Este método permite un análisis transcriptómico de una población celular rara de la glándula accesoria masculina Drosophila, llamada células secundarias, y descubre genes que las hacen críticas para el éxito reproductivo. En el transcurso de un día, esta técnica permite la clasificación de células secundarias de diferentes genotipos y la extracción del ARN total para la secuenciación posterior de qPCR o ARN. A veces los proyectos están limitados por la rareza del material inicial.
Este método puede proporcionar la base para otros grupos que enfrentan el desafío de trabajar con una población de células raras. Debido a que el procedimiento necesita acumular 40 glándulas, es importante practicar las disecciones. Preparar las puntas caseras de las pipetas también es importante, por lo que debe visualizarlo en el vídeo cómo hacerlo y prepararse con antelación.
Antes de comenzar el procedimiento, corte y enrólla las puntas de 200 microlitros para manipular las glándulas y pase la abertura de la punta de múltiples puntas de 1.000 microlitros cerca de una llama durante menos de un segundo para estrechar las aberturas. A continuación, ordene las puntas modificadas de más estrechas a más anchas en función de su velocidad de aspiración. Para la disección de la glándula accesoria, coloque 20 a 25 Drosophila macho en una placa de vidrio sobre hielo, y use fórceps y un microscopio de disección para eliminar el tracto reproductivo de una mosca masculina.
Limpie el par de glándulas accesorias de todos los demás tejidos, incluidos los testículos y la bombilla eyaculatoria, y transfiera las glándulas accesorias a una placa de vidrio que contenga un medio suplementado con suero a temperatura ambiente. Cuando se hayan recogido 20 pares de glándulas accesorias, lave las glándulas en un plato de PBS durante uno a dos minutos a temperatura ambiente. Al final del lavado, transfiera las glándulas a una solución de disociación recién preparada y utilice fórceps afilados bajo un microscopio diseccionado para pellizcar firmemente el medio de un lóbulo glandular.
Usando un segundo par de fórceps, corte el tejido con la punta afilada para separar la región proximal de la glándula accesoria y el conducto eyaculatorio de la porción de la glándula que contiene las células secundarias. Corte las glándulas para que las peptidasas puedan llegar a las células que de otro modo están protegidas por la capa muscular externa y por el líquido seminal viscoso en el lumen de la glándula. A continuación, utilice una punta de pipeta pre-húmeda, redondeada contra llamas, ancha y de 200 microlitros para transferir las glándulas a un tubo de 1,5 mililitros.
Para la digestión de tejidos, coloque el tubo en una coctelera celsius de 37 grados durante 60 minutos a 1.000 rotaciones por minuto. Al final de la incubación, detenga la digestión con un mililitro de medio suplementado con suero, y utilice una punta de pipeta pre-húmeda, redondeada a la llama, ancha, de 1.000 microlitrólitro para transferir las muestras a una placa de 24 pocillos. Compruebe las células para su expresión de GFP bajo un microscopio fluorescente.
La mayoría de las puntas de las glándulas deben verse intactas, y algunas células secundarias deben separarse. Utilice una punta de pipeta redondeada, estrecha, de 1.000 microlitrotro para triturar suavemente las células de tres a cinco veces para interrumpir el tejido de la glándula accesorio. Luego, utilice una punta de pipeta muy estrecha, redondeada, de 1.000 microlitros de una a dos veces para individualizar las células.
Deje que las células se asienten durante 15 minutos. Confirme que las células aparecen sanas bajo el microscopio y elimine el exceso de medio. Luego, transfiera las células a un nuevo tubo de 1,5 mililitros, y enjuague los pozos con un medio fresco para recuperar las células restantes.
La construcción Abd-B-GAL4 se puede utilizar en estos experimentos para etiquetar celdas secundarias pero no principales con GFP. En este estudio, ambos tipos de células se clasificaron de glándulas accesorias mutantes de tipo salvaje e iab-6cocuD1. Este mutante D1 carece de la expresión de transcripciones Abd-B y MSA, que afectan el desarrollo, morfología y función de las células secundarias.
Después de la disociación celular, FACS se utiliza para seleccionar celdas vivas basadas en DRAQ7, y el nivel de fluorescencia GFP se utiliza para aislar las células secundarias y las células principales. El ARN se extrae de cada población celular y se ajusta a dos nanogramos por muestra para la posterior RT-qPCR y la secuenciación. La cuantificación de la expresión de genes específicos mediante PCR cuantitativo en tiempo real en extractos de células principales y secundarias de tipo salvaje revela que los genes celulares secundarios Rab19 y MSA se detectan únicamente a partir de extractos celulares secundarios, mientras que el péptido sexual del gen de células principal sólo se detecta a partir de muestras de células principales.
El análisis de componentes principales en los datos de secuenciación de ARN de tres réplicas de tipo salvaje y tres mutantes revela que el tipo comodín replica ambos clústeres juntos entre sí y lejos de las muestras mutantes. Visualizar lecturas alineadas con genes particulares muestra que los genes de limpieza como la actina 5C, y los genes secundarios específicos de las células Rab19 y Dve se expresan en ambos genotipos. Para la MSA, sin embargo, la fuerte expresión del gen observado en las moscas de tipo salvaje se pierde en las cepas mutantes.
Obtener suficientes células secundarias disociadas vivas es importante para un procedimiento exitoso. Por lo tanto, verifique el protocolo de disección y disociación en experimentos a pequeña escala. Este método permite la clasificación de ambos tipos de células de glándula accesoria de un pequeño número de moscas, lo que permite el estudio de cómo esas células reaccionan transcripcionalmente a múltiples condiciones genéticas o ambientales.
Se sabe que el éxito reproductivo masculino se ve afectado por muchas cosas, como el genotipo, la edad y el estado de apareamiento. La facilidad de este método debe permitirnos investigar cómo estos factores afectan la transcripción de la glándula accesoria.
