Les auteurs tiennent à remercier le Dr Jean-Michel Ané dans le département d&#39;agronomie à l&#39;UW-Madison pour fournir des échantillons de Medicago truncatula. Ce travail a été financé en partie par un financement de la National Science Foundation (NSF) subvention CHE-0957784, l&#39;Université du Wisconsin Graduate School et la Fondation Wisconsin Alumni Research (FRAO) et le programme de bourses de recherche Romnes Faculté (LL). EG reconnaît un diplômé de bourses de recherche NSF (DGE-1256259).

Une. Instrumentation <ol><li> MALDI-TOF/TOF MSI. Utilisez un spectromètre de masse équipé d&#39;une source MALDI pour l&#39;analyse de petites molécules (voir le tableau des Matériaux / Équipement). Effectuer des acquisitions en mode ion positif ou négatif selon les analytes d&#39;intérêt. Spécifiez une plage de masse de l&#39;intérêt et de recueillir 500 coups laser / spot à 50 um intervalles à la fois les dimensions x et y sur la surface de l&#39;échantillon pour produire des images d&#39;ions. La largeur de la trame et le nombre de tirs laser peuvent être ajustés pour obtenir une résolution spatiale plus élevée et une intensité de signal maximale, respectivement. Utilisation de la matrice DHB pics ou des étalons internes appliquées à la glissière ou directement au tissu de calibrer les spectres de masse. </li><li> Résolution LC-MS haute. (Voir le tableau des Matériaux / Équipement) extraits d&#39;échantillons Exécuter avec LC-MS en utilisant soit en phase inverse (RP) LC avec une colonne C-18, ou phase normale (NP) avec une colonne HILIC selon les analytes d&#39;intérêt. Utilisez phases mobiles etgradients comme appropriés pour le type d&#39;échantillon spécifique. Effectuer des acquisitions en modes d&#39;ions positifs ou négatifs en fonction du type d&#39;échantillon. </li></ol> 2. Préparation des tissus <ol><li> Coupez le nodule de racine de la plante, laissant 3-4 mm de racine attachés au nodule. </li><li> Immédiatement après dissection, utiliser une pince pour placer le tissu dans une tasse de cryostat et couvrir avec de la gélatine (100 mg / ml dans de l&#39;eau déminéralisée). Il est essentiel pour le tissu devant être collé au fond de la tasse, sans bulles d&#39;air. </li><li> Flash geler le tissu en plaçant la tasse dans un bain de glace carbonique / éthanol jusqu&#39;à ce que la gélatine durcit et devient opaque. Conserver les échantillons à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Retirer les échantillons du congélateur à -80 ° C, couper la coupe du cryostat plastique et éliminer les excès de gélatine. Montez le tissu intégré à la pince de cryostat avec une quantité de taille dime de la température de coupe optimale (OCT) médias, tout en ne laissant pas les PTOM toucher le tissu. Placez dans cryostatboîte jusqu&#39;à la solidification PTOM. </li><li> Autoriser le mandrin et la gélatine de s&#39;équilibrer dans la boîte de cryostat (de série à -20 ou -25 ° C) pendant environ 15 min. </li><li> Utilisez le cryostat (voir le tableau des Matériaux / Équipement) de l&#39;article tissu environ l&#39;épaisseur d&#39;une cellule (8-20 um selon le type de tissu) et dégel monter chaque tranche sur le verre revêtu d&#39;ITO en chauffant le dos (non-ITO côté) d&#39;une lame de verre revêtu d&#39;ITO sur le dos de votre main-enduit. Placez le côté revêtu d&#39;ITO de la glissière réchauffé à proximité de la tranche de tissu congelé et permettre à la tranche de coller sur la lame. Placer les sections rapprochées sur la diapositive fournira un meilleur alignement pendant MSI. </li></ol> 3. Matrice d&#39;application <ol><li> Airbrush application de MALDI Matrice <ol><li> Toutes les procédures de l&#39;aérographe doivent être effectuées dans une hotte. </li><li> Bien nettoyer le récipient de solution à l&#39;aérographe et la buse (voir le tableau des Matériaux / Équipement) avec du méthanol etremplir le récipient de la solution avec une solution de matrice DHB (150 mg / ml dans 50% methanol/0.1% de TFA v / v). </li><li> Maintenir l&#39;aérographe environ 35 cm à partir de l&#39;échantillon et d&#39;appliquer de 10 à 15 couches de matrice sur la surface de la lame d&#39;une durée de 10 sec 30 sec pulvérisation et le temps de séchage entre chaque couche. </li><li> Bien nettoyer l&#39;aérographe à nouveau avec du méthanol lorsque vous avez terminé pour éviter le colmatage de la solution de matrice. </li></ol></li><li> Demande pulvérisateur automatique de MALDI Matrice <ol><li> Suivez les instructions de démarrage fournis par les fabricants du système de pulvérisation automatique. </li><li> Pour MSI de métabolites dans les nodules des racines à l&#39;aide de 40 mg / ml (dans 50% methanol/0.1% de TFA v / v) DHB comme matrice, régler la température à ~ 80 ° C, la vitesse de 1250 mm / min, le débit à 50 ul / min, et le nombre de passes à 24. Pour une meilleure protection, il est recommandé de faire pivoter la buse 90 ° et / ou de décalage de la buse de 1,5 mm entre chaque passe. Lancer méthode de pulvérisation. Comme un SIde note, le système de pulvérisation particulière utilisée ici chauffe la buse pour l&#39;évaporation rapide du solvant. Comme le solvant s&#39;évapore, la concentration de la matrice augmente rapidement. La matrice appliquée à l&#39;échantillon avec l&#39;aérographe et le pulvérisateur automatique ont des concentrations comparables. </li><li> Suivez les instructions de mises à l&#39;arrêt fournies par les fabricants du système de pulvérisation automatique. </li></ol></li><li> Application de sublimation matrice MALDI <ol><li> Peser 300 mg DHB dans le fond de la chambre de sublimation (voir le tableau des Matériaux / Équipement). </li><li> Collez la lame de verre au doigt froid (partie supérieure de la chambre de sublimation) avec les sections de tissus vers le bas avec du ruban adhésif double-face conductrice. Couvrir l&#39;ensemble du dos de la lame avec le ruban adhésif double face, même pour la conductivité, la production même dépôt de matrice. </li><li> Serrer les moitiés supérieure et inférieure de la chambre de sublimation avec le serre-joint. Connectez le vide et annonced glace et l&#39;eau froide dans le réservoir supérieur. </li><li> Placer la chambre de sublimation dans une enveloppe chauffante qui est à la température ambiante. </li><li> Mettre en marche la pompe à vide. Attendez 15 minutes et tourner sur le chauffe-ballon. Le chauffe-ballon doit atteindre 120 ° C au cours de 10 min. </li><li> Après 10 minutes, éteindre le feu, fermer le robinet à vide (si l&#39;intérieur de la chambre reste sous vide) et arrêter la pompe à vide. </li><li> Laisser la chambre pour venir à la température ambiante, ouvrir la vanne en relâchant la pression à vide et retirer l&#39;échantillon. La taille de la chambre de sublimation permettra de déterminer la quantité de matrice sublimé à la lame de verre. Les grandes sublimation chambres (la taille d&#39;un bécher de 400 ml) utilisent environ 300 mg de DHB tandis que les chambres plus petites (de la taille d&#39;un bécher de 150 ml) utilisent environ 100 mg de DHB et il faudra couper la lame de verre de sorte qu&#39;il s&#39;inscrit dans la chambre. </li></ol></li></ol> 4. Acquisition de l&#39;image <ol> &lt;li&gt; Marquer un modèle + à chaque coin de l&#39;échantillon avec un stylo WiteOut de fluide de correction pour être utilisé comme &quot;enseigner points&quot;. Placez la lame de verre dans la plaque de l&#39;adaptateur de diapositives MALDI et prendre une image optique de l&#39;échantillon à l&#39;aide d&#39;un scanner. </li><li> Mettre en place un fichier d&#39;acquisition d&#39;image en utilisant le logiciel fourni par le fabricant de l&#39;appareil avec une taille de pas de trame de 50 um et un diamètre de laser égale ou plus petite que la taille de pas de trame. Sur cet instrument particulier, le réglage du laser donne un diamètre minimum de laser d&#39;environ 10 um et petit réglage de laser a un diamètre de 40 à 50 um. </li><li> Chargez l&#39;image optique dans le logiciel et aligner la plaque avec l&#39;image optique. </li><li> Étalonner l&#39;instrument avant de commencer l&#39;acquisition en utilisant des ions communs de la matrice de munitions, des normes internes, ou un mélange d&#39;étalonnage. </li><li> Spécifiez les zones de tissu à analyser avec MSI, y compris une place de matrice pure sur la diapositive pour être utilisé comme un «blanc». </li><li> Commencez acquisition. </li></ol> 5. Génération de l&#39;image <ol><li> Ouvrez le fichier d&#39;image dans le logiciel disponible dans le commerce fournies par le vendeur et extraire les images d&#39;ions. Autres logiciels open-source est disponible pour MSI traitement de données 19. </li></ol> 6. Identification des métabolite <ol><li> Sélectionner un spécifique m / z d&#39;intérêt à partir du spectre de masse en utilisant le logiciel spécifique du fournisseur (voir le tableau des Matériaux / Équipement). Un analyte peut être distingué d&#39;un ion de matrice quand un pic de l&#39;analyte est choisi dans le spectre de masse et des images d&#39;ions sont générés spécifiquement localisée dans la section de tissu. </li><li> Générer la liste des analytes d&#39;intérêt et effectuer des expériences MS / MS. Voir le tableau 1 et tableau 2 résultats représentatifs pour les listes d&#39;analytes de l&#39;échantillon. </li><li> Effectuer une analyse ciblée LC-MS sur un spectromètre de masse à haute résolution (ou haute résolution MALDI-MS si disponible) pour obtenir précismesures de la masse des analytes d&#39;intérêt et aussi effectuer LC-MS/MS des analytes cibles pour obtenir des motifs de fragmentation caractéristiques. </li><li> Effectuer base de données de recherche afin de déterminer les identifications putatifs pour les analytes ciblés. Exemples de bases de données sur les métabolites comprennent: METLIN, ChemSpider, PubChem, KEGG, et BDMH. </li><li> Pour confirmer les identifications putatifs de précision recherche de base de données de masse, correspondre à la MS / MS des analytes ciblés de spectres MS / MS de normes, de la littérature, et / ou logiciels de prédiction de la fragmentation. </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Comme discuté ci-dessus, la préparation de l&#39;échantillon est l&#39;étape la plus critique dans le flux de travail MSI. Intégrer le tissu inégalement fera sectionnement d&#39;être difficile ou impossible dans certains cas. La taille de la section et le temps d&#39;équilibrage adéquat sont essentiels au maintien de l&#39;intégrité des tissus et d&#39;éviter de pliage et de larmes. Sélection de la matrice et de la technique d&#39;application va jouer un rôle dans la détermination des types de substances ...

Le domaine en pleine croissance de la métabolomique a de nombreuses applications biologiques importants, notamment la découverte de biomarqueurs, déchiffrer les voies métaboliques des plantes et d&#39;autres systèmes biologiques, et de la toxicologie profilage 4,6-10. Un défi technique majeur lors de l&#39;étude des systèmes biologiques est d&#39;étudier les voies métabolomique sans les perturber 11. MALDI-MSI permet une analyse directe de tissus intacts qui permet la détection sensible des analytes dans les organes simples 12,13 et même des cellules individuelles 14,15. La préparation des échantillons est une étape cruciale dans la production d&#39;images de spectrométrie de masse fiables et reproductibles. La qualité des images dépend grandement de facteurs tels que le tissu support d&#39;enrobage, l&#39;épaisseur de coupe, une matrice MALDI, et la technique d&#39;application de la matrice. Pour des applications d&#39;imagerie, de l&#39;épaisseur de section idéal est la largeur d&#39;une cellule (8-20 um en fonction du type d&#39;échantillon). MALDI nécessite le dépôt d&#39;une organique, cristalline composé de matrice, typiquement un acide faible, sur l&#39;échantillon pour faciliter l&#39;ablation analyte et de l&#39;ionisation. Différentes matrices 16 fournissent différentes intensités de signal, des ions interférents et l&#39;efficacité d&#39;ionisation des différentes classes de composés. La technique d&#39;application de la matrice joue également un rôle dans la qualité des images spectrales de masse et de différentes techniques appropriées pour les différentes classes d&#39;analytes. Trois méthodes d&#39;application de la matrice sont présentés dans ce protocole: aérographe, pulvérisateur automatique, et la sublimation. Airbrush l&#39;application de la matrice a été largement utilisé dans l&#39;imagerie MALDI. L&#39;avantage de l&#39;application de la matrice aérographe est qu&#39;il est relativement facile et rapide. Cependant, la qualité de l&#39;application de la matrice de l&#39;aérographe dépend fortement de la compétence de l&#39;utilisateur et a tendance à être moins reproductible et provoquer la diffusion d&#39;analytes, en particulier des petites molécules 17. Systèmes de pulvérisation automatiques ont mécaniciens similaires à l&#39;aérographe demande de matrice, mais le VHAe été mis au point pour éliminer la variabilité observée avec l&#39;application manuelle de l&#39;aérographe, faisant de la pulvérisation plus reproductible. Cette méthode peut parfois être plus de temps que l&#39;application traditionnelle de la matrice de l&#39;aérographe. Les deux aérographe manuel et systèmes de pulvérisation automatiques sont les méthodes d&#39;application de la matrice à base de solvants. La sublimation est une technique d&#39;application de matrice sèche qui devient de plus en plus populaire pour l&#39;imagerie par spectrométrie de masse des métabolites et des petites molécules, car il réduit la diffusion de l&#39;analyte, mais il lui manque la nécessaire solvant pour extraire et observer composés de masse plus élevées 18. Identification confiante de métabolites nécessite généralement des mesures de masse précises pour obtenir des identifications putatifs suivie par de masse en tandem (MS / MS) des expériences de validation, avec spectres MS / MS est comparé aux normes, la littérature, ou spectres théoriques. Dans ce protocole haute résolution (puissance de 60 000 à m / z 400 résoudre masse), la chromatographie liquide (LC)-MS est couplé à MALDI-MSI à obtenir à la fois l&#39;information spatiale et identifications confiants de métabolites endogènes, en utilisant Medicago truncatula racines et nodosités des racines comme le système biologique. Expériences MS / MS peuvent être effectuées directement sur le tissu avec MALDI-MSI ou d&#39;extraits de tissus avec LC-MS et utilisés pour la validation des identifications de métabolites. Ce protocole fournit une méthode simple pour cartographier métabolites endogènes dans M. truncatula, qui peut être adapté et appliqué à MSI de petites molécules dans différents types de tissus et les systèmes biologiques.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1270">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Gelatin</td>
			<td style="width:181px;">Difco</td>
			<td style="width:163px;"><a href="http://catalog.bd.com/bdCat/viewProduct.doCustomer?productNumber=214340">214340</a></td>
			<td style="width:611px;">heat to dissolve</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryostat- HM 550</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:163px;">956564A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">indium tin oxide (ITO)-coated glass slides&#160;</td>
			<td>Delta Technologies</td>
			<td>CB-90IN-S107</td>
			<td>25-75-0.8 mm (width-length-thickness)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix&#160;</td>
			<td>ICN Biomedicals</td>
			<td><a href="http://www.labsource.com/Catalog/Item.aspx?ItemID=1787195">PI90033</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Airbrush</td>
			<td>Paasche Airbrush Company</td>
			<td>TG-100D</td>
			<td>coupled with 75 ml steel container</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Automatic matrix sprayer system- TM-Sprayer</td>
			<td>HTX Technologies, LLC</td>
			<td style="width:163px;">HTX.TMSP.H021-U</td>
			<td>Specific start-up and shut-down instructions will be given when the instrument is installed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sublimation apparatus&#160;</td>
			<td>Chemglass Life Science</td>
			<td style="width:163px;"><a href="http://www.chemglass.com/product_view.asp?pnr=CG-3038">CG-3038-01</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Vaccum pump- Alcatel 2008 A</td>
			<td>Ideal Vacuum Products</td>
			<td>P10976</td>
			<td>Ultimate Pressure = 1x10-4 Torr</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF</td>
			<td style="width:181px;">Bruker Daltonics</td>
			<td style="width:163px;">276601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">FlexImaging</td>
			<td style="width:181px;">Bruker Daltonics</td>
			<td>269841</td>
			<td>One example of &#34;vender specific software&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">MALDI LTQ Orbitrap</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMASZ</td>
			<td>High resolution MALDI instrument for accurate mass measurements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Q Exactive</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td>
			<td>High resolution LC-MS instrument for accurate mass measurements</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

maldi-mass spectrometric imaging for the investigation of metabolites in medicago truncatula root nodules

La plupart des techniques utilisées pour l&#39;étude de petites molécules, telles que les produits pharmaceutiques ou les métabolites endogènes, utiliser les extraits de tissus qui nécessitent l&#39;homogénéisation du tissu d&#39;intérêt qui pourraient provoquer des changements dans les voies métaboliques étudiées 1. Spectrométrie de masse imagerie (MSI) est un outil d&#39;analyse puissant qui peut fournir des informations spatiales d&#39;analytes dans des tranches intactes d&#39;échantillons de tissus biologiques 1-5. Cette technique a été largement utilisée pour étudier divers types de composés, y compris les protéines, les peptides, les lipides et les petites molécules telles que les métabolites endogènes. Avec laser assistée par matrice de désorption / ionisation (MALDI)-MSI, les distributions spatiales de plusieurs métabolites peuvent être détectés simultanément. Ici, une méthode développée spécifiquement pour la conduite non ciblées métabolomique expériences MSI sur les racines des légumineuses et des nodules racinaires est présenté qui pourrait révéler un aperçu des processus biologiques qui ont lieu. Laméthode présentée ici montre un flux de production typique MSI, à partir de la préparation des échantillons pour l&#39;acquisition d&#39;images, et met l&#39;accent sur l&#39;étape d&#39;application de la matrice, ce qui montre plusieurs techniques d&#39;application de matrice qui sont utiles pour la détection de petites molécules. Une fois les images MS sont générés, l&#39;analyse et l&#39;identification des métabolites d&#39;intérêt sont discutés et démontrés. Le workflow standard présenté ici peut être facilement modifié pour différents types de tissus, des espèces moléculaires et de l&#39;instrumentation.

Une vue d&#39;ensemble de MSI expérimental est représenté sur la figure 1. Au tout début de l&#39;expérience, la préparation des échantillons est une étape critique. Les nodules sont supprimés de la racine de la plante et intégrés dans de la gélatine. Le tissu doit être plaqué contre la coupe du cryostat, sans bulles, alors qu&#39;il est gelé, ce qui permettra d&#39;assurer un alignement plus facile et correcte du tissu pendant qu&#39;il est sectionné. Lorsque le tissu est coupé, il est...

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MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Spectrométrie de masse imagerie (MSI) est un outil puissant qui peut être utilisé pour découvrir et identifier les différentes espèces chimiques dans les tissus intacts, en préservant les composés dans leur environnement naturel, qui peuvent fournir de nouvelles perspectives dans les processus biologiques. Ici un procédé MSI développé pour l&#39;analyse de petites molécules est décrite.

Imagerie MALDI-spectrométrie de masse pour l&#39;investigation des métabolites dans<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; nodules racinaires

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the ...

maldi-mass-spectrometric-imaging-for-investigation-metabolites

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

18.8K vues.  University of Wisconsin- Madison.  Spectrométrie de masse imagerie (MSI) est un outil puissant qui peut être utilisé pour découvrir et identifier les différentes espèces chimiques dans les tissus intacts, en préservant les composés dans leur environnement naturel, qui peuvent fournir de nouvelles perspectives dans les processus biologiques. Ici un procédé MSI développé pour l'analyse de petites molécules est décrite. 