través de una membrana de 0.22μm. Mantener caliente a 37 ° C hasta su uso. </li></ol></li><li> Placas de cultivo <ol class="lalpha"><li> La cultura material de plástico de seis placas son preparados por que salpican cada pozo en el centro con una pequeña cantidad (alrededor de 2μl) de Matrigel frío con 20μl punta de la pipeta, y la colocación de un autoclave cubreobjetos circular de vidrio de 18 mm en cada gota. Ni las placas ni cubres la necesidad de ser de otra manera cultivo tratado. </li></ol></li></ol> 2. Preparación de tejidos <ol><li> La obtención del tejido cerebral <ol class="lalpha"><li> Después de anestesiar al animal profundamente con Euthasol, retirar el cerebro y colocarlo en el helado LCRa </li><li> Separar los hemisferios con un bisturí y corte coronal a 500μm con un dispositivo de su elección, recoger las rebanadas en un plato pequeño con helado LCRa </li></ol></li><li> Explantes de decisiones (uso de microscopio de disección) <ol class="a"><li> Identifique los segmentos que contienen las eminencias ganglionares (GE) y las regiones de corte de la corteza que pueden curvarse sobre GE e interferir con otras medidas </li><li> Pulse una Harris Uni-Core dio en el área cerca de la superficie ventricular de GE, se retracte de un núcleo que contiene principalmente una zona ventricular, y lo expulsan con un émbolo en el medio helada (Fig. 1). De tres a cuatro explantes de 0,5 mm de diámetro se pueden hacer de la GE en una sola porción del cerebro P0 hurón. Tenga en cuenta que tanto en roedores y hurones, el GE medial y lateral se fusionan en esta edad. Si un núcleo se mantiene en el sector o está pegada a la parte inferior de plástico de la antena, se movilizan por chorros LCRa con una punta de la pipeta y transferir con una pipeta en el recipiente que contiene medio Neurobasal frío. Mantener el plato en hielo. </li><li> La transferencia de un lote de explantes del medio en una gran caída de helado de Matrigel (alrededor de 0,25 0,5 ml) colocados en un plato separado, teniendo cuidado de que los explantes totalmente sumergido y evitar burbujas. Mantener el plato en hielo. El tamaño de un lote depende de la velocidad de las aguas abajo del flujo de trabajo. </li></ol></li></ol> 3. Configuración de la cultura (el uso microscopio de disección) <ol><li> Siempre mantenga Matrigel y Matrigel que contienen mezclas de hielo para evitar la polimerización. </li><li> Remix de la suspensión de bolas y el lugar 1-2μl o menos de la suspensión de bolas de helado de Matrigel en el centro de un cubreobjetos colocado previamente en una placa de cultivo y con una punta de pipeta 20μl. Deje que se asiente un poco, evitar que se seque. </li><li> El uso de un 20μl punta de la pipeta recoger dos explantes de la caída de Matrigel y colocarlos en las cercanías deseada del depósito de cuentas (por lo menos 1 mm de distancia desde el borde del depósito) simétricamente en los lados opuestos. Dejar reposar durante no más de 5 minutos a temperatura ambiente. El momento adecuado de los pasos byc es fundamental. Si el tiempo es demasiado corto que dará lugar a la gelificación incompleta y los componentes de la configuración de la cultura se mueven cuando están cubiertas con la capa final de Matrigel, si el tiempo es demasiado largo puede dar lugar a un exceso de secado del gel y la creación de barreras físicas que impidan la libre circulación de las células. </li><li> Cubrir las cuentas y el explante con una capa plana de unos 30μl de Matrigel, que se extiende más allá de los explantes (Fig. 2). Deje que se asiente en la incubadora durante unos 15 minutos. </li><li> Añadir 2 ml de medio Neurobasal con suplementos. </li><li> Se incuba a 37 ° C en el 5% de CO 2 / O 2 95% la actividad de control migratorio al día. </li></ol> 4. Imágenes en vivo <ol><li> Después de la incubación durante 3-4 días, revisar las placas de cultivo y elegir cubreobjetos de interés. Los explantes debe generar una nube radialmente uniforme de las células. Vuelva a colocar cubreobjetos elegido en una placa de cultivo fresco que se utilizará en la imagen en vivo. </li><li> Deje que el cubreobjetos se sientan en la nueva placa durante la noche. Antes de colocar la placa en el microscopio en busca de imágenes, en una campana de cultivo celular, use una espátula estéril para mover el cubreobjetos con el fin de liberar las microburbujas que se acumulan entre el cubreobjetos y la placa de cultivo celular. La interferencia de las burbujas de arruinar las imágenes. Mover el cubreobjetos en el centro del pozo. </li><li> Para evitar la evaporación, llenar el espacio entre los pozos de agua. </li><li> Con cuidado, la transferencia de la placa de la campana de cultivo de células al microscopio como para no mover el cubreobjetos del centro del pozo. </li><li> Definir un esquema de imágenes utilizando el software de imágenes. Debido a la naturaleza 3D de la configuración de la cultura de las células también se mueven verticalmente, por lo tanto, es importante recoger Z-aviones que abarca toda su profundidad de la nube de la migración. En la medida XY del área observada también se debe establecer lo suficientemente grande como para cubrir áreas que prometen ser poblado por células que migran durante el transcurso de la grabación, y para contener el depósito de cuentas a fin de registrar una orientación angular del explante y la migración de las células en relación con la fuente de la proteína. Además, consideran que los planos Z más imágenes, o el área cubierta más, cuanto más tiempo se tarda en grabar un ciclo en un momento determinado punto, obligando a los intervalos de tiempo más largo entre las muestras y una pérdida de resolución temporal de seguimiento de la célula. En nuestro caso, utilizando un objetivo de 10x, el esquema óptimo era una grabación de baldosas de 3x3 para cada una de las 10 Z-aviones separados cada 20μm, a intervalos de 30 minutos. Encontramos intervalos de 30 minutos más largo que permite la identificación inequívoca de las células en los puntos de tiempo consecutivos, lo cual es fundamental para el seguimiento confiable de sus movimientos. </li><li> Iniciar imagen de lapso de tiempo. </li><li> Después de la hora deseada, retirar la placa y fijar las culturas en el 4% de tampón fosfato de paraformaldehído. Puede ser usado para su posterior análisis morfológico e inmunocitoquímico. </li></ol> 5. Análisis del movimiento <ol><li> Convertir las series temporales de imágenes grabados en un formato más conveniente para su posterior procesamiento, TIFF es el más portátil. </li><li> Seguir el movimiento de las células individuales en el tiempo mediante el registro de coordenadas XY. Esto se puede hacer usando software libremente disponible como ImageJ (NIH), con un seguimiento manual de plug-in, o cualquier otra aplicación comercial, como ImagePro, Volicity o AutoQuant. </li><li> Parcela las pistas usando Excel o en la casa de software desarrollados. </li><li> Para cada celda de seguimiento calcular los parámetros cinéticos como la velocidad media, la curvatura de la trayectoria, la variabilidad de dirección con el tiempo, la ramificación, la desviación hacia la fuente de proteínas, cálculos, etc se puede hacer en MS Excel o cualquier hoja de cálculo equivalente. Nuestra experiencia indica sin embargo que es mucho más productivo para desarrollar scripts de la casa (con R, Matlab, Python, Perl u otros lenguajes, en su mayoría de origen abierto), ya que permiten una mayor personalización flexible y la inclusión de los métodos analíticos más sofisticados que los disponibles en una instalación básica de Excel. </li></ol> 6. Los resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Diagrama de la anatomía origin de los explantes. Este es un dibujo de un corte coronal del cerebro de un hurón hemiseccionada. Los círculos grises indican la región de la cual los explantes fueron tomadas. <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Diagrama de una configuración de la cultura. El depósito de cuentas es la fuente de proteínas, los explantes se colocan a ambos lados y todos los elementos están cubiertos de Matrigel. <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Parcelas correspondientes de las pistas de células de color por cuadrantes (flechas apuntan hacia el depósito de cuentas). Las pistas de celda de la derecha están migrando hacia la fracción D, que parece atraer a las células, las células de la izquierda están migrando hacia la fracción A, que parece repeler a las células que migran. <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. A) Una serie de imágenes de puntos de tiempo seleccionados muestran una nube cada vez mayor de células que migran a partir de un explante. Una célula de ejemplo, indica con una flecha, se hace un seguimiento a través del tiempo, como se indica a continuación (barra de escala 200μm). Este explante se visualiza con imágenes en vivo de 38 h. Aquí se muestran imágenes de las células dejando el explante desde el comienzo de la grabación de las imágenes a la imagen final. B) La celda indicada en la parte A en el momento indicado. La celda muestra repetitivo de ramificación (barra de escala 50 micras).

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	<li>Caviness, V. S., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cortical+development:+a+view+from+mutations+in+mice.">Mechanisms of cortical development: a view from mutations in mice.</a> Annu. Rev. Neurosci. 1, 297-326 (1978).</li><li>Gelman, D. M., Martini, F. J., N&#243;brega-Pereira, S., Pierani, A., Kessaris, N., Mar&#237;n, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+preoptic+area+is+a+novel+source+of+cortical+GABAergic+interneurons.">The embryonic preoptic area is a novel source of cortical GABAergic interneurons.</a> J. Neurosci. 29, 9380-9389 (2009).</li><li>Hasling, T. A., Gierdalski, M., Jablonska, B., Juliano, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+radialization+factor+in+normal+cortical+plate+restores+disorganized+radial+glia+and+disrupted+migration+in+a+model+of+cortical+dysplasia.">A radialization factor in normal cortical plate restores disorganized radial glia and disrupted migration in a model of cortical dysplasia.</a> Eur. J. Neurosci. 17, 467-780 (2003).</li><li>Hirschberg, A., Deng, S., Korostylev, A., Paldy, E., Costa, M. R., Worzfeld, T., Vodrazka, P., Wizenmann, A., G&#246;tz, M., Offermanns, S., Kuner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+deletion+mutants+reveal+a+role+for+semaphorin+receptors+of+the+plexin-B+family+in+mechanisms+underlying+corticogenesis.">Gene deletion mutants reveal a role for semaphorin receptors of the plexin-B family in mechanisms underlying corticogenesis.</a> Mol. Cell Biol. 30, 764-780 (2010).</li><li>Hatten, M. 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J., Valiente, M., L&#243;pez Bendito, G., Szab&#243;, G., Moya, F., Valdeolmillos, M., Mar&#237;n, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biased+selection+of+leading+process+branches+mediates+chemotaxis+during+tangential+neuronal+migration.">Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration.</a> Development. , 136-1341 (2009).</li><li>N&#243;brega-Pereira, S., Kessaris, N., Du, T., Kimura, S., Anderson, S. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+interneuron+migration+in+a+ferret+model+of+cortical+dysplasia.">Alteration of interneuron migration in a ferret model of cortical dysplasia.</a> Cereb Cortex. 18, 78-92 (2008).</li><li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+neural+cell+migration.">Principles of neural cell migration.</a> Experientia. 46, 882-891 (1990).</li><li>Riddle, D. R., Katz, L. C., Lo, D. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+cortical+interneuron+subtypes.">Origins of cortical interneuron subtypes.</a> J. Neurosci. 24, 2612-2622 (2004).</li></ol>

El uso de animales: Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo a las directrices del NIH y USUHS institucional y aprobado por el IACUC USUHS.

Aquí presentamos un sistema sencillo para estudiar y analizar el comportamiento migratorio de las células neuronales en respuesta a señales químicas. En los ensayos de migración in vitro se han utilizado para identificar las moléculas extracelulares que afectan a la locomoción de las células. Nuestro paradigma asegura que cada célula individual tiene un estudio de 3 dimensiones (3D) de medio ambiente con los que interactuar. Es una ventaja considerable sobre las culturas en las células que migran fuera de los explantes se ven obligados a desplazarse sobre la superficie plana de poli-D-lisina cubreobjetos, por lo tanto carente de interacciones con la matriz extracelular (por ejemplo, Hirschberg et al &#39;10;. 8. Metin et al. &#39;07). Sin embargo, con respecto a la mayor escala de seguimiento de la migración de las células, se mantiene en 2 dimensiones, ya que las células están verticalmente limitada al espacio entre el portaobjetos de vidrio en el fondo y la superficie superior de Matrigel, que es relativamente delgado en comparación a la libertad horizontal de la migración. Esta configuración permite un fácil análisis del movimiento, que sigue siendo esencialmente dos dimensiones. Similares paradigmas en 3D que consiste en explantes de GE o volver a los agregados de células de GE incorporado en el colágeno o Matrigel, fueron empleados con anterioridad, con los agregados de células que expresan una proteína de señalización como fuente de señales químicas (por ejemplo, Liodis et al &#39;07;. Martini et .. al &#39;09;. Nóbrega-Pereira et al 08; Wichterle et al &#39;03).. El método que aquí se presenta utiliza un sistema de liberación lenta en forma de bolas de látex con las proteínas adheridas a permitir un nivel constante en el entorno local, que es superior a las proteínas añadido directamente al medio, haciendo el sistema especialmente indicado cuando la cantidad de espacio disponible la proteína es limitada o cuando una mezcla compleja de proteínas es la prueba. La elección de cuentas no se limita a los productos a base de látex, e incluye también otros materiales, por ejemplo, bolas de agarosa, cada uno con características diferentes. Para aumentar aún más la densidad del ensayo, se utilizaron dos explantes adosados ​​a la cuentas de depósito en los lados opuestos. Para asegurar un área específica de origen, se ha utilizado explantes ganglionares eminencia como fuente de células. Se evaluaron las diferencias en las porciones medial y lateral de la eminencia ganglionar, pero no veo ninguna diferencia. Debemos señalar que este estudio utiliza los hurones, en esta especie las eminencias ganglionares medial y lateral del fusible antes que en los roedores (Poluch et al 08.). En el momento de las culturas se hicieron (P0) las eminencias ganglionares medial y lateral se fusionaron, aunque muchas células que pueblan la corteza cerebral están siendo generados y la migración. Sin embargo, si una fuente verdaderamente homogénea de las células se prefiere, una suspensión de células se pueden preparar a partir de los tejidos disecados y mezclarse directamente con el Matrigel, o bien girar hacia abajo y un pellet resultante perforadas para hacer &#39;explantes. El uso de la digestión enzimática de tejidos para preparar la suspensión de células no es recomendable, incluso para las trazas residuales de la actividad proteolítica se puede licuar Matrigel en el transcurso del experimento. Además, una debida diligencia se debe aplicar al momento de la configuración de la cultura. A pesar de Matrigel requiere un período de calentamiento para polimerizar, incluso un período ligeramente extendida de la exposición de pequeñas gotas de Matrigel (empleado en el presente protocolo) para el aire hace que el secado y los resultados en una cáscara que es impenetrable a la migración de las células y que no se pueden borrar cubriendo posterior con Matrigel fresco.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </td><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> Media Neurobasal (1X), líquido </td><td> Invitrogen </td><td> 21103-049 </td><td></td></tr><tr><td> Suplemento N-2 (100X), líquido </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td></td></tr><tr><td> B-27 Suplemento (50 veces) </td><td> Invitrogen </td><td> 0080085-SA </td><td></td></tr><tr><td> Sótano BD Matrigel membrana Matrix </td><td> BD Biosciences </td><td> 354234 </td><td></td></tr><tr><td> Harris Uni-Core, el tamaño de 0,5 mm </td><td> Microscopía electrónica de Ciencias </td><td> 69036-05 </td><td> Golpe tenía </td></tr><tr><td> Verde Retrobeads IX </td><td> Lumafluor, Inc. </td><td></td><td> Microesferas de látex </td></tr></tbody></table>

migratory behavior of cells generated in ganglionic eminence cultures

Migración de las células es un proceso común que lleva al desarrollo y la maduración del sistema nervioso central de vertebrados (Hatten, 99). La corteza cerebral se compone de dos tipos básicos neuronales: excitación e inhibición. Estas células se originan en áreas distintas y migran hacia la corteza a lo largo de diferentes rutas (Pearlman et al., 98). Interneuronas inhibitorias migran tangencialmente de las fuentes subcortical, en su mayoría provenientes de diferentes regiones de las eminencias ganglionares (Gelman et al, 09;. Xu et al, &#39;04.). Su movimiento requiere un control preciso espacio-temporales impuestas por los estímulos ambientales, para permitir el establecimiento de la citoarquitectura adecuada y la conectividad de la corteza cerebral (Caviness y Rakic, 78; Hatten, 90; Rakic, 90). Para estudiar el comportamiento migratorio de las células generadas en las zonas de proliferación de las eminencias ganglionares (GE) en hurones nacidos in vitro se utilizó un arreglo de tres dimensiones en la cultura de una matriz BD Matrigel. La configuración de la cultura consiste en dos explantes de GE y una fuente de proteínas de prueba extraída de la corteza cerebral y adsorbido a fluorescentes de látex IX Retrobeads situado entre los explantes (Hasling et al, &#39;03. Riddle, et al, 97.). Después de 2-3 días de cultivo, las células comienzan a aparecer en el borde del explante mostrando una tendencia a dejar el tejido en una dirección radial. En vivo de imágenes permitió a la observación de los patrones migratorios, sin necesidad de etiquetado o marcado de las células. Cuando se expone a las fracciones de la proteína de extracto obtenido de la corteza hurón isochronic, las células de GE muestra comportamientos diferentes, a juzgar por el análisis cuantitativo cinética de las células individuales en movimiento.

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Migratory Behavior of Cells Generated in Ganglionic Eminence Cultures

Imagen de lapso de tiempo de cultivo de tejidos en 3D permite estudiar el comportamiento migratorio de las células individuales procedentes de la eminencia ganglionar en la reacción para extraer proteínas fraccionadas de la corteza cerebral.

Comportamiento migratorio de las células generadas en las culturas eminencia ganglionar

Migration of cells is a common process that leads to the development and maturation of the vertebrate central nervous system (Hatten, '99). The cerebral ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.9K vistas.  Uniformed Services University. Imagen de lapso de tiempo de cultivo de tejidos en 3D permite estudiar el comportamiento migratorio de las células individuales procedentes de la eminencia ganglionar en la reacción para extraer proteínas fraccionadas de la corteza cerebral.

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Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Grabaciones solo Sensillum en los insectos Drosophila melanogaster Y Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Investigación

Neurociencias

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly enriched neuronal cultures. For this protocol the freezing medium used is 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) diluted in Hank's Buffered Salt Solution (HBSS). Blocks of cortical tissue are transferred to cryovials containing the freezing medium and slowly frozen at -1&deg;C/min in a rate-controlled freezing container. Post-thaw processing and dissociation of frozen tissue blocks consistently produced neuronal-enriched cultures which exhibited rapid neuritic growth during the first 5 days in culture and significant expansion of the neuronal network within 10 days. Immunocytochemical staining with the astrocytic marker glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the neuronal marker beta-tubulin class III, revealed high numbers of neurons and astrocytes in the cultures. Generation of neural precursor cell cultures after tissue block dissociation resulted in rapidly expanding neurospheres, which produced large numbers of neurons and astrocytes under differentiating conditions. This simple cryopreservation protocol allows for the rapid, efficient, and inexpensive preservation of cortical brain tissue blocks, which grants increased flexibility for later generation of neuronal, astrocyte, and neuronal precursor cell cultures.

Here, we describe a method for efficient cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly enriched neuronal cultures. This simple protocol provides flexibility for later generation of neuronal, astrocyte, and neuronal precursor cell cultures.

La criopreservación de tejido cortical Bloques para la generación de cultivos neuronales altamente enriquecido

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Células vivas imágenes de células de los órganos sensoriales Precursor en Intacto Drosophila Las pupas

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Optogenético estimulación de comportamiento de escape en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling of auditory axons within the VIIIth cranial nerve would enhance the study of central auditory circuit development. This approach is challenging because multiple sensory organs of the inner ear contribute to the VIIIth nerve 1. Moreover, markers that reliably distinguish auditory versus vestibular groups of axons within the avian VIIIth nerve have yet to be identified. Auditory and vestibular pathways cannot be distinguished functionally in early embryos, as sensory-evoked responses are not present before the circuits are formed. Centrally projecting VIIIth nerve axons have been traced in some studies, but auditory axon labeling was accompanied by labeling from other VIIIth nerve components 2,3. Here, we describe a method for anterograde tracing from the acoustic ganglion to selectively label auditory axons within the developing VIIIth nerve. First, after partial dissection of the anterior cephalic region of an 8-day chick embryo immersed in oxygenated artificial cerebrospinal fluid, the cochlear duct is identified by anatomical landmarks. Next, a fine pulled glass micropipette is positioned to inject a small amount of rhodamine dextran amine into the duct and adjacent deep region where the acoustic ganglion cells are located. Within thirty minutes following the injection, auditory axons are traced centrally into the hindbrain and can later be visualized following histologic preparation. This method provides a useful tool for developmental studies of peripheral to central auditory circuit formation.

Here we describe a microdissection technique followed by fluorescent dye injection into the acoustic ganglion of early chick embryos for selective tracing of auditory axon fibers in the nerve and hindbrain.

Rastreo Selectivo de Fibras auditivo en el nervio vestíbulo coclear aviar embrionarias

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

Un procedimiento para el implante Cámara Espinal para Longitudinal<em&gt; En Vivo</em&gt; Imágenes de la médula espinal de ratón

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Assays to Detect UV-reflecting Structures and Determine their Importance in Mate Preference using the Sailfin Molly Poecilia latipinna

Many organisms use cues and signals beyond human sensitivity during social interactions. It is important to take into account how organisms perceive their worlds when trying to understand their behavior and ecology. Sensitivity to the ultraviolet spectrum (UV; 300 - 400 nm) is found across multiple genera of birds, fish, reptiles, amphibians, and even mammals. This protocol describes a technique for examining organisms for the presence of UV-reflecting structures and a method for testing whether these cues are used as social signals in the context of mate choice. A spectrophotometer is used to detect the presence of UV reflectance and variation in reflective intensity between individuals and sexes. An example of this technique is presented in which a dichotomous mate choice test exposes sexually receptive individuals to opposite sex individuals whose visual appearance can be manipulated by filters that either transmit full spectrum or block UV wavelengths. This system allowed for the determination that female, but not male, sailfin mollies (Poecilia latipinna) were using UV markings as part of their mating decisions. These types of studies serve to expand our knowledge of the range of organisms that utilize UV and provide insight into how UV plays a role in their lives.

Assays to Detect UV-reflecting Structures and Determine their Importance in Mate Preference using the Sailfin Molly Poecilia latipinna

This protocol outlines the use of spectrophotometry to detect ultraviolet-reflecting structures on organisms (in this example, the sailfin molly Poecilia latipinna) and describes dichotomous choice tests for fish that allow inferences to be made on the role of ultraviolet cues during mate selection.

Los ensayos para detectar estructuras que refleja los rayos UV y determinar su importancia en la selección del compañero usando el Sailfin Molly<em&gt; Poecilia Poeci</em

Many organisms use cues and signals beyond human sensitivity during social interactions. It is important to take into account how organisms perceive their ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

Measuring and Manipulating Functionally Specific Neural Pathways in the Human Motor System with Transcranial Magnetic Stimulation

Understanding interactions between brain areas is important for the study of goal-directed behavior. Functional neuroimaging of brain connectivity has provided important insights into fundamental processes of the brain like cognition, learning, and motor control. However, this approach cannot provide causal evidence for the involvement of brain areas of interest. Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a powerful, noninvasive tool for studying the human brain that can overcome this limitation by transiently modifying brain activity. Here, we highlight recent advances using a paired-pulse, dual-site TMS method with two coils that causally probes cortico-cortical interactions in the human motor system during different task contexts. Additionally, we describe a dual-site TMS protocol based on cortical paired associative stimulation (cPAS) that transiently enhances synaptic efficiency in two interconnected brain areas by applying repeated pairs of cortical stimuli with two coils. These methods can provide a better understanding of the mechanisms underlying cognitive-motor function as well as a new perspective on manipulating specific neural pathways in a targeted fashion to modulate brain circuits and improve behavior. This approach may prove to be an effective tool to develop more sophisticated models of brain-behavior relations and improve diagnosis and treatment of many neurological and psychiatric disorders.

This article describes new approaches to measure and strengthen functionally specific neural pathways with transcranial magnetic stimulation. These advanced noninvasive brain stimulation methodologies can provide new opportunities for the understanding of brain-behavior relations and development of new therapies to treat brain disorders.

Medición y manipulación de vías neuronales funcionalmente específicas en el sistema motor humano con estimulación magnética transcraneal

Understanding interactions between brain areas is important for the study of goal-directed behavior. Functional neuroimaging of brain connectivity has ...

Combining Behavior and EEG to Study the Effects of Mindfulness Meditation on Episodic Memory

Although there has been recent interest in how mindfulness meditation can affect episodic memory as well as brain structure and function, no study has examined the behavioral and neural effects of mindfulness meditation on episodic memory. Here we present a protocol that combines mindfulness meditation training, an episodic memory task, and EEG to examine how mindfulness meditation changes behavioral performance and the neural correlates of episodic memory. Subjects in a mindfulness meditation experimental group were compared to a waitlist control group. Subjects in the mindfulness meditation experimental group spent four weeks training and practicing mindfulness meditation. Mindfulness was measured before and after training using the Five Facet Mindfulness Questionnaire (FFMQ). Episodic memory was measured before and after training using a source recognition task. During the retrieval phase of the source recognition task, EEG was recorded. The results showed that mindfulness, source recognition behavioral performance, and EEG theta power in right frontal and left parietal channels increased following mindfulness meditation training. In addition, increases in mindfulness correlated with increases in theta power in right frontal channels. Therefore, results obtained from combining mindfulness meditation training, an episodic memory task, and EEG reveal the behavioral and neural effects of mindfulness meditation on episodic memory.

Here we present a protocol for combining mindfulness meditation training, an episodic memory task, and EEG to understand the behavioral and neural effects of mindfulness meditation on episodic memory.

Combinación de comportamiento y EEG para estudiar los efectos de la meditación de atención plena en la memoria episódica

Although there has been recent interest in how mindfulness meditation can affect episodic memory as well as brain structure and function, no study has ...