著者は、 ウマゴヤシtruncatulaサンプルを提供するためのウィスコンシン大学マディソン校での栽培の部門の博士ジャン=ミシェル·ANEを承認したいと思います。この作品は、全米科学財団（NSF）からの資金によって部分的にサポートされていた補助金哲0957784、ウィスコンシン大学大学院ウィスコンシン同窓会研究財団（WARF）とRomnes学部研究フェローシッププログラム（LLまで）。 EGは、NSF大学院研究フェローシップ（DGE-1256259）を認めている。

1。計装<ol><li> MALDI-TOF/TOF MSI。 （材料/機器の表を参照）の小分子の分析のためのMALDI源を備えた質量分析装置を使用してください。目的の分析に応じて、正または負イオンモードでの買収を実行します。関心の質量範囲を指定し、イオン画像を生成するために、サンプルの表面を横切って、XとYの両方の次元が50μm間隔で500レーザーショット/スポットを集める。レーザーショットのラスタ幅及び数は、それぞれ、より高い空間分解能と最大信号強度を得るために調整することができる。 DHBマトリックスピークまたは質量スペクトルを校正するためにスライドに直接組織に適用される内部標準を使用してください。 </li><li>高分解能LC-MS。 HILICカラムは目的の分析に依存して、C-18列、または順相（NP）のいずれかで逆相（RP）LCを用いたLC-MSで実行サンプル抽出物（材料/機器の表を参照）。移動相を使用し、特定のサンプルの種類に応じてグラデーション。試料の種類に応じて正又は負イオンモードでの取得を行う。 </li></ol> 2。組織標本<ol><li>結節に付着し、ルート3-4ミリメートル残して、植物からの根粒をトリミング。 </li><li>すぐに解剖した後、クライオスタットカップに組織を配置し、ゼラチン（脱イオン水に100ミリグラム/ ml）でカバーするために鉗子を使用しています。組織が無気泡とのカップの底に貼付されることが不可欠である。 </li><li>フラッシュは、ゼラチンが硬化するまで、ドライアイス/エタノール浴中にカップを置くことによって、組織を凍結して不透明になる。使用するまで-80℃で保存したサンプル。 </li><li>からサンプルを削除する-80℃の冷凍庫°、プラスチッククライオスタットカップを切り取ると過剰ゼラチンを切り落とす。 10月には組織に触れさせるものではないが、最適な切削温度（10月）のメディアのダイムサイズの量のクライオスタットチャックに包埋組織をマウントします。クライオスタット内の場所10月が凝固するまで、ボックス。 </li><li>チャックとゼラチンは、約15分間（-20または-25℃に設定）クライオスタットボックスに平衡化させる。 </li><li>バック（非ITOを暖めることによりITO被覆ガラス上に各スライスをマウントクライオスタット（材料/機器の表を参照）節組織に約1セルの厚さ（8月20日であって、組織のタイプに応じて）と解凍を使用あなたの手の背面のITO被覆スライドガラスの側）をコーティングした。凍結組織切片に近い温めスライドのITO被覆側を置き、スライスがスライド上に固執することができます。スライドに接近してセクションを配置すると、MSIの中に、より良い位置合わせを提供します。 </li></ol> 3。行列アプリケーション<ol><li> MALDIマトリックスのエアブラシ応用 <ol><li>すべてエアブラシ手順は、ドラフト内で実施されるべきである。 </li><li>メタノールで十分（材料/機器の表を参照）エアブラシ液容器とノズルをきれいにし、DHBマトリックス溶液（50％methanol/0.1％のTFA V中の150 mg / mlの/ v）の溶液で容器を充填する。 </li><li>約35センチメートルサンプルからエアブラシを持って、10秒スプレーの持続時間と、各コートの間に30秒の乾燥時間をスライドの表面に、マトリックスの10から15のコートを適用します。 </li><li>マトリックス溶液から目詰まりを避けるために終了したら、メタノールで十分に再びエアブラシを清掃してください。 </li></ol></li><li> MALDIマトリックスの自動スプレー応用 <ol><li>自動噴霧器システムの製造業者が提供するスタートアップの指示に従ってください。 </li><li> 40ミリグラム/ mlで用いた根粒における代謝産物のMSIのためのマトリックスとしてDHB（50％methanol/0.1％TFA体積/体積）には、約80°C、1250ミリメートル/分の速度で、50流量、温度を設定するμL/分、および24へのパスの数。最高のカバレッジのためには、ノズルを90°回転させ、および/または、各パスの間にノズル1.5ミリメートルを相殺することをお勧めします。スプレー法を開始します。 Siなどデなお、ここで使用される特定の噴霧器システムは、溶媒の速い蒸発するためのノズルを加熱する。溶媒が蒸発するように、マトリックスの濃度が速やかに増加する。エアブラシと自動噴霧器を試料に印加する行列は、同程度の濃度を有する。 </li><li>自動噴霧器システムの製造業者が提供するシャットダウンの指示に従ってください。 </li></ol></li><li> MALDIマトリックスの昇華応用 <ol><li> （材料/機器の表を参照）を昇華室の底部に300ミリグラムDHBを量る。 </li><li>組織切片は、両面に、導電性テープで下に向けてコールドフィンガー（昇華室の上部）に、スライドガラスを貼り付けます。でも、マトリックス沈着を生成しても導電性のための両面テープとスライドの裏面全体をカバーしています。 </li><li> Cクランプと一緒に昇華室の上半分と下半分をクランプ。真空や広告を接続するトップリザーバにD氷や冷たい水。 </li><li>室温の加熱マントルに昇華室を配置します。 </li><li>真空ポンプの電源をオンにします。 15分待ってから、加熱マントルをオンにします。加熱マントルを10分間かけて120℃に到達する必要があります。 </li><li> 10分後、熱、真空に近いバルブ（SO室内を真空下に残っている）を無効にし、真空ポンプをオフにしてください。 </li><li>室は、室温に真空圧を解放バルブを開放し、試料を除去することができます。昇華室の大きさは、スライドガラスに昇華マトリックスの量を決定します。小さな室（150 mlビーカーのサイズ）DHB約100mgを使用し、スライドガラスを切断する必要とする一方、より大きな昇華チャンバ（400ミリリットルのビーカーのサイズ）DHB約300mgのを使用することにより、itチャンバー内に収まります。 </li></ol></li></ol> 4。画像収集<ol> &lt;李&gt;マーク」教示点」として使用するWiteOut修正液ペンでサンプルの各角に+パターン。 MALDIスライドアダプタプレートにスライドガラスを置き、スキャナを用いて、試料の光学像を取る。 </li><li> 50μmのラスタ化ステップサイズと等しいかまたはラスター化ステップサイズより小さいレーザ径測定器会社が提供するソフトウェアを用いて画像取得ファイルを設定する。この特定の楽器で、最小のレーザーの設定は、40〜50ミクロンの直径が約10μmと小さなレーザー設定のレーザー径を与えます。 </li><li>ソフトウェアに光学像をロードし、光学像でプレ​​ートを揃える。 </li><li>一般的なマトリックスクラスターイオン、内部標準、または較正ミックスを使用して取得を開始する前に、測定器を校正します。 </li><li> 「ブランク」として使用されるスライド上の純粋なマトリックスのスポットを含むMSIを用いて分析されるべき組織の領域を、指定する。 </li><li> ACを開始アクイジション·。 </li></ol> 5。画像生成<ol><li>ベンダーが提供する市販のソフトウェアで画像ファイルを開き、イオン画像を抽出。他のオープンソースソフトウェアは、MSIデータ処理19で利用可能です。 </li></ol> 6。代謝物の同定<ol><li>ベンダー固有のソフトウェアを使用して、質量スペクトルから関心のある特定のm / zを （材料/機器の表を参照）を選択します。分析物ピークがマススペクトルおよびイオン画像から選択された場合、分析物が生成される具体的な組織部に局在化マトリックスイオンと区別することができる。 </li><li>目的の分析のリストを生成し、MS / MS実験を行う。分析物のサンプルリストのための代表的な結果に、表1と表2を参照してください。 </li><li> （利用可能な場合や、高解像度のMALDI-MS）正確に得るために高分解能質量分析計で標的LC-MS解析を行うまた、大容量の関心の分析物の測定と特性断片化パターンを得るために、標的分析物のLC-MS/MSを行う。 </li><li>ターゲット分析物の推定識別を決定するために、データベース検索を実行します。代謝物データベースの例としては、METLIN、ChemSpider、PubChem、KEGG、およびHMDBを。 </li><li>精密質量データベース検索から推定される識別を確認するために、標準、文学、および/または断片化予測ソフトウェアのMS / MSスペクトルをターゲット分析物からのMS / MSと一致しています。 </li></ol>

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Chem. 76, 5630-5640 (1021).</li><li>Stemmler, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-mass-resolution+direct-tissue+MALDI-FTMS+reveals+broad+conservation+of+three+neuropeptides+(APSGFLGMRamide,+GYRKPPFNGSIFamide+and+pQDLDHVFLRFamide)+across+members+of+seven+decapod+crustaean+infraorders.">High-mass-resolution direct-tissue MALDI-FTMS reveals broad conservation of three neuropeptides (APSGFLGMRamide, GYRKPPFNGSIFamide and pQDLDHVFLRFamide) across members of seven decapod crustaean infraorders.</a> Peptides. 28, 2104-2115 (2007).</li><li>Rubakhin, S. S., Churchill, J. D., Greenough, W. T., Sweedler, J. 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B., Gile, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+of+biological+samples:+localization+of+peptides+and+proteins+using.">Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using.</a> MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).</li><li>Baluya, D. L., Garrett, T. J., Yost, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+MALDI+matrix+deposition+method+with+inkjet+printing+for+imaging+mass+spectrometry.">Automated MALDI matrix deposition method with inkjet printing for imaging mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 79, 6862-6867 (2007).</li><li>Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sublimation+as+a+method+of+matrix+application+for+mass+spectrometric+imaging.">Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18, 1646-1652 (2007).</li><li>Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. A., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSiReader:+an+open-source+interface+to+view+and+analyze+high+resolving+power+MS+imaging+files+on+Matlab+platform.">MSiReader: an open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 718-721 (2013).</li><li>Northen, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrate+nanostructures+for+mass+spectrometry.">Clathrate nanostructures for mass spectrometry.</a> Nature. 449, (2007).</li><li>Shrivas, K., Hayasaka, T., Sugiura, Y., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+simultaneous+imaging+of+endogenous+low+molecular+weight+metabolites+in+mouse+brain+using+TiO2+nanoparticles+in+nanoparticle-assisted+laser+desorption/ionization-imaging+mass+spectrometry.">Method for simultaneous imaging of endogenous low molecular weight metabolites in mouse brain using TiO2 nanoparticles in nanoparticle-assisted laser desorption/ionization-imaging mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 83, 7283-7289 (2011).</li><li>Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sublimation+of+new+matrix+candidates+for+high+spatial+resolution+imaging+mass+spectrometry+of+lipids:+enhanced+information+in+both+positive+and+negative+polarities+after+1,5-diaminonapthalene+deposition.">Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition.</a> Anal. Chem. 84, 2048-2054 (2012).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2,3,4,5-Tetrakis(3',4'-dihydroxylphenyl)thiophene:+a+new+matrix+for+the+selective+analysis+of+low+molecular+weight+amines+and+direct+determination+of+creatinine+in+urine+by+MALDI-TOF+MS.">2,3,4,5-Tetrakis(3',4'-dihydroxylphenyl)thiophene: a new matrix for the selective analysis of low molecular weight amines and direct determination of creatinine in urine by MALDI-TOF MS.</a> Anal. Chem. 84, 10291-10297 (2012).</li><li>Shroff, R., Rulisek, L., Doubsky, J., Svatos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-base-driven+matrix-assisted+mass+spectrometry+for+targeted+metabolomics.">Acid-base-driven matrix-assisted mass spectrometry for targeted metabolomics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 10092-10096 (2009).</li><li>Shroff, R., Svatos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton+sponge:+a+novel+and+versatile+MALDI+matrix+for+the+analysis+of+metabolites+using+mass+spectrometry.">Proton sponge: a novel and versatile MALDI matrix for the analysis of metabolites using mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 81, 7954-7959 (2009).</li><li>Shimma, S., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Microscopy+to+Reveal+Distinct+Localization+of+Heme+B+(m/z+616)+in+Colon+Cancer+Liver+Metastasis.">Mass Microscopy to Reveal Distinct Localization of Heme B (m/z 616) in Colon Cancer Liver Metastasis.</a> J. Mass Spectrom. Soc. Jpn. 55, 145-148 (2007).</li><li>Paschke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mirion-A+Software+Package+for+Automatic+Processing+of+Mass+Spectrometric+Images.">Mirion-A Software Package for Automatic Processing of Mass Spectrometric Images.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 1296-1306 (2013).</li><li>Parry, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=omniSpect:+an+open+MATLAB-based+tool+for+visualization+and+analysis+of+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+and+desorption+electrospray+ionization+mass+spectrometry+images.">omniSpect: an open MATLAB-based tool for visualization and analysis of matrix-assisted laser desorption/ionization and desorption electrospray ionization mass spectrometry images.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 646-649 (2013).</li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

上述のように、試料調製は、MSIのワークフローの中で最も重要な工程である。不均一な組織を埋め込むと、いくつかのケースでは困難または不可能であることが切片なります。セクションのサイズ及び適切な平衡時間は、組織の完全性を維持し、折り畳みおよび涙を避けるために重要である。マトリックスおよび適用技術の選択は、検出されるべき分析対象物の種類を決定する役割、空間分?...

メタボロミクスの成長分野は、バイオマーカーの発見、植物や他の生物系における代謝経路を解読、および毒性プロファイリング4,6-10を含む多くの重要な生物学的なアプリケーションを持っています。生物学的システムを研究の主要な技術的な課題は、彼らに11を中断することなく、メタボローム経路を研究することです。 MALDI-MSIは、単一臓器12,13、さらには単一細胞14,15中の分析物の高感度検出を可能にし、無傷の組織の直接的な分析を可能にする。 試料調製は、再現可能かつ信頼性の高い質量スペクトル画像を生成する上で重要なステップである。画像の品質が大きく、組織包埋媒体、スライス厚、MALDIマトリックス、およびマトリックス適用技術などの要因に依存する。撮像用途のために、理想的な断面の厚さは一つのセル（試料の種類に応じて8〜20ミクロン）の幅である。 MALDIは、有機、クリスタリンの堆積を必要とする検体アブレーションおよびイオン化を支援するために、試料上の電子のマトリックス化合物、典型的には、弱酸、16の異なる行列が異なる信号強度、干渉イオン、および化合物の異なるクラスのイオン化効率を提供する。 行列適用技術は、質量分光画像の品質の役割を果たし、異なる技術が、分析物の異なるクラスに適している。三つの行列の適用方法は、このプロトコルで提示されています。エアブラシ、自動噴霧器、および昇華。エアブラシマトリックスアプリケーションが広くMALDIイメージングに使用されている。エアブラシ行列適用の利点は、比較的迅速かつ簡単であることである。しかし、エアブラシマトリックスアプリケーションの品質が大幅にユーザの技量に依存し、以下で再現可能と分析物の拡散、特に小分子17が発生しやすい。自動噴霧器システムは、マトリックス·アプリケーションをエアブラシと同様の機構を有するが、HAVEスプレーがより再現することは、マニュアルエアブラシアプリケーションで見られる多様性を除去するために開発されて。このメソッドは、時々、より時間のかかる伝統的なエアブラシ行列アプリケーションよりもすることができます。手動エアブラシと自動噴霧器システムの両方が溶剤系マトリックス適用方法である。昇華は、分析物の拡散を減少させるので、代謝物および小分子の質量スペクトルイメージングのためにますます人気になっている乾燥マトリックス適用技術であるが、より高い質量の化合物18を抽出して観察するために必要な溶媒を欠く。 代謝物の確実なIDは、一般的に、タンデム質量MS / MSスペクトルを基準に、文学、または理論スペクトルと比較されると検証のための（MS / MS）実験、続く推定される識別を得るために、正確な質量測定を必要とします。このプロトコル高分解能（M / Z 400で60,000の質量分解能）、液体クロマトグラフィー（中LC）-MSがウマゴヤシは 、生物学的システムとして根や根粒をtruncatula使用して、空間情報と内因性代謝物の自信を持って識別の両方を取得するために、MALDI-MSIに結合されている。 MS / MS実験はMALDI-MSIまたはLC-MSで組織抽出物に対して組織上で直接実行し、代謝産物の同定の検証のために使用することができる。 このプロトコルは、Mの内因性代謝物をマッピングするための簡単な方法を提供し、適合され、種々の組織タイプおよび生物系における小分子のMSIに適用することができるtruncatula、。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1270">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Gelatin</td>
			<td style="width:181px;">Difco</td>
			<td style="width:163px;"><a href="http://catalog.bd.com/bdCat/viewProduct.doCustomer?productNumber=214340">214340</a></td>
			<td style="width:611px;">heat to dissolve</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryostat- HM 550</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:163px;">956564A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">indium tin oxide (ITO)-coated glass slides&#160;</td>
			<td>Delta Technologies</td>
			<td>CB-90IN-S107</td>
			<td>25-75-0.8 mm (width-length-thickness)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix&#160;</td>
			<td>ICN Biomedicals</td>
			<td><a href="http://www.labsource.com/Catalog/Item.aspx?ItemID=1787195">PI90033</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Airbrush</td>
			<td>Paasche Airbrush Company</td>
			<td>TG-100D</td>
			<td>coupled with 75 ml steel container</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Automatic matrix sprayer system- TM-Sprayer</td>
			<td>HTX Technologies, LLC</td>
			<td style="width:163px;">HTX.TMSP.H021-U</td>
			<td>Specific start-up and shut-down instructions will be given when the instrument is installed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sublimation apparatus&#160;</td>
			<td>Chemglass Life Science</td>
			<td style="width:163px;"><a href="http://www.chemglass.com/product_view.asp?pnr=CG-3038">CG-3038-01</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Vaccum pump- Alcatel 2008 A</td>
			<td>Ideal Vacuum Products</td>
			<td>P10976</td>
			<td>Ultimate Pressure = 1x10-4 Torr</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF</td>
			<td style="width:181px;">Bruker Daltonics</td>
			<td style="width:163px;">276601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">FlexImaging</td>
			<td style="width:181px;">Bruker Daltonics</td>
			<td>269841</td>
			<td>One example of &#34;vender specific software&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">MALDI LTQ Orbitrap</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMASZ</td>
			<td>High resolution MALDI instrument for accurate mass measurements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Q Exactive</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td>
			<td>High resolution LC-MS instrument for accurate mass measurements</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

maldi-mass spectrometric imaging for the investigation of metabolites in medicago truncatula root nodules

そのような医薬品または内因性代謝産物などの小分子を研究する潜在的に1検討されて代謝経路の変化を引き起こす可能性が目的の組織の均質化を必要とする組織抽出物を使用するために使用される大部分の技術を含む。質量分析イメージング（MSI）は、生物学的組織サンプル1-5の完全なスライス内の分析物の空間的な情報を提供することができる強力な分析ツールです。この技術は、タンパク質、ペプチド、脂質、および内因性代謝産物などの小分子を含む様々なタイプの化合物を研究するために広く使用されている。マトリックス支援レーザー脱離/イオン化（MALDI）-MSIでは、複数の代謝物質の空間分布を同時に検出することができる。ここでは、マメ科植物の根と根粒に非標的メタボロミクスのMSI実験を行うために特別に開発された方法が行われている生物学的プロセスへの洞察を明らかにする可能性が提示されている。ザ·ここに提示した方法は、サンプル調製からの画像取得のために、典型的なMSIワークフローを示し、および小分子を検出するために有用であるいくつかのマトリックス適用技術を実証行列適用工程に焦点を当てている。 MS画像が生成されると、関心のある代謝物の分析および同定は議論され示されている。ここに提示標準ワークフローを容易に異なる組織型、分子種、および計測のために修飾することができる。

MSIの実験の概要を図1に示す。実験の最初に、サンプル調製は重要な工程である。結節は、植物の根からトリミングし、ゼラチン中に埋設されている。それが凍結されている間組織は、無気泡、クライオスタットカップに対して平らにプレスされている必要があり、それが区分されている間、これは組織のより容易かつ適切な整合性を確保します。組織はスライスされている場合...

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MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

質量分析イメージング（MSI）は、生物学的プロセスに新たな洞察を提供することができ、ネイティブ環境で化合物を保持し、無傷の組織内の様々な化学種を発見し、識別するために使用することができる強力なツールです。本明細小分子の分析のために開発MSI方法が記載されている。

代謝産物の調査のためのMALDI-質量分析イメージング<em&gt;ウマゴヤシtruncatula</em&gt;ルート結節

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the ...

maldi-mass-spectrometric-imaging-for-investigation-metabolites

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

18.8K ビュー.  University of Wisconsin- Madison. 質量分析イメージング（MSI）は、生物学的プロセスに新たな洞察を提供することができ、ネイティブ環境で化合物を保持し、無傷の組織内の様々な化学種を発見し、識別するために使用することができる強力なツールです。本明細小分子の分析のために開発MSI方法が記載されている。 

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The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The isolated microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of factors that control vessel diameter, and thus, perfusion resistance1-5. This is a classic experimental preparation that was, in large measure, initially described by Uchida et al.15 several decades ago. This initial description provided the basis for the techniques that was extensively modified and enhanced, primarily in the laboratory of Dr. Brian Duling at the University of Virginia6-8, and we present a current approach in the following pages. This preparation will specifically refer to the gracilis arteriole in a rat as the microvessel of choice, but the basic preparation can readily be applied to vessels isolated from nearly any other tissue or organ across species9-13. Mechanical (i.e., dimensional) changes in the isolated microvessels can easily be evaluated in response to a broad array of physiological (e.g., hypoxia, intravascular pressure, or shear) or pharmacological challenges, and can provide insight into mechanistic elements comprising integrated responses in an intact, although ex vivo, tissue. The significance of this method is that it allows for facile manipulation of the influences on the integrated regulation of microvessel diameter, while also allowing for the control of many of the contributions from other sources, including intravascular pressure (myogenic), autonomic innervation, hemodynamic (e.g., shear stress), endothelial dependent or independent stimuli, hormonal, and parenchymal influences, to provide a partial list. Under appropriate experimental conditions and with appropriate goals, this can serve as an advantage over in vivo or in situ tissue/organ preparations, which do not readily allow for the facile control of broader systemic variables. 
The major limitation of this preparation is essentially the consequence of its strengths. By definition, the behavior of these vessels is being studied under conditions where many of the most significant contributors to the regulation of vascular resistance have been removed, including neural, humoral, metabolic, etc. As such, the investigator is cautioned to avoid over-interpretation and extrapolation of the data that are collected utilizing this preparation. The other significant area of concern with regard to this preparation is that it can be very easy to damage cellular components such as the endothelial lining or the vascular smooth muscle, such that variable source of error can be introduced. It is strongly recommended that the individual investigator utilize appropriate measurements to ensure the quality of the preparation, both at the initiation of the experiment and periodically throughout the course of a protocol.

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

An ex vivo preparation is described for isolation of the largest gracilis muscle resistance arterioles for interrogation of both vascular responses to vasoactive stimuli and the assessment of basic structural properties via passive wall mechanics.

ザ ex vivoで</em血管反応性の調査のために>隔離された骨格微小血管の準備

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

生物学

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

アポトーシス細胞のクリアランスのイメージング中に生きる<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

転写産物および代謝物からの精製<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;ヘッド

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

There is an emerging scientific need for reliable tools for monitoring membrane protein transport. We present a methodology leading to the reconstitution of efflux pumps from the Gram-negative bacteria Pseudomonas aeruginosa in a biomimetic environment that allows for an accurate investigation of their activity of transport. Three prerequisites are fulfilled: compartmentation in a lipidic environment, use of a relevant index for transport, and generation of a proton gradient. The membrane protein transporter is reconstituted into liposomes together with bacteriorhodopsin, a light-activated proton pump that generates a proton gradient that is robust as well as reversible and tunable. The activity of the protein is deduced from the pH variations occurring within the liposome, using pyranin, a pH-dependent fluorescent probe. We describe a step-by-step procedure where membrane protein purification, liposome formation, protein reconstitution, and transport analysis are addressed. Although they were specifically designed for an RND transporter, the described methods could potentially be adapted for use with any other membrane protein transporter energized by a proton gradient.

In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

We present a protocol for the in vitro investigation of efflux pumps from Pseudomonas aeruginosa. This protocol allows for the generation of a robust, reversible, and tunable proton gradient within the liposome membrane and hence should be adaptable to any membrane protein energized by the protomotive force.

緑膿菌からの MexAB排出ポンプの体外調査に

There is an emerging scientific need for reliable tools for monitoring membrane protein transport. We present a methodology leading to the reconstitution ...

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells. In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on unsynchronized cells making it difficult to order the temporal events required for cell cycle progression, genome replication, and division. Caulobacter crescentus provides an excellent model system for the bacterial cell cycle whereby cells can be rapidly synchronized in a G0 state by density centrifugation. Cell cycle synchronization experiments have been used to establish the molecular events governing chromosome replication and segregation, to map a genetic regulatory network controlling cell cycle progression, and to identify the establishment of polar signaling complexes required for asymmetric cell division. Here we provide a detailed protocol for the rapid synchronization of Caulobacter NA1000 cells. Synchronization can be performed in a large-scale format for gene expression profiling and western blot assays, as well as a small-scale format for microscopy or FACS assays. The rapid synchronizability and high cell yields of Caulobacter make this organism a powerful model system for studies of the bacterial cell cycle.

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Synchronization of bacterial cells is essential for studies of the bacterial cell cycle and development. Caulobacter crescentus is synchronizable through density centrifugation allowing a rapid and powerful tool for studies of the bacterial cell cycle. Here we provide a detailed protocol for the synchronization of Caulobacter cells.

の同期<em&gt;カウロバクターCrescentus</em&gt;細菌細胞周期の調査のため

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The contractile characteristics can be evaluated independently of external influences such as vascular tonus or neurohumoral status. It depicts a scientific approach between single cell measurements with isolated cardiac myocytes and in vivo studies like echocardiography. Thus, papillary muscle preparations serve as an excellent model to study cardiac physiology/pathophysiology and can be used for investigations like the modulation by pharmacological agents or the exploration of transgenic animal models. Here, we describe a method of isolating the murine left anterior papillary muscle to investigate cardiac contractility in an organ bath setup. In contrast to a muscle strip preparation isolated from the ventricular wall, the papillary muscle can be prepared in toto without damaging the muscle tissue severely. The organ bath setup consists of several temperature-controlled, gassed and electrode-equipped organ bath chambers. The isolated papillary muscle is fixed in the organ bath chamber and electrically stimulated. The evoked twitch force is recorded using a pressure transducer and parameters such as twitch force amplitude and twitch kinetics are analyzed. Different experimental protocols can be performed to investigate the calcium- and frequency-dependent contractility as well as dose-response curves of contractile agents such as catecholamines or other pharmaceuticals. Additionally, pathologic conditions like acute ischemia can be simulated.

Murine left ventricular papillary muscle can be used to investigate cardiac contractility in vitro. This article describes in detail the isolation and experimental protocols to study cardiac contractile characteristics.

マウスの心臓変力作用の調​​査のために分離された乳頭筋の収縮の測定

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.

This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.

効率的な哺乳動物細胞発現および結晶化のための細胞外糖タンパク質のシングルステップの精製

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

MRM Microcoil Performance Calibration and Usage Demonstrated on Medicago truncatula Roots at 22 T

This protocol describes a signal-to-noise ratio (SNR) calibration and sample preparation method for solenoidal microcoils combined with biological samples, designed for high-resolution magnetic resonance imaging (MRI), also referred to as MR microscopy (MRM). It may be used at pre-clinical MRI spectrometers, demonstrated on Medicago truncatula root samples. Microcoils increase sensitivity by matching the size of the RF resonator to the size of the sample of interest, thereby enabling higher image resolutions in a given data acquisition time. Due to the relatively simple design, solenoidal microcoils are straightforward and cheap to construct and can be easily adapted to the sample requirements. Systematically, we explain how to calibrate new or home-built microcoils, using a reference solution. The calibration steps include: pulse power determination using a nutation curve; estimation of RF-field homogeneity; and calculating a volume-normalized signal-to-noise ratio (SNR) using standard pulse sequences. Important steps in sample preparation for small biological samples are discussed, as well as possible mitigating factors such as magnetic susceptibility differences. The applications of an optimized solenoid coil are demonstrated by high-resolution (13 x 13 x 13 &#956;m3, 2.2 pL) 3D imaging of a root sample.

MRM Microcoil Performance Calibration and Usage Demonstrated on Medicago truncatula Roots at 22 T

A protocol to study biological tissue at high spatial resolution using ultra-high field magnetic resonance microscopy (MRM) using microcoils is presented. Step-by-step instructions are provided for characterizing the microcoils. Finally, optimization of imaging is demonstrated on plant roots.

22 Tで 医薬トランカチュラ ルーツで実証MRMマイクロコイル性能キャリブレーションと使用

This protocol describes a signal-to-noise ratio (SNR) calibration and sample preparation method for solenoidal microcoils combined with biological ...

Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to investigate the biological activities during development and diseases. Metabolomics approaches&#160;are widely employed in the study of cancer, nutrition/diet, diabetes, and other physiological and pathological conditions involving metabolic processes. An advantageous tool that aids in metabolomic profiling advocated in this paper is matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI). Its ability to detect metabolites in situ without labeling, structural modifications, or other specialized reagents, such as those used in immunostaining, makes MALDI MSI a unique tool in advancing methodologies relevant in the field of metabolomics. An appropriate sample preparation process is critical to yield optimal results and will be the focus of this paper.

The goal of this protocol is to provide detailed guidance on the sample preparation when planning for experiments using MALDI MSI to maximize metabolic and molecular detection in biological samples.

MALDI質量分析イメージングを用いた代謝プロファイリングのサンプル調製

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to ...

Divergence of Root Microbiota in Different Habitats based on Weighted Correlation Networks

The root microbiome plays an important role in plant growth and environmental adaptation. Network analysis is an important tool for studying communities, which can effectively explore the interaction relationship or co-occurrence model of different microbial species in different environments. The purpose of this manuscript is to provide details on how to use the weighted correlation network algorithm to analyze different co-occurrence networks that may occur in microbial communities due to different ecological environments. All analysis of the experiment is performed in the WGCNA package. WGCNA is an R package for weighted correlation network analysis. The experimental data used to demonstrate these methods were microbial community data from the NCBI (National Center for Biotechnology Information) database for three niches of the rice (Oryza sativa) root system. We used the weighted correlation network algorithm to construct co-abundance networks of microbial community in each of the three niches. Then, differential co-abundance networks among endosphere, rhizoplane and rhizosphere soil were identified. In addition, the core genera in network were obtained by the "WGCNA" package, which plays an important regulated role in network functions. These methods enable researchers to analyze the response of microbial network to environmental disturbance and verify different microbial ecological response theories. The results of these methods show that the significant differential microbial networks identified in the endosphere, rhizoplane and rhizosphere soil of rice.

Network analysis was applied to evaluate the association of various ecological microbial communities, such as soil, water and rhizosphere. Presented here is a protocol on how to use the WGCNA algorithm to analyze different co-occurrence networks that may occur in the microbial communities due to different ecological environments.

重み付け相関ネットワークに基づく異なる生息地における根内微生物叢の発散

The root microbiome plays an important role in plant growth and environmental adaptation. Network analysis is an important tool for studying communities, ...