Este trabajo fue apoyado por el Institut National de la Santé et de la Recherche Medicale, el Centre National de la Recherche Scientifique, la Universidad de Estrasburgo, el Hôpital de Estrasburgo, la Asociación pour la Recherche sur le Cáncer, el Institut National du Cancer, la Agence Nationale de la Recherche y la región de Alsacia. Pietro Laneve ha recibido el apoyo de la Fondation pour la Recherche Médicale. Actualmente, es un receptor de un Istituto Italiano Tecnologia (IIT) de becas. Costos de publicación son apoyados por la red Neurex (TriNeuron - Programa Interreg IV Alto Rin)

1. Sample Collection <ol><li> Separe 2 células semi-adherente de Schneider, (1.5 x 10 6 células por término medio), con la pipeta y cosecharlas por centrifugación (100 xg durante 1 min). En el caso de las células adherentes cultivadas in vitro, trypsinize en condiciones estándar o directamente a partir de placas recogerlas en una cantidad conveniente de reactivo de extracción de ARN, con la ayuda de un rascador de células. </li><li> Para la recogida de embriones, crecer cepas de Drosophila en jaulas de moscas y deja embriones se acumulan en las placas de puesta de huevos. Limpie los embriones fuera por un pincel en agua destilada (DH 2 O), desechar los residuos por el tamiz de filtrado, enjuague y recuperar los embriones en un vial 48. </li><li> Como una técnica alternativa, diseccionar manualmente tejidos / órganos. Aislar testículos (un sistema preferencial para el análisis piRNA) de Drosophila abdomen en solución salina tamponada con fosfato (PBS) bajo un estereomicroscopio (aumento 20X), mediante el uso de agujas de disección o fórceps como visdividualizado en Sullivan et al 49. </li><li> Maja homogeneizar muestras sobre la adicción de 0,5 volúmenes de reactivo de extracción de RNA. </li></ol> 2. Extracción de ARN / Análisis <ol><li> Siguiendo las instrucciones de los fabricantes realizan el aislamiento de ARN a través de reactivos comerciales. PRECAUCIÓN! Agentes de extracción de ARN suelen ser tóxicos y cáusticos. Alternativamente, aplicar un protocolo basado en proteinasa K para el aislamiento de ARN 50, como sigue: <ol><li> Diluir las muestras en 400 l de parada Mezclar e incubar a TA durante 15 min. </li><li> Recuperar componentes hidrosolubles por estándar de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico y cloroformo extracciones y por etanol (EtOH) Precipitación / lavado. Aire secar las muestras y volver a suspender en dietilpirocarbonato (DEPC) tratados con doble destilado (dd) H 2 O. </li></ol></li><li> Evaluar la concentración de ARN mediante medición espectrofotométrica UV. También garantizar la pureza del ARN es alto, cerca de 2.0, based en A 260 / A 280 lectura. </li><li> Compruebe preparación de ARN en gel desnaturalizante de agarosa como sigue: <ol><li> En un vaso de precipitados limpio, disolver 1,2 g de agarosa en 82 ml de DEPC-ddH 2 O, bajo agitación continua. Hervir hasta que se disuelva por completo. </li><li> Deje que la solución de gel se enfríe; cuando la temperatura alcanza los 60 ° C Añadir 10 ml de ácido 4-10X morfolinopropanosulfónico (MOPS) buffer de 1X concentración final (FC), y 8 ml de formaldehído al 37% al 3% FC. PRECAUCIÓN! El formaldehído es un carcinógeno. </li><li> Verter el gel en una célula de electroforesis horizontal. Deje que el gel se solidifique en una campana durante al menos 1 hora. Después de la solidificación, sumergir el gel en MOPS 1X. </li><li> Alícuota 2 g de muestra de ARN y 1 g de Escalera (utilice un marcador de ARN cuando se desea una evaluación precisa). Añadir 3 volúmenes de carga de tintes de agarosa (ALD) para ARN y para escalera. Calentar a 70 ° C durante 5 min e inmediatamente enfriar en hielo. CAUCIÓN! Contenido de ALD (bromuro de etidio y formamida, ver Materiales) son mutágenas y corrosivo, respectivamente. </li><li> Cargar las muestras y correr el gel a 50 V durante aproximadamente 1 hora con el reciclaje tampón ocasional. Compruebe el patrón de ARN fraccionamiento mediante visualización UV o de imágenes de gel. Reconocer bandas discretas correspondientes a 28S y 18S ARNr y al ARNt (véase la Figura 1). </li></ol></li><li> Continúe con el Ensayo del Norte o tienda de ARN a -80 ° C. </li></ol> 3. desnaturalización acrilamida Preparación del gel <ol><li> Use un pequeño aparato vertical de electroforesis para esta etapa de fraccionamiento (tamaño de la placa alrededor de 8 cm x 9 cm, peine espesor 0,75 mm). </li><li> Ensamble vasos limpios juntos en una estructura de fundición. </li><li> Preparar 10 ml de 10% de acrilamida / bis-acrilamida (19: 1) solución en MOPS 1X, 7 M de urea. Inmediatamente antes de verter, añadir 100 l de persulfato de amonio al 10% y 10 l de TEMED y mezclar rápidamente la solución. PRECAUCIÓN! Acrilamida es neurotóxica y carcinógeno. </li><li> Verter el gel entre placas de vidrio e insertar el peine bien cuidado para evitar burbujas. Deje que el gel se polimeriza a temperatura ambiente durante al menos 45 minutos antes de su uso. Alternativamente, guarde el gel S / N, envuelto en papel de filtro empapado con el agua y sellado en papel film. </li></ol> Preparación 4. Muestra <ol><li> Alícuota de 0,5-20 g de ARN total para cada muestra. Si el volumen es superior a 4.3 l, de vacío seque la muestra. </li><li> Para la determinación del tamaño, ejecutar una alícuota (20-30 cps) de la escala de rango bajo radiomarcado en paralelo a las muestras, como un marcador (ver sección 4.3 y 4.4 para la preparación). Tratarlo en paralelo a las muestras, como se describe en el paso 4.5. </li><li> Escalera: creó una reacción directa de fosfato utilizando 0,1 g de una escalera de 10 pb a paso. Incubar a 37 ° C durante 30 min y detener la reacción mediante la adición de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) a 20 mM FC. </li><li> Se purifica por precipitación con EtOH / lavado, secar al aire yresuspender en ddH2O (100 l). PRECAUCIÓN! 32P es una fuente radiactiva. </li><li> Para cada muestra de añadir un volumen igual de colorante azul acrilamida (ABD). Desnaturaliza por calentamiento a 80 ° C durante 5 minutos y enfriar en hielo hasta su embarque. PRECAUCIÓN! Formamida (contenido en ABD) es corrosivo. </li></ol> 5. electroforética Fraccionamiento <ol><li> Retire las placas de vidrio del soporte de fundición y ensamblarlos correctamente en la célula de electroforesis. Llenar ambos cámara interior y exterior con suficiente tampón de desarrollo (RB). </li><li> Retire suavemente el peine y pre-correr el gel a 200 V durante 10 min. Antes de cargar las muestras, lavar los depósitos de urea de los pozos por chorrear algún RB a través de una jeringa. </li><li> Utilice puntas planas para estratificar cuidadosamente las muestras procedentes de la etapa 4.5 en la parte inferior de cada pocillo. Revise las conexiones de ánodo y cátodo para evitar correr invertida. Después de que las muestras de entrar en el gel a 100 V durante 5 min, iaumentar la cant voltaje a 200 V. </li><li> Para una longitud de fraccionamiento de unos 7 cm, a 45 min-largo plazo es suficiente. Evite el azul de bromofenol (un pigmento de seguimiento en ABD) para desbordar el gel. </li><li> Visualizar en gel los ARNs largos fraccionados por bromuro de etidio (EtBr) tinción, como un paso opcional: <ol><li> Cortar 2 cm desde la parte superior del gel y enjuague brevemente la rebanada en ddH 2 O. </li><li> Incubar la rebanada de gel a temperatura ambiente durante 15 min con shacking suave en RB, EtBr 0,5 g / ml FC. </li><li> Destain el gel durante 15 min en RB, visualizar largos rRNAs por irradiación UV o formación de imágenes de gel. Compruebe si hay carga de ARN y la calidad (véase la Figura 1, Panel 7). ATENCIÓN! El bromuro de etidio es un mutágeno. </li></ol></li><li> Mientras tanto proceder secante la parte inferior del gel que contiene pequeñas especies de ARN. </li></ol> 6. Gel Secante <ol><li> Cortar 6 trozos de papel secante para ajustarse al área secante y una pieza equivalente de uncharged membrana de nylon. Humedecer las hojas de papel, membrana y 2 almohadillas de transferencia en RB. Asegúrese de absorber completamente las almohadillas apretando repetidamente en RB. </li><li> Retire el gel del aparato y abrir los vasos por medio de una espátula. Utilice un cortador de limpia para eliminar los pozos. Coloque una hoja de papel Whatman húmedo en el gel y suavemente levántela. </li><li> Coloque la membrana de nylon en la cara libre del gel. Marque una esquina para orientar el filtro de acuerdo con la carga de la muestra. Completa el &quot;sandwich&quot; (3 pedazos de papel a cada lado). Rollo de una varilla de plástico en la superficie de transferencia, para eliminar las posibles burbujas de aire. </li><li> Coloque la mancha entre dos almohadillas de transferencia y luego en el casete secante. Monte el casete en el módulo secante, llenar la cámara con RB y comprobar la orientación correcta (membrana de nylon debe permanecer entre el gel y el terminal positivo). </li><li> Transferir a 20 V durante 20 min. Nota: para garantizar condiciones homogéneas, después de 10 min abrir el módulo secante y rOtate el sándwich por 180 ° antes de completar la transferencia. </li></ol> 7. Membrana reticulación <ol><li> Preparar 6 ml de solución de reticulación fresco (XLS). Saturar a 10 cm x 10 cm (más grande que la membrana de nylon) trozo de papel secante con XLS. PRECAUCIÓN! HCl (un componente de XLS) es altamente corrosivo. </li><li> Desmontar el blot y colocar la membrana sobre el papel de filtro 3MM mojado. Nota: ARN no debe estar en contacto directo con el papel saturado. Coloque el filtro y papel entre dos placas de vidrio y se envuelve en saran-wrap. </li><li> Calentar la membrana a 60 ° C durante 2 horas, seguido de un lavado de ddH2O. Almacenar a -20 ° C o proceder a la hibridación. </li></ol> 8. Membrana Prehibridación <ol><li> Si la carga de ARN se ha comprobado (paso opcional 5.5), vaya directamente a la hibridación. O bien, corte 1 cm de la parte superior del filtro de nylon, para evitar sonda transversal hybridizations a RNAs largos fraccionada. </li><li> Precaliente 10 ml de disolución de hibridación (SA) a 37 ° C. Desnaturalizar 1 mg de esperma de salmón a 95 º C durante 5 minutos, enfriar en hielo y añadir a HS. </li><li> Incubar el filtro en el SA a 37 ° C durante al menos 1 hora, bajo la rotación en un horno de hibridación. Compruebe que el lado de ARN del filtro enfrenta SA. </li></ol> 9. Síntesis de Sonda <ol><li> Configurar una reacción directa de fosfato en 10 pmol de oligonucleótido antisentido específico, como se describe en 4.3. </li><li> Añadir 5 volúmenes de Tris-EDTA-NaCl (TEN) tampón para la reacción y purificar el cebador marcado los nucleótidos no incorporados mediante cromatografía de exclusión en gel en columnas de Sephadex G-25 (o también por precipitación con EtOH). La actividad de la sonda se puede evaluar mediante contador de centelleo líquido. </li></ol> 10. Membrana de hibridación <ol><li> Vuelva a colocar el agotado HS con un fresco 10 ml alícuota (preparada y complementado como se describió anteriormente). Calentar la sonda en95 ° C durante 10 minutos, enfriar en hielo y añadir a la novela del SA. Incubar el filtro a 37 ° C ON. </li></ol> 11. Membrana Lavado <ol><li> Recuperar la solución de hibridación y almacenarla a -20 ° C en una caja de radiactividad-blindaje. </li><li> Enjuague el filtro con tampón de lavado (BM) y lavar a fondo durante 10 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Utilice un detector Geiger Mueller para el control de la radiactividad residual en las esquinas de filtro. Cuando emisión de fondo es de alrededor de 5 cps, proceder a la membrana exposición. </li></ol> 12 Detección de la señal <ol><li> Exponer el filtro en las películas de autorradiografía o en una pantalla de Encendido de imágenes moleculares. Revelar señales de procesamiento fotográfico o la conversión digital. </li><li> Analizar la intensidad de la banda por el software de cuantificación dedicado (ImageJ o Optiquant). </li></ol> 13. Membrana Stripping <ol><li> Para eliminar señales primarias, sumergir la membrana en 500 ml de solución de reextracción hirviendo, A continuación incubar a TA durante 1 min. Proceda a la novela (pre) hibridación o almacenar el filtro a -20 ° C. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Aunque nuestra apreciación de la sofisticada entrelazando a través del cual el ARN regula la neurogénesis está aumentando continuamente, las implicaciones mecanicistas de circuiterías basados ​​en ARN que afectan a los nervios biología de células madre, diferenciación neuronal / integración funcional, el desarrollo de las patologías neuronales y cánceres permanecen sin explorar. El mantenimiento de este tipo de redes a través de reinos hace que el potencial de los sistemas genéticos como Drosophila ...

ARN bioquímica ha experimentado avances espectaculares en los últimos años 1. Nuestra comprensión de ARN potencial en el control de la expresión génica ha sido estallar por la identificación de potentes reguladores no codificantes ribo-2, por el descubrimiento de nuevos mecanismos de regulación basados ​​en ARN 3,4 y por una caracterización más profunda de eventos post-transcripcional ya conocidos 5. Toda la biología del ARN en conjunto estos estudios han permitido hacer de manera espectacular la escena, convirtiéndose en un importante tema de investigación en el actual panorama científico. En particular, en los últimos años estamos consiguiendo un sentido de los efectos generalizados del &quot;mundo ARN&quot; en la neurobiología molecular 6, uno de los campos de investigación más dinámicas de ciencias de la vida moderna. En la última década del siglo pasado, el escenario científico en general se ha visto revolucionado por el descubrimiento de la interferencia de ARN 7,8 y de los pequeños RNAs reguladores 9,10con especial atención a microRNAs 11, expresado endógenamente pequeños RNAs no codificantes implicadas en el control de casi todas las funciones celulares como reguladores pleiotrópicos y combinatorias de la expresión génica. Casi 10 años después de miARN descubrimiento inicial en Caenorhabditis elegans por Ambros y laboratorios de Ruvkun, renovada atención se volvió hacia el campo cuando se identificaron un gran número de miRNAs en Drosophila y en las células humanas, así 12-15. Desde entonces, gracias a los métodos transgénicos versátiles, Drosophila melanogaster se ha destacado como un contexto biológico valioso para profundizar en la biosíntesis y la actividad de los genes miARN. Drosophila miRNAs han revelado distintas funciones en los procesos de insectos específicos o conservadas evolutivamente, que abarca desde el envejecimiento para el metabolismo, las vías de señalización , el comportamiento y, por supuesto, la neurogénesis. A lo largo de esta dirección, que recientemente dio a conocer un nuevo enlace de 16 en la co intriganterrelación que ocurre entre el gen maestro gcm / planeo y la vía ARN. El factor de transcripción mosca Gcm / Glide 17-19 constituye un ejemplo único de determinante el destino celular, que dicta la elección destino neuronal glial vs. en multipotentes vuela precursores neuronales 20. Veinte años de larga investigación sobre este tema ha destacado claramente la aparición de múltiples y superpuestas entradas de regulación de la expresión génica que convergen sobre gcm / deslizarse 21-28 para establecer los niveles de umbral necesarios para el equilibrio de la delicada relación entre contrapartes neuronales y gliales durante el desarrollo neural. Descubrimos que la regulación a través de DMEL-miR279 focalización representa un nivel de control que contribuye a la post-transcripcional puesta a punto de gcm expresión 16 / deslizarse. Mejoras metodológicas específicas Globalmente, estas líneas de investigación se han requeridas: a lo largo de años, varias tecnologías originalmente desarrolladas para analizar tradRNAs itional han sido convertidos para cuantificar pequeños ARN no codificantes, como como ensayos de protección de ARNasa, arrays de cDNA 29-31, en ​​tiempo real los métodos de PCR y secuenciación 32-35 36,37. Por otro lado, la recalibración de los enfoques técnicos ha propiciado avances continuos en el campo. Northern Blot de ensayo (NB, o ensayo de transferencia de gel de ARN) constituye un ejemplo representativo: se emplea en gran medida al perfil acumulación de ARN, ya que garantiza tanto a nivel de cuantificación expresión, así como la determinación del tamaño. Sin embargo, la intrínseca pobre sensibilidad del método es limitante cuando se va a aplicar a la baja abundancia de la expresión de genes afinadores, como RNAs cortos. Una consecuencia perjudicial es el requisito de grandes cantidades de ARN total, lo que hace difícil su aplicación a muestras biológicas específicas. Por tales razones, variantes NB específicos para la detección de ARN pequeños se han desarrollado 38-40: nos aprovechamos de un proc NB mejoradoedure 41 (ENB, Mejorada del Norte Blot), mientras que la aclaración de la interacción mencionada entre DMEL-miR279 y gcm / planeo. Este método se basa en una etapa química de reticulación basado en la actividad de un derivado de carbodiimida [1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida, EDC] para fijar el ácido nucleico sobre soportes sólidos. Carbodiimida es un reticulante versátil conocido para catalizar la formación de enlaces amida entre carboxilo o fosfato grupos activados y grupos amina 42. Esta propiedad puede ser explotada para par de pequeños RNAs covalentemente a través de su grupo 5&#39;-hidroxilo mono-fosforilado a grupos amino en la superficie de las membranas de nylon. La configuración de fijación resultante aumenta la accesibilidad del ácido nucleico inmovilizado y, a su vez, la eficiencia de la hibridación sonda-diana, lo que resulta en la mejora de la detección notable 43. La técnica adquiere una especial relevance en Drosophila estudios moleculares, por el cual la ocurrencia de clases novedosas y distintivas de los pequeños RNAs no codificantes está emergiendo 44. Entre estos, 45,46 rasiRNAs constituyen un subtipo específico de ARN Piwi-interactuar piRNAs (47), que participan en la secuencia específica de silenciamiento génico. Detalles operativos de este método se describen completamente y se visualizaron en lo sucesivo, en relación con el análisis de la microRNAs DMEL-miR279 y miR286 DMEL-y, por primera vez, de una rasiRNA, rasi4. Empujamos a los extremos este método, lo que nos permitió revelar objetivos mal expresados ​​a partir de cantidades mínimas de ARN (menos de 1 mg).

enhanced northern blot detection of small rna species in drosophila melanogaster

Las últimas décadas han sido testigos de la explosión del interés científico en torno a los mecanismos de control de la expresión génica a nivel de ARN. Esta rama de la biología molecular ha sido impulsado en gran medida por el descubrimiento de los ARN no codificantes como actores importantes en la regulación post-transcripcional. Tal perspectiva revolucionaria ha estado acompañada y provocada por el desarrollo de tecnologías de gran alcance para crear perfiles de expresión de ARN corto, tanto a nivel de alto rendimiento (identificación de todo el genoma) o como análisis de candidato único (acumulación de estado estacionario de las diferentes especies). Aunque varias estrategias estado-de-arte están disponibles actualmente para la dosificación o la visualización de dichas moléculas que huyen, ensayo de transferencia Northern sigue siendo el enfoque elegibles en biología molecular para la evaluación inmediata y precisa de la expresión del ARN. Representa un primer paso hacia la aplicación de las tecnologías más sofisticadas, costosas y, en muchos casos, sigue siendo un método preferencial para ganar fácilmente ideasen la biología de ARN. Aquí repasamos un protocolo eficiente (Enhanced Northern Blot) para detectar microRNAs débilmente expresadas (u otras especies de pequeños ARN de regulación) de Drosophila melanogaster embriones enteros, diseccionó manualmente tejidos / adultos o larvas en células cultivadas in vitro. Se requiere una cantidad muy limitada de ARN y el uso de material de flujo de células aisladas citometría-pueden ser también considerada.

Siguiendo el procedimiento general descrito en el texto y esquemáticamente representado en la Figura 1, se evaluó la expresión de ARNs pequeños de muestras de ARN complejas de diferentes orígenes. En el experimento presentado en la Figura 1, se aisló ARN a partir de 2 células de Drosophila Schneider por extracción con proteinasa K, controladas por la integridad (paso opcional: desnaturalización fraccionamiento en gel de agarosa) y se cargó en doble. Una media de gel s...

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Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

El objetivo de esta publicación es visualizar y discutir los pasos operativos de un protocolo de transferencia Northern mejorada en el ARN extraído de Drosophila melanogaster embriones, células y tejidos. Este protocolo es particularmente útil para la detección eficiente de pequeñas especies de ARN.

Mejorada del Norte Blot Detección de los Pequeños ARN Especies en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

enhanced-northern-blot-detection-small-rna-species-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

23.8K vistas.  Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire.  El objetivo de esta publicación es visualizar y discutir los pasos operativos de un protocolo de transferencia Northern mejorada en el ARN extraído de Drosophila melanogaster embriones, células y tejidos. Este protocolo es particularmente útil para la detección eficiente de pequeñas especies de ARN. 

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Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

La disección del sistema nervioso central de larvas de Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Investigación

Biología

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

Vídeo de alta resolución de Seguimiento de la locomoción en adultos de Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Imágenes en directo de Drosophila melanogaster Migraciones hemocitos embrionarias

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

La disección de Oenocytes de Adultos Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

El aislamiento de Drosophila melanogaster Testículos

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

Un cabello no invasiva técnica de muestreo para obtener ADN de alta calidad de esquiva Pequeños Mamíferos

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

The interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to evade viral attacks that include restriction modification, abortive infection and CRISPR/Cas systems. These adaptive immune systems found in many Bacteria and most Archaea consist of clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) sequences and a number of CRISPR associated (Cas) genes (Fig. 1) 1-3. Different sets of Cas proteins and repeats define at least three major divergent types of CRISPR/Cas systems 4. The universal proteins Cas1 and Cas2 are proposed to be involved in the uptake of viral DNA that will generate a new spacer element between two repeats at the 5' terminus of an extending CRISPR cluster 5. The entire cluster is transcribed into a precursor-crRNA containing all spacer and repeat sequences and is subsequently processed by an enzyme of the diverse Cas6 family into smaller crRNAs 6-8. These crRNAs consist of the spacer sequence flanked by a 5' terminal (8 nucleotides) and a 3' terminal tag derived from the repeat sequence 9. A repeated infection of the virus can now be blocked as the new crRNA will be directed by a Cas protein complex (Cascade) to the viral DNA and identify it as such via base complementarity10. Finally, for CRISPR/Cas type 1 systems, the nuclease Cas3 will destroy the detected invader DNA 11,12 .
These processes define CRISPR/Cas as an adaptive immune system of prokaryotes and opened a fascinating research field for the study of the involved Cas proteins. The function of many Cas proteins is still elusive and the causes for the apparent diversity of the CRISPR/Cas systems remain to be illuminated. Potential activities of most Cas proteins were predicted via detailed computational analyses. A major fraction of Cas proteins are either shown or proposed to function as endonucleases 4.
Here, we present methods to generate crRNAs and precursor-cRNAs for the study of Cas endoribonucleases. Different endonuclease assays require either short repeat sequences that can directly be synthesized as RNA oligonucleotides or longer crRNA and pre-crRNA sequences that are generated via in vitro T7 RNA polymerase run-off transcription. This methodology allows the incorporation of radioactive nucleotides for the generation of internally labeled endonuclease substrates and the creation of synthetic or mutant crRNAs. Cas6 endonuclease activity is utilized to mature pre-crRNAs into crRNAs with 5'-hydroxyl and a 2',3'-cyclic phosphate termini.

CRISPR/Cas systems mediate adaptive immunity in Bacteria and Archaea. Many Cas proteins are proposed to act as endoribonucleases acting on crRNA precursors of varying length. Here we illustrate three different approaches to generate pre-crRNA substrates for the biochemical analysis of Cas endonuclease activity.

Sustrato Generación para endonucleasas de CRISPR / Cas Sistemas

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

Medición de la esperanza de vida en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

Imaging A través de la envoltura pupal de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

El mantenimiento de una<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Jaula Población

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...