فإن الكتاب أود أن أنوه الدكتور جان ميشيل مرة في قسم الهندسة الزراعية في جامعة ويسكونس ماديسون لتقديم عينات truncatula Medicago. وأيد هذا العمل في جزء من التمويل من مؤسسة العلوم الوطنية (NSF) منحة CHE-0957784، ومدرسة جامعة ويسكونسن العليا ومؤسسة ولاية ويسكونسن الخريجين بحوث (وارف) وبرنامج زمالة Romnes بحوث كلية (ليرة لبنانية). يقر EG زمالة أبحاث الدراسات العليا NSF (DGE-1256259).

1. الأجهزة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MALDI-TOF/TOF MSI. استخدام مطياف الكتلة مجهزة مصدر MALDI لتحليل الجزيئات الصغيرة (انظر جدول المواد / المعدات). أداء عمليات الاستحواذ في وضع أيون إيجابية أو سلبية اعتمادا على التحاليل من الفائدة. تحديد نطاق شامل من الفائدة وجمع 500 طلقات الليزر / بقعة في 50 ميكرومتر فترات في كل من x و أبعاد ذ عبر سطح العينة لتوليد الصور أيون. ويمكن تعديل العرض النقطية وعدد من الطلقات ليزر للحصول على القرار المكانية أعلى وأقصى كثافة إشارة على التوالي. استخدام DHB قمم مصفوفة أو المعايير الداخلية المطبقة على الشريحة أو مباشرة إلى الأنسجة لمعايرة الأطياف الشامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ارتفاع القرار LC-MS. (انظر جدول المواد / المعدات) مقتطفات عينة تشغيل مع LC-MS باستخدام إما المرحلة عكسها (RP) LC مع عمود C-18، أو مرحلة طبيعية (NP) مع عمود HILIC اعتمادا على التحاليل من الفائدة. استخدام المحمول ومراحلالتدرجات بما يتناسب مع نوع عينة محددة. تنفيذ عمليات استحواذ في وسائط أيون إيجابية أو سلبية تبعا لنوع العينة. </li></ol> 2. إعداد الأنسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقليم العقيدات الجذرية من النبات، وترك 3-4 ملم من الجذر تعلق على العقيدات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة بعد تشريح، واستخدام ملقط لوضع الأنسجة في كوب ناظم البرد، وتغطي مع الجيلاتين (100 ملغ / مل في الماء منزوع الأيونات). فمن الضروري لأنسجة ليكون عالقا في قاع الكأس مع عدم وجود فقاعات الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فلاش تجميد الأنسجة عن طريق وضع كوب في حمام الثلج الجاف / الإيثانول حتى يصلب الجيلاتين ويصبح غير شفاف. مخزن العينات في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة عينات من الفريزر -80 درجة مئوية، وقطع بعيدا ناظم البرد كوب من البلاستيك وتقليم بعيدا الجيلاتين الزائدة. تركيب الأنسجة جزءا لا يتجزأ من لتشاك ناظم البرد مع كمية سنتات الحجم من درجة الحرارة المثلى القطع (أكتوبر) وسائل الإعلام، في حين أن عدم السماح للأكتوبر تلمس الأنسجة. وضع في ناظم البردمربع حتى يتصلب أكتوبر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للتشوك والجيلاتين لكي تتوازن في مربع ناظم البرد (مجموعة إلى -20 أو -25 درجة مئوية) لمدة حوالي 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ناظم البرد (انظر جدول المواد / المعدات) إلى قسم الأنسجة تقريبا سمك خلية واحدة (8-20 ميكرون تبعا لنوع الأنسجة) وذوبان الجليد جبل كل شريحة على الزجاج ايتو المغلفة من قبل ارتفاع درجة حرارة الظهر (غير ايتو- المغلفة الجانب) من شريحة زجاجية ايتو المغلفة على الجزء الخلفي من يدك. وضع الجانب ايتو المغلفة من الشريحة تحسنت بالقرب من شريحة الأنسجة المجمدة والسماح للشريحة التمسك على الشريحة. ووضع المقاطع قريبة من بعضها البعض على الشريحة توفير المحاذاة أفضل أثناء MSI. </li></ol> 3. مصفوفة التطبيق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البخاخة تطبيق مصفوفة MALDI <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات البخاخة في غطاء الدخان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تماما تنظيف الحاويات الحل البخاخة وفوهة (انظر جدول المواد / المعدات) مع الميثانول وملء حاوية الحل مع حل DHB مصفوفة (150 ملغ / مل في 50٪ methanol/0.1٪ TFA ت / ت). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد البخاخة حوالي 35 سم من العينة وتطبيق 10-15 المعاطف من المصفوفة على سطح الشريحة مع مدة 10 ثانية رذاذ و 30 ثانية في وقت التجفيف بين كل طبقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تماما تنظيف البخاخة مرة أخرى مع الميثانول عند الانتهاء لتجنب انسداد من حل المصفوفة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التلقائي تطبيق البخاخ من MALDI مصفوفة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع الإرشادات بدء المقدمة من قبل الشركات المصنعة لنظام الرش التلقائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لMSI من نواتج الأيض في العقد الجذرية باستخدام 40 ملغ / مل (في 50٪ methanol/0.1٪ TFA ت / ت) DHB مثل المصفوفة، ضبط درجة الحرارة إلى 80 درجة مئوية ~، والسرعة إلى 1،250 ملم / دقيقة، ومعدل التدفق الى 50 ميكرولتر / دقيقة، وعدد من يمر إلى 24. لأفضل تغطية، فمن المستحسن لتدوير فوهة 90 ° و / أو تعويض فوهة 1.5 ملم بين كل تمريرة. بدء طريقة الرش. كما الاشتراكيةدي علما، ونظام الرش خاصة مع ارتفاع درجات الحرارة المستخدمة هنا فوهة للتبخر أسرع من المذيبات. كما يتبخر المذيب، وتركيز مصفوفة يزيد بسرعة. مصفوفة تطبيقها على عينة مع البخاخة والرش التلقائي لديها تركيزات قابلة للمقارنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع الإرشادات اغلاق القناة التي تقدمها الشركات المصنعة لنظام الرش التلقائي. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التسامي تطبيق مصفوفة MALDI <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن من 300 ملغ DHB في الجزء السفلي من الغرفة التسامي (انظر جدول المواد / المعدات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عصا شريحة زجاجية لالاصبع الباردة (الجزء العلوي من غرفة التسامي) مع أقسام الأنسجة أسفل مع الوجهين، والشريط موصل. تغطية الجزء الخلفي بأكمله من الشريحة مع الشريط مزدوجة من جانب لحتى الموصلية، وتنتج حتى ترسب مصفوفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المشبك نصفي العلوي والسفلي من الغرفة التسامي جنبا إلى جنب مع C-المشبك. ربط الفراغ والإعلاند الجليد والماء البارد إلى الخزان العلوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع غرفة التسامي في عباءة التدفئة التي هي في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على مضخة فراغ. انتظر 15 دقيقة وتشغيل عباءة التدفئة. عباءة التدفئة يجب أن تصل إلى 120 درجة مئوية على مدار 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 10 دقيقة، وإيقاف الحرارة، وصمام مقربة من فراغ (حتى داخل غرفة لا يزال تحت فراغ) وإيقاف مضخة فراغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للغرفة أن يأتي إلى درجة حرارة الغرفة، افتح صمام تحرير الضغط فراغ وإزالة العينة. فإن حجم الغرفة التسامي تحديد مقدار مصفوفة المتسامي إلى شريحة زجاجية. فإن أكبر غرف التسامي (حجم 400 مل دورق) استخدام حوالي 300 ملغ من DHB في حين أن غرف أصغر (حجم مل دورق 150) سيتم استخدام ما يقرب من 100 ملغ من DHB وسوف تتطلب قطع شريحة زجاجية بحيث تناسبها في الغرفة. </li></ol></li></ol> 4. الحصول على الصور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"> &lt;لى&gt; الأقسام نمط + على كل ركن من أركان عينة مع القلم WiteOut تصحيح السوائل لاستخدامها &quot;تعليم نقاط&quot;. وضع شريحة زجاجية في MALDI لوحة محول الشريحة وتأخذ الصورة البصرية من العينة باستخدام الماسح الضوئي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ملف الحصول على الصور باستخدام البرامج المقدمة من قبل الشركة الصك مع النقطية حجم الخطوة من 50 ميكرون ويبلغ قطرها الليزر مساوية أو أصغر من حجم الخطوة النقطية. على هذا الصك وجه الخصوص، يعطي الإعداد ليزر الحد الأدنى يبلغ قطرها الليزر حوالي 10 ميكرون والصغيرة إعداد الليزر التي يبلغ قطرها 40-50 ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل الصورة البصرية في البرنامج ومحاذاة اللوحة مع الصورة البصرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معايرة أداة قبل البدء في اقتناء باستخدام أيونات مشتركة المصفوفة العنقودية، والمعايير الداخلية، أو مزيج المعايرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد مجالات الأنسجة لتحليلها مع MSI، بما في ذلك بقعة من مصفوفة نقية على الشريحة ليتم استخدامها ك &quot;فارغة&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يبدأ ميلانquisition. </li></ol> 5. انشاء صورة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الملف في برنامج التصوير المتاحة تجاريا التي يقدمها البائع واستخراج الصور أيون. غيرها من البرامج مفتوحة المصدر متاحة لمعالجة البيانات MSI 19. </li></ol> 6. تحديد المستقلب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار محددة م / ض من الاهتمام من الطيف الشامل باستخدام برامج معينة بائع (انظر جدول المواد / المعدات). وتحليلها يمكن تمييزها عن أيون مصفوفة عند تحديد ذروة الحليلة من الطيف الشامل ويتم إنشاء الصور أيون المترجمة تحديدا إلى قسم الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء قائمة من analytes من الاهتمام وإجراء تجارب MS / MS. انظر الجدول 1 والجدول 2 في ممثل النتائج للقوائم عينة من التحاليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء المستهدفة تحليل LC-MS في مطياف الكتلة عالية الدقة (أو عالية الدقة MALDI-MS إذا كان متوفرا) للحصول دقيقةقياسات كتلة التحاليل من الاهتمام وأيضا تنفيذ LC-MS/MS من التحاليل المستهدفة للحصول على أنماط تجزئة مميزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء قاعدة بيانات البحث لتحديد هويات المفترضة للالتحاليل المستهدفة. أمثلة على قواعد البيانات المستقلب تشمل: METLIN، ChemSpider، بوب كيم، KEGG، وHMDB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتأكد من هويات المفترضة من دقيقة قاعدة بيانات البحث الشامل، تتناسب مع MS / MS من التحاليل التي تستهدف MS / MS أطياف المعايير، والأدب، و/ أو برامج التنبؤ تجزئة. </li></ol>

<ol>
	<li>Seeley, E. H., Schwamborn, K., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+Intact+Tissue+Sections:+Moving+beyond+the+Microscope.">Imaging of Intact Tissue Sections: Moving beyond the Microscope.</a> J. Biol. Chem. 286, 25459-25466 (2011).</li><li>van Hove, E. R. A., Smith, D. F., Heeren, R. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+concise+review+of+mass+spectrometry+imaging.">A concise review of mass spectrometry imaging.</a> J. Chromatogr. A. 1217, 3946-3954 (2010).</li><li>Lietz, C. B., Gemperline, E., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+mass+spectrometry+imaging+of+drugs+and+metabolites.">Qualitative and quantitative mass spectrometry imaging of drugs and metabolites.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 65, 1074-1085 (2013).</li><li>Ye, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+mass+spectrometry-assisted+molecular+imaging+of+metabolites+during+nitrogen+fixation+in+the+Medicago+truncatula-Sinorhizobium+meliloti+symbiosis.">MALDI mass spectrometry-assisted molecular imaging of metabolites during nitrogen fixation in the Medicago truncatula-Sinorhizobium meliloti symbiosis.</a> Plant J. 75, 130-145 (2013).</li><li>Ye, H., Gemperline, E., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vision+for+better+health:+mass+spectrometry+imaging+for+clinical+diagnostics.">A vision for better health: mass spectrometry imaging for clinical diagnostics.</a> Clin. Chim. Acta. 420, 11-22 (2013).</li><li>Wei, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+and+Its+Practical+Value+in+Pharmaceutical+Industry.">Metabolomics and Its Practical Value in Pharmaceutical Industry.</a> Curr. Drug Metab. 12, 345-358 (2011).</li><li>Kobayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Serum+Metabolomics-Based+Diagnostic+Approach+to+Pancreatic+Cancer.">A Novel Serum Metabolomics-Based Diagnostic Approach to Pancreatic Cancer.</a> Cancer Epidem. Biomar. 22, 571-579 (2013).</li><li>West, P. R., Weir, A. M., Smith, A. M., Donley, E. L. R., Cezar, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+human+developmental+toxicity+of+pharmaceuticals+using+human+embryonic+stem+cells+and+metabolomics.">Predicting human developmental toxicity of pharmaceuticals using human embryonic stem cells and metabolomics.</a> Toxicol. Appl. Pharm. 247, 18-27 (2010).</li><li>Spegel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+metabolomics+analysis+of+beta-cells+implicates+the+pentose+phosphate+pathway+in+the+control+of+insulin+release.">Time-resolved metabolomics analysis of beta-cells implicates the pentose phosphate pathway in the control of insulin release.</a> Biochem. J. 450, 595-605 (2013).</li><li>Pendyala, G., Want, E. J., Webb, W., Siuzdak, G., Fox, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+for+neuroAIDS:+The+widening+scope+of+metabolomics.">Biomarkers for neuroAIDS: The widening scope of metabolomics.</a> J. Neuroimmune. Pharm. 2, 72-80 (2007).</li><li>Prell, J., Poole, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+changes+of+rhizobia+in+legume+nodules.">Metabolic changes of rhizobia in legume nodules.</a> Trends Microbiol. 14, 161-168 (2006).</li><li>Kutz, K. K., Schmidt, J. J., Li, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+tissue+analysis+of+neuropeptides+by+MALDI+FTMS+in-cell+accumulation.">In situ tissue analysis of neuropeptides by MALDI FTMS in-cell accumulation.</a> Anal. Chem. 76, 5630-5640 (1021).</li><li>Stemmler, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-mass-resolution+direct-tissue+MALDI-FTMS+reveals+broad+conservation+of+three+neuropeptides+(APSGFLGMRamide,+GYRKPPFNGSIFamide+and+pQDLDHVFLRFamide)+across+members+of+seven+decapod+crustaean+infraorders.">High-mass-resolution direct-tissue MALDI-FTMS reveals broad conservation of three neuropeptides (APSGFLGMRamide, GYRKPPFNGSIFamide and pQDLDHVFLRFamide) across members of seven decapod crustaean infraorders.</a> Peptides. 28, 2104-2115 (2007).</li><li>Rubakhin, S. S., Churchill, J. D., Greenough, W. T., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+signaling+peptides+in+single+mammalian+cells+using+mass+spectrometry.">Profiling signaling peptides in single mammalian cells using mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 78, 7267-7272 (1021).</li><li>Neupert, S., Predel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+analysis+of+single+identified+neurons+of+an+insect.">Mass spectrometric analysis of single identified neurons of an insect.</a> Biochem. Bioph. Res. Co. 327, 640-645 (2005).</li><li>Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+of+biological+samples:+localization+of+peptides+and+proteins+using.">Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using.</a> MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).</li><li>Baluya, D. L., Garrett, T. J., Yost, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+MALDI+matrix+deposition+method+with+inkjet+printing+for+imaging+mass+spectrometry.">Automated MALDI matrix deposition method with inkjet printing for imaging mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 79, 6862-6867 (2007).</li><li>Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sublimation+as+a+method+of+matrix+application+for+mass+spectrometric+imaging.">Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18, 1646-1652 (2007).</li><li>Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. A., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSiReader:+an+open-source+interface+to+view+and+analyze+high+resolving+power+MS+imaging+files+on+Matlab+platform.">MSiReader: an open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 718-721 (2013).</li><li>Northen, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrate+nanostructures+for+mass+spectrometry.">Clathrate nanostructures for mass spectrometry.</a> Nature. 449, (2007).</li><li>Shrivas, K., Hayasaka, T., Sugiura, Y., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+simultaneous+imaging+of+endogenous+low+molecular+weight+metabolites+in+mouse+brain+using+TiO2+nanoparticles+in+nanoparticle-assisted+laser+desorption/ionization-imaging+mass+spectrometry.">Method for simultaneous imaging of endogenous low molecular weight metabolites in mouse brain using TiO2 nanoparticles in nanoparticle-assisted laser desorption/ionization-imaging mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 83, 7283-7289 (2011).</li><li>Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sublimation+of+new+matrix+candidates+for+high+spatial+resolution+imaging+mass+spectrometry+of+lipids:+enhanced+information+in+both+positive+and+negative+polarities+after+1,5-diaminonapthalene+deposition.">Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition.</a> Anal. Chem. 84, 2048-2054 (2012).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2,3,4,5-Tetrakis(3',4'-dihydroxylphenyl)thiophene:+a+new+matrix+for+the+selective+analysis+of+low+molecular+weight+amines+and+direct+determination+of+creatinine+in+urine+by+MALDI-TOF+MS.">2,3,4,5-Tetrakis(3',4'-dihydroxylphenyl)thiophene: a new matrix for the selective analysis of low molecular weight amines and direct determination of creatinine in urine by MALDI-TOF MS.</a> Anal. Chem. 84, 10291-10297 (2012).</li><li>Shroff, R., Rulisek, L., Doubsky, J., Svatos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-base-driven+matrix-assisted+mass+spectrometry+for+targeted+metabolomics.">Acid-base-driven matrix-assisted mass spectrometry for targeted metabolomics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 10092-10096 (2009).</li><li>Shroff, R., Svatos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton+sponge:+a+novel+and+versatile+MALDI+matrix+for+the+analysis+of+metabolites+using+mass+spectrometry.">Proton sponge: a novel and versatile MALDI matrix for the analysis of metabolites using mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 81, 7954-7959 (2009).</li><li>Shimma, S., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Microscopy+to+Reveal+Distinct+Localization+of+Heme+B+(m/z+616)+in+Colon+Cancer+Liver+Metastasis.">Mass Microscopy to Reveal Distinct Localization of Heme B (m/z 616) in Colon Cancer Liver Metastasis.</a> J. Mass Spectrom. Soc. Jpn. 55, 145-148 (2007).</li><li>Paschke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mirion-A+Software+Package+for+Automatic+Processing+of+Mass+Spectrometric+Images.">Mirion-A Software Package for Automatic Processing of Mass Spectrometric Images.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 1296-1306 (2013).</li><li>Parry, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=omniSpect:+an+open+MATLAB-based+tool+for+visualization+and+analysis+of+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+and+desorption+electrospray+ionization+mass+spectrometry+images.">omniSpect: an open MATLAB-based tool for visualization and analysis of matrix-assisted laser desorption/ionization and desorption electrospray ionization mass spectrometry images.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 646-649 (2013).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

كما نوقش أعلاه، وإعداد العينات هي الخطوة الأكثر أهمية في سير العمل MSI. سوف تضمين الأنسجة بشكل غير متساو تسبب باجتزاء ليكون من الصعب أو غير الممكن في بعض الحالات. حجم القسم والوقت الكافي موازنة ضرورية للحفاظ على سلامة الأنسجة وتجنب للطي والدموع. واختيار مصفوفة وتقنية ?...

مجال متزايد من الايض العديد من التطبيقات البيولوجية الهامة بما في ذلك اكتشاف العلامات البيولوجية، فك رموز المسارات الأيضية في النباتات وغيرها من النظم البيولوجية، وعلم السموم التنميط 4،6-10. ويتمثل أحد التحديات التقنية الكبرى عند دراسة النظم البيولوجية هو دراسة مسارات metabolomic دون تعطيل لهم 11. MALDI-MSI يسمح للتحليل المباشر للأنسجة سليمة تمكن من analytes كشف حساسة في أجهزة احد 12،13 وحتى 14،15 الخلايا واحد. إعداد نموذج هو خطوة حاسمة في إنتاج الصور الطيفية الشامل استنساخه وموثوق بها. جودة الصور تعتمد إلى حد كبير على عوامل مثل الأنسجة التضمين المتوسطة، شريحة سمك، MALDI مصفوفة، وتقنية تطبيق المصفوفة. لتطبيقات التصوير، قسم مثالية سمك هو العرض من خلية واحدة (8-20 ميكرون اعتمادا على نوع العينة). يتطلب MALDI ترسب عضوي، غلوبولين العدسةه مصفوفة مركب، وعادة حمض ضعيف، على عينة لتحليلها ومساعدة الاجتثاث التأين. توفير 16 مصفوفات مختلفة كثافات مختلفة إشارة، أيونات التدخل، والكفاءة التأين من فئات مختلفة من المركبات. تقنية تطبيق مصفوفة يلعب أيضا دورا في نوعية الصور الطيفية الشامل والتقنيات المختلفة المناسبة لفئات مختلفة من التحاليل. يتم عرض ثلاثة أساليب تطبيق المصفوفة في هذا البروتوكول: البخاخة، بخاخ التلقائي، والتسامي. وقد استخدم على نطاق واسع البخاخة تطبيق مصفوفة في مجال التصوير MALDI. ميزة البخاخة تطبيق مصفوفة هو أنه سريع نسبيا وسهلة. ومع ذلك، فإن نوعية تطبيق مصفوفة البخاخة يعتمد إلى حد كبير على مهارة المستخدم ويميل إلى أن يكون أقل استنساخه وتسبب نشر التحاليل، خصوصا جزيئات صغيرة 17. نظم الرش التلقائي ديك ميكانيكا مماثلة لالبخاخة تطبيق مصفوفة، ولكن هفه تم تطويرها لإزالة التباين ينظر مع دليل تطبيق البخاخة، مما يجعل من رذاذ أكثر استنساخه. هذا الأسلوب يمكن أن يكون في بعض الأحيان أكثر تستغرق وقتا طويلا من التقليدية البخاخة تطبيق المصفوفة. كلا البخاخة اليدوية وأنظمة الرش التلقائي وسائل تطبيق مصفوفة المذيبات. التسامي هو جاف مصفوفة تقنية التطبيقات التي أصبحت أكثر وأكثر شعبية للتصوير الطيفي الشامل من المركبات والجزيئات الصغيرة لأنها تقلل الحليلة نشرها، إلا أنها تفتقر إلى ما يلزم من المذيبات لاستخراج ومراقبة المركبات الشامل أعلى 18. تحديد واثق من المركبات عادة ما يتطلب قياسات دقيقة الشامل للحصول على هويات المفترضة تليها جنبا إلى جنب الشامل (MS / MS) للتحقق من صحة التجارب، مع MS / MS الأطياف يجري مقارنة للمعايير والأدب، أو أطياف النظرية. في هذا البروتوكول عالية الدقة (حل شامل قوة 60،000 في م / ض 400)، اللوني السائل (ويقترن LC)-MS لMALDI-MSI إلى الحصول على كل المعلومات المكانية والتعرف على ثقة من نواتج الأيض الذاتية، وذلك باستخدام Medicago truncatula الجذور والعقد الجذرية مثل النظام البيولوجي. تجارب MS / MS يمكن القيام بها مباشرة على النسيج مع MALDI-MSI أو على مقتطفات الأنسجة مع LC-MS وتستخدم للتحقق من هويات الأيض. يوفر هذا البروتوكول طريقة بسيطة لرسم خريطة نواتج الأيض الذاتية في M. truncatula، والتي يمكن تكييفها وتطبيقها على MSI من الجزيئات الصغيرة في مختلف أنواع الأنسجة والنظم البيولوجية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1270">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Gelatin</td>
			<td style="width:181px;">Difco</td>
			<td style="width:163px;"><a href="http://catalog.bd.com/bdCat/viewProduct.doCustomer?productNumber=214340">214340</a></td>
			<td style="width:611px;">heat to dissolve</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryostat- HM 550</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:163px;">956564A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">indium tin oxide (ITO)-coated glass slides&#160;</td>
			<td>Delta Technologies</td>
			<td>CB-90IN-S107</td>
			<td>25-75-0.8 mm (width-length-thickness)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix&#160;</td>
			<td>ICN Biomedicals</td>
			<td><a href="http://www.labsource.com/Catalog/Item.aspx?ItemID=1787195">PI90033</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Airbrush</td>
			<td>Paasche Airbrush Company</td>
			<td>TG-100D</td>
			<td>coupled with 75 ml steel container</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Automatic matrix sprayer system- TM-Sprayer</td>
			<td>HTX Technologies, LLC</td>
			<td style="width:163px;">HTX.TMSP.H021-U</td>
			<td>Specific start-up and shut-down instructions will be given when the instrument is installed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sublimation apparatus&#160;</td>
			<td>Chemglass Life Science</td>
			<td style="width:163px;"><a href="http://www.chemglass.com/product_view.asp?pnr=CG-3038">CG-3038-01</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Vaccum pump- Alcatel 2008 A</td>
			<td>Ideal Vacuum Products</td>
			<td>P10976</td>
			<td>Ultimate Pressure = 1x10-4 Torr</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF</td>
			<td style="width:181px;">Bruker Daltonics</td>
			<td style="width:163px;">276601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">FlexImaging</td>
			<td style="width:181px;">Bruker Daltonics</td>
			<td>269841</td>
			<td>One example of &#34;vender specific software&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">MALDI LTQ Orbitrap</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMASZ</td>
			<td>High resolution MALDI instrument for accurate mass measurements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Q Exactive</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td>
			<td>High resolution LC-MS instrument for accurate mass measurements</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

maldi-mass spectrometric imaging for the investigation of metabolites in medicago truncatula root nodules

معظم التقنيات المستخدمة لدراسة الجزيئات الصغيرة، مثل العقاقير الدوائية او نواتج الذاتية، وتوظيف مقتطفات الأنسجة التي تتطلب تجانس الأنسجة من الاهتمام التي يمكن أن تسبب تغيرات في المسارات الأيضية التي تجري دراستها 1. الكتلة الطيفي التصوير (MSI) هو أداة تحليلية قوية التي يمكن أن توفر المعلومات المكانية من analytes داخل شرائح سليمة من عينات الأنسجة البيولوجية 1-5. وقد استخدمت هذه التقنية على نطاق واسع لدراسة أنواع مختلفة من المركبات بما في ذلك البروتينات والببتيدات، والدهون، والجزيئات الصغيرة مثل الأيض الذاتية. مع بمساعدة الليزر مصفوفة الامتزاز / التأين (MALDI) MSI، التوزيعات المكانية من نواتج متعددة في وقت واحد يمكن اكتشافه. هنا، يتم تقديم وسيلة وضعت خصيصا لإجراء التجارب غير مستهدفة الايض MSI على جذور البقوليات والعقد الجذرية التي يمكن أن تكشف عن نظرة ثاقبة العمليات البيولوجية التي تحدث. الالطريقة المعروضة هنا يبين سير العمل MSI نموذجي، من إعداد العينات إلى الحصول على الصور، ويركز على خطوة تطبيق المصفوفة، مما يدل على تطبيق عدة تقنيات المصفوفة التي هي مفيدة للكشف عن جزيئات صغيرة. مرة واحدة يتم إنشاء الصور MS، ويناقش تحليل وتحديد نواتج الأيض من الاهتمام وبرهن. سير العمل القياسية المعروضة هنا يمكن تعديلها بسهولة لأنواع مختلفة الأنسجة، والأنواع الجزيئية، والأجهزة.

يتم عرض لمحة عامة التجريبية من MSI في الشكل 1. في بداية التجربة، وإعداد العينات هو خطوة حاسمة. يتم قطع العقيدات من جذور النباتات وجزءا لا يتجزأ من الجيلاتين. يجب الضغط على الأنسجة شقة ضد الكأس ناظم البرد، مع عدم وجود فقاعات، بينما يتم تجميده، وهذا سوف ضمان المو?...

Watch this Scientific Journal Video about MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules at JoVE.com

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

الكتلة الطيفي التصوير (MSI) هو أداة قوية التي يمكن استخدامها لاكتشاف وتحديد الأنواع الكيميائية المختلفة في أنسجة سليمة، والحفاظ على المركبات في بيئاتها المحلية، والتي يمكن أن توفر رؤى جديدة في العمليات البيولوجية. هنا يتم وصف أسلوب MSI وضعت لتحليل جزيئات صغيرة.

التصوير MALDI الكتلة الطيفي للتحقيق في المستقلبات في<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; الجذر العقيدات

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the ...

maldi-mass-spectrometric-imaging-for-investigation-metabolites

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

18.8K Views.  University of Wisconsin- Madison.  الكتلة الطيفي التصوير (MSI) هو أداة قوية التي يمكن استخدامها لاكتشاف وتحديد الأنواع الكيميائية المختلفة في أنسجة سليمة، والحفاظ على المركبات في بيئاتها المحلية، والتي يمكن أن توفر رؤى جديدة في العمليات البيولوجية. هنا يتم وصف أسلوب MSI وضعت ?...

Video: MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays

Similar to Agrobacterium tumerfaciens, Agrobacterium rhizogenes can transfer foreign DNAs into plant cells based on the autonomous root-inducing (Ri) plasmid. A. rhizogenes can cause hairy root formation on plant tissues and form composite plants after transformation. On these composite plants, some of the regenerated roots are transgenic, carrying the wild type T-DNA and the engineered binary vector; while the shoots are still non-transgenic, serving to provide energy and growth support. These hairy root composite plants will not produce transgenic seeds, but there are a number of important features that make these composite plants very useful in plant research. First, with a broad host range,A. rhizogenes can transform many plant species, especially dicots, allowing genetic engineering in a variety of species. Second, A. rhizogenes infect tissues and explants directly; no tissue cultures prior to transformation is necessary to obtain composite plants, making them ideal for transforming recalcitrant plant species. Moreover, transgenic root tissues can be generated in a matter of weeks. For Medicago truncatula, we can obtain transgenic roots in as short as three weeks, faster than normal floral dip Arabidopsis transformation. Overall, the hairy root composite plant technology is a versatile and useful tool to study gene functions and root related-phenotypes. Here we demonstrate how hairy root composite plants can be used to study plant-rhizobium interactions and nodulation in the difficult-to-transform species M. truncatula.

Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays

We demonstrate how hairy root composite plants can be used to study plant-rhizobium interactions and nodulation in the difficult-to-transform species Medicago truncatula.

جيل من النباتات في المركب Medicago truncatula تستخدم لفحوصات Nodulation

Similar to Agrobacterium tumerfaciens, Agrobacterium rhizogenes can transfer foreign DNAs into plant cells based on the autonomous root-inducing (Ri) ...

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The isolated microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of factors that control vessel diameter, and thus, perfusion resistance1-5. This is a classic experimental preparation that was, in large measure, initially described by Uchida et al.15 several decades ago. This initial description provided the basis for the techniques that was extensively modified and enhanced, primarily in the laboratory of Dr. Brian Duling at the University of Virginia6-8, and we present a current approach in the following pages. This preparation will specifically refer to the gracilis arteriole in a rat as the microvessel of choice, but the basic preparation can readily be applied to vessels isolated from nearly any other tissue or organ across species9-13. Mechanical (i.e., dimensional) changes in the isolated microvessels can easily be evaluated in response to a broad array of physiological (e.g., hypoxia, intravascular pressure, or shear) or pharmacological challenges, and can provide insight into mechanistic elements comprising integrated responses in an intact, although ex vivo, tissue. The significance of this method is that it allows for facile manipulation of the influences on the integrated regulation of microvessel diameter, while also allowing for the control of many of the contributions from other sources, including intravascular pressure (myogenic), autonomic innervation, hemodynamic (e.g., shear stress), endothelial dependent or independent stimuli, hormonal, and parenchymal influences, to provide a partial list. Under appropriate experimental conditions and with appropriate goals, this can serve as an advantage over in vivo or in situ tissue/organ preparations, which do not readily allow for the facile control of broader systemic variables. 
The major limitation of this preparation is essentially the consequence of its strengths. By definition, the behavior of these vessels is being studied under conditions where many of the most significant contributors to the regulation of vascular resistance have been removed, including neural, humoral, metabolic, etc. As such, the investigator is cautioned to avoid over-interpretation and extrapolation of the data that are collected utilizing this preparation. The other significant area of concern with regard to this preparation is that it can be very easy to damage cellular components such as the endothelial lining or the vascular smooth muscle, such that variable source of error can be introduced. It is strongly recommended that the individual investigator utilize appropriate measurements to ensure the quality of the preparation, both at the initiation of the experiment and periodically throughout the course of a protocol.

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

An ex vivo preparation is described for isolation of the largest gracilis muscle resistance arterioles for interrogation of both vascular responses to vasoactive stimuli and the assessment of basic structural properties via passive wall mechanics.

و خارج الحي متفرقة التحضير Microvessel الهيكل العظمي للتحقيق في التفاعل الأوعية الدموية

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

يعيش التصوير من تخليص الخلية أفكارك أثناء<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مرحلة التطور الجنيني

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

تنقية النصوص والأيضات من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; رؤساء

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

There is an emerging scientific need for reliable tools for monitoring membrane protein transport. We present a methodology leading to the reconstitution of efflux pumps from the Gram-negative bacteria Pseudomonas aeruginosa in a biomimetic environment that allows for an accurate investigation of their activity of transport. Three prerequisites are fulfilled: compartmentation in a lipidic environment, use of a relevant index for transport, and generation of a proton gradient. The membrane protein transporter is reconstituted into liposomes together with bacteriorhodopsin, a light-activated proton pump that generates a proton gradient that is robust as well as reversible and tunable. The activity of the protein is deduced from the pH variations occurring within the liposome, using pyranin, a pH-dependent fluorescent probe. We describe a step-by-step procedure where membrane protein purification, liposome formation, protein reconstitution, and transport analysis are addressed. Although they were specifically designed for an RND transporter, the described methods could potentially be adapted for use with any other membrane protein transporter energized by a proton gradient.

In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

We present a protocol for the in vitro investigation of efflux pumps from Pseudomonas aeruginosa. This protocol allows for the generation of a robust, reversible, and tunable proton gradient within the liposome membrane and hence should be adaptable to any membrane protein energized by the protomotive force.

في المختبر التحقيق في هروب رأس المال مضخة MexAB من الزائفة الزنجارية

There is an emerging scientific need for reliable tools for monitoring membrane protein transport. We present a methodology leading to the reconstitution ...

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells. In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on unsynchronized cells making it difficult to order the temporal events required for cell cycle progression, genome replication, and division. Caulobacter crescentus provides an excellent model system for the bacterial cell cycle whereby cells can be rapidly synchronized in a G0 state by density centrifugation. Cell cycle synchronization experiments have been used to establish the molecular events governing chromosome replication and segregation, to map a genetic regulatory network controlling cell cycle progression, and to identify the establishment of polar signaling complexes required for asymmetric cell division. Here we provide a detailed protocol for the rapid synchronization of Caulobacter NA1000 cells. Synchronization can be performed in a large-scale format for gene expression profiling and western blot assays, as well as a small-scale format for microscopy or FACS assays. The rapid synchronizability and high cell yields of Caulobacter make this organism a powerful model system for studies of the bacterial cell cycle.

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Synchronization of bacterial cells is essential for studies of the bacterial cell cycle and development. Caulobacter crescentus is synchronizable through density centrifugation allowing a rapid and powerful tool for studies of the bacterial cell cycle. Here we provide a detailed protocol for the synchronization of Caulobacter cells.

تزامن<em&gt; العنيقاء Crescentus</em&gt; للتحقيق في دورة الخلية البكتيرية

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The contractile characteristics can be evaluated independently of external influences such as vascular tonus or neurohumoral status. It depicts a scientific approach between single cell measurements with isolated cardiac myocytes and in vivo studies like echocardiography. Thus, papillary muscle preparations serve as an excellent model to study cardiac physiology/pathophysiology and can be used for investigations like the modulation by pharmacological agents or the exploration of transgenic animal models. Here, we describe a method of isolating the murine left anterior papillary muscle to investigate cardiac contractility in an organ bath setup. In contrast to a muscle strip preparation isolated from the ventricular wall, the papillary muscle can be prepared in toto without damaging the muscle tissue severely. The organ bath setup consists of several temperature-controlled, gassed and electrode-equipped organ bath chambers. The isolated papillary muscle is fixed in the organ bath chamber and electrically stimulated. The evoked twitch force is recorded using a pressure transducer and parameters such as twitch force amplitude and twitch kinetics are analyzed. Different experimental protocols can be performed to investigate the calcium- and frequency-dependent contractility as well as dose-response curves of contractile agents such as catecholamines or other pharmaceuticals. Additionally, pathologic conditions like acute ischemia can be simulated.

Murine left ventricular papillary muscle can be used to investigate cardiac contractility in vitro. This article describes in detail the isolation and experimental protocols to study cardiac contractile characteristics.

انقباض القياسات على العضلات الحليمية معزولة للتحقيق في القلب Inotropy في الفئران

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The ...

MRM Microcoil Performance Calibration and Usage Demonstrated on Medicago truncatula Roots at 22 T

This protocol describes a signal-to-noise ratio (SNR) calibration and sample preparation method for solenoidal microcoils combined with biological samples, designed for high-resolution magnetic resonance imaging (MRI), also referred to as MR microscopy (MRM). It may be used at pre-clinical MRI spectrometers, demonstrated on Medicago truncatula root samples. Microcoils increase sensitivity by matching the size of the RF resonator to the size of the sample of interest, thereby enabling higher image resolutions in a given data acquisition time. Due to the relatively simple design, solenoidal microcoils are straightforward and cheap to construct and can be easily adapted to the sample requirements. Systematically, we explain how to calibrate new or home-built microcoils, using a reference solution. The calibration steps include: pulse power determination using a nutation curve; estimation of RF-field homogeneity; and calculating a volume-normalized signal-to-noise ratio (SNR) using standard pulse sequences. Important steps in sample preparation for small biological samples are discussed, as well as possible mitigating factors such as magnetic susceptibility differences. The applications of an optimized solenoid coil are demonstrated by high-resolution (13 x 13 x 13 &#956;m3, 2.2 pL) 3D imaging of a root sample.

MRM Microcoil Performance Calibration and Usage Demonstrated on Medicago truncatula Roots at 22 T

A protocol to study biological tissue at high spatial resolution using ultra-high field magnetic resonance microscopy (MRM) using microcoils is presented. Step-by-step instructions are provided for characterizing the microcoils. Finally, optimization of imaging is demonstrated on plant roots.

MRM Microcoil معايرة الأداء والاستخدام أظهرت على جذور طاعون Medicago في 22 T

This protocol describes a signal-to-noise ratio (SNR) calibration and sample preparation method for solenoidal microcoils combined with biological ...

Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to investigate the biological activities during development and diseases. Metabolomics approaches&#160;are widely employed in the study of cancer, nutrition/diet, diabetes, and other physiological and pathological conditions involving metabolic processes. An advantageous tool that aids in metabolomic profiling advocated in this paper is matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI). Its ability to detect metabolites in situ without labeling, structural modifications, or other specialized reagents, such as those used in immunostaining, makes MALDI MSI a unique tool in advancing methodologies relevant in the field of metabolomics. An appropriate sample preparation process is critical to yield optimal results and will be the focus of this paper.

The goal of this protocol is to provide detailed guidance on the sample preparation when planning for experiments using MALDI MSI to maximize metabolic and molecular detection in biological samples.

إعداد عينة للتنميط الأيضي باستخدام التصوير الطيفي الشامل MALDI

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to ...

Divergence of Root Microbiota in Different Habitats based on Weighted Correlation Networks

The root microbiome plays an important role in plant growth and environmental adaptation. Network analysis is an important tool for studying communities, which can effectively explore the interaction relationship or co-occurrence model of different microbial species in different environments. The purpose of this manuscript is to provide details on how to use the weighted correlation network algorithm to analyze different co-occurrence networks that may occur in microbial communities due to different ecological environments. All analysis of the experiment is performed in the WGCNA package. WGCNA is an R package for weighted correlation network analysis. The experimental data used to demonstrate these methods were microbial community data from the NCBI (National Center for Biotechnology Information) database for three niches of the rice (Oryza sativa) root system. We used the weighted correlation network algorithm to construct co-abundance networks of microbial community in each of the three niches. Then, differential co-abundance networks among endosphere, rhizoplane and rhizosphere soil were identified. In addition, the core genera in network were obtained by the "WGCNA" package, which plays an important regulated role in network functions. These methods enable researchers to analyze the response of microbial network to environmental disturbance and verify different microbial ecological response theories. The results of these methods show that the significant differential microbial networks identified in the endosphere, rhizoplane and rhizosphere soil of rice.

Network analysis was applied to evaluate the association of various ecological microbial communities, such as soil, water and rhizosphere. Presented here is a protocol on how to use the WGCNA algorithm to analyze different co-occurrence networks that may occur in the microbial communities due to different ecological environments.

اختلاف ميكروبيوتا الجذر في الموائل المختلفة على أساس شبكات الارتباط المرجح

The root microbiome plays an important role in plant growth and environmental adaptation. Network analysis is an important tool for studying communities, ...