저자는 개자리의 truncatula 샘플을 제공하는 UW-매디슨에서 농업 경제학학과 박사 장 미셸 ANE을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 국립 과학 재단 (NSF)의 자금에 의해 부분적으로 지원 된 보조금 CHE-0957784, 위스콘신 대학의 대학원 위스콘신 동문회 연구 재단 (WARF) 및 Romnes 교직원 연구 활동 프로그램 (LL까지). EG는 NSF 대학원 연구 활동 (DGE-1256259)를 인정한다.

1. 수단 <ol><li> MALDI-TOF/TOF MSI. 작은 분자의 분석을위한 MALDI 소스가 장착 된 질량 분석기를 (재료 / 장비의 표 참조)를 사용합니다. 그 분석에 따라 양 또는 음 이온 모드에서 획득을 수행합니다. 관심의 질량 범위를 지정하고 이온의 이미지를 생성하는 샘플의 표면을 가로 질러 x와 y 차원 모두에서 50 ㎛ 간격으로 500 레이저 샷 / 자리를 수집합니다. 레이저 샷의 래스터 폭과 번호는, 각각 더 높은 공간 분해능 및 최대 신호 강도를 얻기 위해 조정될 수있다. DHB 매트릭스 피크 또는 질량 스펙트럼을 보정 슬라이드에 직접 조직에 적용되는 내부 기준을 사용합니다. </li><li> 높은 해상도 LC-MS. (재료 / 장비의 표 참조) LC-MS는 HILIC 열이 관심의 분석에 따라와 C-18 열, 또는 정상적인 단계 (NP)과 역상 (RP) LC를 사용하여 실행 샘플을 추출. 이동상 및 사용특정 샘플 유형에 대한 적절한 그라디언트. 시료의 유형에 따라 양 또는 음 이온 모드에서 획득을 수행한다. </li></ol> 2. 조직 준비 <ol><li> 결절에 부착 된 루트 3 ~ 4 밀리미터를두고, 공장에서 루트 결절 트림. </li><li> 즉시 절개 한 후, 저온 유지 컵에 조직을두고 젤라틴 (탈 이온수에서 100 ㎎ / ㎖)를 충당하기 위해 집게를 사용합니다. 조직이 기포와 컵의 바닥에 붙어되는 것이 필수적이다. </li><li> 플래시 젤라틴 견고 불투명해질 때까지 드라이 아이스 / 에탄올 욕에 컵을 배치하여 조직을 동결. -80 ° C까지 사용에서 보관 샘플. </li><li> 에서 샘플을 제거 -80 C 냉장고 °, 플라스틱 저온 유지 컵을 버려야 과잉 젤라틴을 멀리 트림. OCT를 사용하여 조직을 터치 두지 않을 동안, 최적의 절삭 온도 (10 월) 미디어 한푼 크기의 양의 저온 유지 척에 포함 된 조직을 설치합니다. 저온 유지 장치에 배치OCT를 응고 될 때까지 상자. </li><li> 척 젤라틴은 약 15 분 동안 (-20 또는 -25 ° C에서 세트) 저온 유지 장치 상자에서 평형을 허용합니다. </li><li> 백 (비 ITO를 따뜻하게하여 ITO 코팅 유리에 각 슬라이스를 마운트 그라 이오 스탯 (재료 / 장비의 표 참조) 섹션 조직에 약 하나의 셀의 두께 (8-20 μm의는 조직의 유형에 따라)과 해동을 사용하여 손등에 ITO 코팅 유리 슬라이드의면) 코팅. 냉동 조직 절편 근처 따뜻하게 슬라이드의 ITO 코팅면을 놓고 슬라이스가 슬라이드에 충실 할 수 있습니다. 슬라이드에 가깝게 섹션을 배치하는 MSI 동안 더 나은 정렬을 제공 할 것입니다. </li></ol> 3. 매트릭스 응용 프로그램 <ol><li> MALDI 매트릭스의 에어 브러시 적용 <ol><li> 모든 에어 브러쉬 절차는 흄 후드에서 수행해야합니다. </li><li> 철저히 에어 브러쉬 솔루션 컨테이너와 노즐 (재료 / 장비의 표 참조) 메탄올을 청소하고DHB 매트릭스 용액으로 용액 용기를 채우기 (50 % methanol/0.1 %의 TFA의 V에서 150 ㎎ / ㎖ / v). </li><li> 약 35 센티미터 샘플에서 에어 브러쉬를 잡고 10 초 스프레이 기간 및 각 코트 사이에 30 초 건조 시간과 슬라이드의 표면에 매트릭스의 10-15 코트를 적용합니다. </li><li> 매트릭스 솔루션에서 막힘 방지하기 위해 완료되면 철저하게 메탄올로 다시 에어 브러시를 청소합니다. </li></ol></li><li> MALDI 매트릭스의 자동 스프레이 응용 프로그램 <ol><li> 자동 스프레이 시스템의 제조 업체에서 제공하는 스타트 업 지침을 따르십시오. </li><li> 40 ㎎ / ㎖를 사용하여 루트 결절의 대사 산물의 MSI (50 % methanol/0.1 %의 TFA의 V IN / V) DHB 매트릭스 ~ 80 ° C, 속도에 1천2백50mm / 분, 50 유량에 온도 설정을위한 μL / 분, 24에 패스의 수. 최고의 보험의 경우,이 노즐 90 ° 및 / 또는 각 패스의 노즐 1.5 mm 오프셋을 회전하는 것이 좋습니다. 스프레이 방법을 시작합니다. SI로데주의, 여기에 사용 된 특정 스프레이 시스템은 용매의 빠른 증발을 위해 노즐을 가열한다. 용매가 증발 할 때, 매트릭스의 농도는 빠르게 증가한다. 에어 브러시와 자동 분무기를 이용하여 시료에 적용되는 매트릭스는 비교 농도가있다. </li><li> 자동 스프레이 시스템의 제조 업체에서 제공하는 셧다운 지시 사항을 따르십시오. </li></ol></li><li> MALDI 매트릭스의 승화 신청 <ol><li> (재료 / 장비의 표 참조) 승화 실의 바닥에 300 밀리그램의 DHB를 달다. </li><li> 조직 섹션 양면, 전도성 테이프를 아래로 향하게하여 차가운 손가락 (승화 챔버의 상부)에 유리 슬라이드 스틱. 심지어 매트릭스 증착을 생산, 심지어 전도성 양면 테이프와 슬라이드의 뒷면 전체를 커버. </li><li> 함께 C-클램프로 승화 챔버의 상하 반쪽 클램프. 진공 및 광고를 연결상부 저수지에 D 얼음과 차가운 물. </li><li> 실내 온도에 가열 맨틀에서 승화 챔버를 놓습니다. </li><li> 진공 펌프의 전원을 켭니다. 15 분을 기다린 후 가열 맨틀의 전원을 켭니다. 가열 맨틀은 10 분에 걸쳐 120 ° C에 도달해야합니다. </li><li> 10 분 후, 열, 진공 개폐 밸브 (그래서 챔버의 내부는 진공 상태 유지)를 해제하고 진공 펌프를 끄십시오. </li><li> 진공 압력 방출 밸브를 열고 샘플을 제거, 챔버는 실내 온도에 올 수 있습니다. 승화 챔버의 크기가 유리 슬라이드에 승화 행렬의 양을 결정할 것이다. 작은 챔버 (150 ㎖의 비이커의 사이즈) DHB 약 100 밀리그램을 사용하고 유리 슬라이드를 절단 필요하면서 큰 승화 챔버 (400 ㎖의 비이커의 사이즈) DHB 약 300 mg의 사용되도록 그것을 챔버에 맞는. </li></ol></li></ol> 4. 이미지 획득 <ol> &lt;리&gt; 마크 &quot;가르쳐 포인트」로서 사용되는 WiteOut 수정액 펜으로 샘플의 각 모서리에 + 패턴. MALDI 슬라이드 어댑터 플레이트에 유리 슬라이드를 삽입하고 스캐너를 사용하여 샘​​플의 광학 이미지를 촬영. </li><li> 50 ㎛의 래스터 스텝 사이즈와 같거나 래스터 스텝 사이즈보다 작은 레이저 직경 인스트루먼트 사에 의해 제공된 소프트웨어를 사용하여 화상 취득 파일을 설정. 이 특정 기기에서 최소 레이저 설정은 40 ~ 50 μm의 직경이 약 10 μm의 작은 레이저 설정의 레이저 직경을 제공합니다. </li><li> 소프트웨어에 광학 이미지를로드하고 광학 이미지로 판을 맞 춥니 다. </li><li> 일반적인 매트릭스 클러스터 이온, 내부 표준 또는 교정 믹스를 사용하여 인수를 시작하기 전에 악기를 보정합니다. </li><li> &quot;빈&quot;으로 사용될 슬라이드 순수 행렬의 스폿 등으로 MSI 분석 할 조직의 영역을 지정한다. </li><li> 교류 시작quisition. </li></ol> 5. 이미지 생성 <ol><li> 공급 업체에서 제공하는 상용 소프트웨어에서 이미지 파일을 열고 이온 이미지를 추출합니다. 다른 오픈 소스 소프트웨어는 MSI 데이터 처리 19 사용할 수 있습니다. </li></ol> 6. 대사 산물 식별 <ol><li> 공급 업체에 특정 소프트웨어를 사용하여 질량 스펙트럼에서 관심의 특정 M / Z를 (재료 / 장비의 표를 참조). 분석 물 피크가 질량 스펙트럼으로부터 선택되는 이온 이미지가 구체적으로 조직 절편에 국부적으로 생성 될 때 분석 물은 매트릭스 이온 구별 될 수있다. </li><li> 그 분석의 목록을 생성 및 MS / MS 실험을 수행합니다. 분석의 샘플 목록의 대표 결과 표 1과 표 2를 참조하십시오. </li><li> 정확한을 얻기 위해 (또는 가능하면 높은 해상도 MALDI-MS) 고해상도 질량 분석기에 표적으로 한 LC-MS 분석을 수행대중의 관심의 분석의 측정과도 특성 조각 패턴을 얻기 위해 분석 대상 물질의 LC-MS/MS를 수행합니다. </li><li> 대상 분석을위한 추정 식별을 결정하는 검색 데이터베이스를 수행합니다. 대사 데이터베이스의 예는 다음과 같습니다 METLIN, ChemSpider, PubChem, KEGG 및 HMDB을. </li><li> 정확한 질량 데이터베이스 검색에서 추정 식별을 확인하기 위해, 표준, 문학, 및 / 또는 분열 예측 소프트웨어의 MS / MS 스펙트럼을 분석 대상에서 MS / MS를 일치합니다. </li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

전술 한 바와 같이, 샘플 준비는 MSI 흐름에서 가장 중요한 단계이다. 고르지 조직을 포함하면 경우에 가능 어렵거나없는 것으로 절편의 원인이됩니다. 단면의 크기 및 적절한 평형 시간은 조직의 무결성을 유지하고 접는 눈물 회피에 결정적이다. 행렬 및 응용 기술의 선택은 검출 될 분석 물의 유형을 결정하는 역할, 공간 해상도, 및 결과의 재현성을 할 것이다. 행렬 또는 적용 기술의 조합을 사?...

대사의 성장 분야는 바이오 마커 발견, 식물과 다른 생물 학적 시스템에 대사 경로를 해독하고, 독성 프로파일 4,6-10 등 많은 중요한 생물 학적 응용 프로그램을하고 있습니다. 시스템 생물학을 공부하고 주요 기술 과제는 그들에게 11을 방해하지 않고 메타 볼로 경로를 연구하는 것입니다. MALDI-MSI는 단일 기관 12, 13, 심지어 하나의 세포 (14, 15)에 분석의 민감한 탐지를 가능하게 손상 조직을 직접 분석 할 수 있습니다. 샘플 준비를 재현하고 신뢰할 수있는 질량 스펙트럼 이미지를 생산하는 중요한 단계입니다. 이미지의 품질이 크게 티슈 매립 매체, 슬라이스 두께, MALDI 매트릭스 및 매트릭스 응용 기술과 같은 요인에 의존한다. 이미징 애플리케이션에 이상적인 단면 두께는 하나의 셀 (시료 유형에 따라 8-20 μM)의 폭이다. MALDI 유기, crystallin의 증착을 필요로E 매트릭스 화합물, 분석 절제 및 이온화를 돕기 위해 샘플에 전형적 약산. 16 다른 행렬들은 상이한 신호 강도, 간섭 이온 및 화합물의 다른 클래스의 이온화 효율을 제공한다. 매트릭스 응용 기술은 또한 질량 스펙트럼 이미지 및 다른 기술의 품질 역할 분석의 다른 클래스에 적합한한다. 세 매트릭스 응용 프로그램의 방법은이 프로토콜에 제시되어있다 : 에어 브러쉬, 자동 분무기, 승화. 에어 브러시 매트릭스 애플리케이션은 광범위 MALDI 이미징에 사용되어왔다. 에어 브러쉬 매트릭스 애플리케이션의 장점은 상대적으로 신속하고 용이하다는 것이다. 그러나, 에어 브러쉬 매트릭스 애플리케이션의 품질은 크게 사용자의 숙련도에 따라 덜 재현 할과 분석 물질의 확산, 특히 작은 분자 (17)을 야기하는 경향이있다. 자동 스프레이 시스템은 매트릭스 애플리케이션 에어 브러시 유사한 기계가 있지만, 근래전자 스프레이 더 재현하고, 수동 에어 브러쉬 응용 프로그램을 볼 수있는 변동성을 제거하기 위해 개발되었습니다. 이 방법은 때로는 더 많은 시간이 소요되는 기존의 에어 브러쉬 매트릭스 응용 프로그램을보다가 될 수 있습니다. 수동 에어 브러쉬 자동 스프레이 시스템은 모두 솔벤트 기반의 매트릭스 응용 프로그램의 방법이다. 그러나, 추출 및 높은 질량 화합물 (18)을 관찰하기 위해 용매 필요한 부족, 승화는 분석 확산을 줄일 수 있기 때문에 대사와 작은 분자의 질량 스펙트럼 이미징 점점 더 인기를 끌고있다 건조 매트릭스 응용 기술이다. 대사의 신분은 일반적으로 탠덤 질량 MS / MS 스펙트럼이 표준, 문학, 또는 이론적 스펙트럼에 비교되는 유효성 검사에 대한 (MS / MS) 실험, 다음 추정 동정을 얻기 위해 정확한 질량 측정이 필요합니다. 이 프로토콜 고해상도 (질량 m / z 400에서 60,000의 분해능), 액체 크로마토 그래피 (LC)-MS는 개자리는 생물학적 시스템으로 뿌리와 뿌리혹을 truncatula 사용하여, 공간 정보 및 내인성 대사의 자신감을 식별 모두를 얻기 위해 MALDI-MSI에 연결된다. MS / MS 실험은 MALDI-MSI 또는 LC-MS와 조직 추출물의 조직에서 직접 수행 및 대사 산물 식별의 유효성 검사에 사용 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 M. 내인성 대사를 매핑 할 수있는 간단한 방법을 제공합니다 적응 및 다양한 조직 유형 및 생물학적 시스템에서 작은 분자 MSI에 적용될 수 truncatula.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1270">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Gelatin</td>
			<td style="width:181px;">Difco</td>
			<td style="width:163px;"><a href="http://catalog.bd.com/bdCat/viewProduct.doCustomer?productNumber=214340">214340</a></td>
			<td style="width:611px;">heat to dissolve</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryostat- HM 550</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:163px;">956564A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">indium tin oxide (ITO)-coated glass slides&#160;</td>
			<td>Delta Technologies</td>
			<td>CB-90IN-S107</td>
			<td>25-75-0.8 mm (width-length-thickness)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix&#160;</td>
			<td>ICN Biomedicals</td>
			<td><a href="http://www.labsource.com/Catalog/Item.aspx?ItemID=1787195">PI90033</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Airbrush</td>
			<td>Paasche Airbrush Company</td>
			<td>TG-100D</td>
			<td>coupled with 75 ml steel container</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Automatic matrix sprayer system- TM-Sprayer</td>
			<td>HTX Technologies, LLC</td>
			<td style="width:163px;">HTX.TMSP.H021-U</td>
			<td>Specific start-up and shut-down instructions will be given when the instrument is installed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sublimation apparatus&#160;</td>
			<td>Chemglass Life Science</td>
			<td style="width:163px;"><a href="http://www.chemglass.com/product_view.asp?pnr=CG-3038">CG-3038-01</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Vaccum pump- Alcatel 2008 A</td>
			<td>Ideal Vacuum Products</td>
			<td>P10976</td>
			<td>Ultimate Pressure = 1x10-4 Torr</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF</td>
			<td style="width:181px;">Bruker Daltonics</td>
			<td style="width:163px;">276601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">FlexImaging</td>
			<td style="width:181px;">Bruker Daltonics</td>
			<td>269841</td>
			<td>One example of &#34;vender specific software&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">MALDI LTQ Orbitrap</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMASZ</td>
			<td>High resolution MALDI instrument for accurate mass measurements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Q Exactive</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td>
			<td>High resolution LC-MS instrument for accurate mass measurements</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

maldi-mass spectrometric imaging for the investigation of metabolites in medicago truncatula root nodules

이러한 의약품 또는 내인성 대사와 같은 작은 분자를 연구 잠재적으로 1 연구되고 대사 경로에 변화를 일으킬 수있는 그 조직의 균질화를 필요로 조직 추출물을 사용하는 데 사용되는 대부분의 기술. 질량 분석 영상 (MSI)은 생체 조직 샘플 1-5의 손상 조각 내 분석의 공간 정보를 제공 할 수있는 강력한 분석 도구입니다. 이 기술은 단백질, 펩티드, 지질과 같은 내인성 대사와 같은 작은 분자를 포함하여 각종 화합물을 연구하기 위해 광범위하게 사용되고있다. 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 (MALDI) MSI와, 다 대사 산물의 공간적 분포를 동시에 검출 할 수있다. 여기서, 콩과의 식물 뿌리와 뿌리혹에 타겟이 불분명 한 대사 MSI의 실험을 위해 특별히 개발 된 방법이 일어나는 생물학적 과정에 대한 통찰력을 표시 할 수있는 표시됩니다.여기에 제시된 방법은 시료 준비에서 이미지 수집으로, 일반적인 MSI의 흐름을 보여주고, 작은 분자를 검출하는 데 도움이되는 여러 매트릭스 응용 프로그램 기술을 시연, 매트릭스 응용 프로그램 단계에 초점을 맞추고 있습니다. MS의 이미지가 생성되면, 그 대사 산물의 분석 및 식별을 논의 보여줍니다. 여기에 제시된 표준 워크 플로우를 쉽게 다른 조직 유형, 분자 종, 및 계측에 대해 수정할 수 있습니다.

MSI의 실험 개요는도 1에 도시된다. 실험의 시작에서, 샘플 준비는 중요한 단계입니다. 결절은 식물 뿌리에서 트리밍 된 젤라틴에 포함됩니다. 이 동결되는 동안 조직은, 아니 거품, 저온 유지 컵에 평평하게 눌러야합니다, 그것은 단면되는 동안이 조직의 쉽고 적절한 정렬을 보장합니다. 조직과 분리 될 때, 적절한 두께로 조직을 절단하기 위해 중요하다; 섹션 너무 두껍게 추출 및 조?...

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MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

질량 분석 영상 (MSI)은 생물 학적 과정에 새로운 통찰력을 제공 할 수있는 자신의 네이티브 환경에서 화합물을 보존, 그대로 조직에서 다양한 화학 종을 발견하고 식별하는 데 사용할 수있는 강력한 도구입니다. 여기서 작은 분자의 분석을 위해 개발 MSI 방법이 설명된다.

의 대사 산물의 조사를위한 MALDI-질량 분석 이미징<em&gt; 개자리 truncatula</em&gt; 루트 결절

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the ...

maldi-mass-spectrometric-imaging-for-investigation-metabolites

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

18.8K 조회수.  University of Wisconsin- Madison.  질량 분석 영상 (MSI)은 생물 학적 과정에 새로운 통찰력을 제공 할 수있는 자신의 네이티브 환경에서 화합물을 보존, 그대로 조직에서 다양한 화학 종을 발견하고 식별하는 데 사용할 수있는 강력한 도구입니다. 여기서 작은 분자의 분석을 위해 개발 MSI 방법이 설명된다. 

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Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays

Similar to Agrobacterium tumerfaciens, Agrobacterium rhizogenes can transfer foreign DNAs into plant cells based on the autonomous root-inducing (Ri) plasmid. A. rhizogenes can cause hairy root formation on plant tissues and form composite plants after transformation. On these composite plants, some of the regenerated roots are transgenic, carrying the wild type T-DNA and the engineered binary vector; while the shoots are still non-transgenic, serving to provide energy and growth support. These hairy root composite plants will not produce transgenic seeds, but there are a number of important features that make these composite plants very useful in plant research. First, with a broad host range,A. rhizogenes can transform many plant species, especially dicots, allowing genetic engineering in a variety of species. Second, A. rhizogenes infect tissues and explants directly; no tissue cultures prior to transformation is necessary to obtain composite plants, making them ideal for transforming recalcitrant plant species. Moreover, transgenic root tissues can be generated in a matter of weeks. For Medicago truncatula, we can obtain transgenic roots in as short as three weeks, faster than normal floral dip Arabidopsis transformation. Overall, the hairy root composite plant technology is a versatile and useful tool to study gene functions and root related-phenotypes. Here we demonstrate how hairy root composite plants can be used to study plant-rhizobium interactions and nodulation in the difficult-to-transform species M. truncatula.

Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays

We demonstrate how hairy root composite plants can be used to study plant-rhizobium interactions and nodulation in the difficult-to-transform species Medicago truncatula.

의 복합 식물의 생성 Medicago truncatula 유괴의 Assays 사용

Similar to Agrobacterium tumerfaciens, Agrobacterium rhizogenes can transfer foreign DNAs into plant cells based on the autonomous root-inducing (Ri) ...

연구

생물학

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The isolated microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of factors that control vessel diameter, and thus, perfusion resistance1-5. This is a classic experimental preparation that was, in large measure, initially described by Uchida et al.15 several decades ago. This initial description provided the basis for the techniques that was extensively modified and enhanced, primarily in the laboratory of Dr. Brian Duling at the University of Virginia6-8, and we present a current approach in the following pages. This preparation will specifically refer to the gracilis arteriole in a rat as the microvessel of choice, but the basic preparation can readily be applied to vessels isolated from nearly any other tissue or organ across species9-13. Mechanical (i.e., dimensional) changes in the isolated microvessels can easily be evaluated in response to a broad array of physiological (e.g., hypoxia, intravascular pressure, or shear) or pharmacological challenges, and can provide insight into mechanistic elements comprising integrated responses in an intact, although ex vivo, tissue. The significance of this method is that it allows for facile manipulation of the influences on the integrated regulation of microvessel diameter, while also allowing for the control of many of the contributions from other sources, including intravascular pressure (myogenic), autonomic innervation, hemodynamic (e.g., shear stress), endothelial dependent or independent stimuli, hormonal, and parenchymal influences, to provide a partial list. Under appropriate experimental conditions and with appropriate goals, this can serve as an advantage over in vivo or in situ tissue/organ preparations, which do not readily allow for the facile control of broader systemic variables. 
The major limitation of this preparation is essentially the consequence of its strengths. By definition, the behavior of these vessels is being studied under conditions where many of the most significant contributors to the regulation of vascular resistance have been removed, including neural, humoral, metabolic, etc. As such, the investigator is cautioned to avoid over-interpretation and extrapolation of the data that are collected utilizing this preparation. The other significant area of concern with regard to this preparation is that it can be very easy to damage cellular components such as the endothelial lining or the vascular smooth muscle, such that variable source of error can be introduced. It is strongly recommended that the individual investigator utilize appropriate measurements to ensure the quality of the preparation, both at the initiation of the experiment and periodically throughout the course of a protocol.

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

An ex vivo preparation is described for isolation of the largest gracilis muscle resistance arterioles for interrogation of both vascular responses to vasoactive stimuli and the assessment of basic structural properties via passive wall mechanics.

예 생체내</em혈관 반응성 조사를위한> 절연 골격 Microvessel 준비

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

사멸 세포 간극의 이미지를하는 동안 라이브<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

성적 증명서와 Metabolites에서의 정화<em&gt; Drosophila</em&gt; 헤드

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

There is an emerging scientific need for reliable tools for monitoring membrane protein transport. We present a methodology leading to the reconstitution of efflux pumps from the Gram-negative bacteria Pseudomonas aeruginosa in a biomimetic environment that allows for an accurate investigation of their activity of transport. Three prerequisites are fulfilled: compartmentation in a lipidic environment, use of a relevant index for transport, and generation of a proton gradient. The membrane protein transporter is reconstituted into liposomes together with bacteriorhodopsin, a light-activated proton pump that generates a proton gradient that is robust as well as reversible and tunable. The activity of the protein is deduced from the pH variations occurring within the liposome, using pyranin, a pH-dependent fluorescent probe. We describe a step-by-step procedure where membrane protein purification, liposome formation, protein reconstitution, and transport analysis are addressed. Although they were specifically designed for an RND transporter, the described methods could potentially be adapted for use with any other membrane protein transporter energized by a proton gradient.

In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

We present a protocol for the in vitro investigation of efflux pumps from Pseudomonas aeruginosa. This protocol allows for the generation of a robust, reversible, and tunable proton gradient within the liposome membrane and hence should be adaptable to any membrane protein energized by the protomotive force.

녹농균에서 MexAB 유출 펌프의 체외 조사

There is an emerging scientific need for reliable tools for monitoring membrane protein transport. We present a methodology leading to the reconstitution ...

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells. In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on unsynchronized cells making it difficult to order the temporal events required for cell cycle progression, genome replication, and division. Caulobacter crescentus provides an excellent model system for the bacterial cell cycle whereby cells can be rapidly synchronized in a G0 state by density centrifugation. Cell cycle synchronization experiments have been used to establish the molecular events governing chromosome replication and segregation, to map a genetic regulatory network controlling cell cycle progression, and to identify the establishment of polar signaling complexes required for asymmetric cell division. Here we provide a detailed protocol for the rapid synchronization of Caulobacter NA1000 cells. Synchronization can be performed in a large-scale format for gene expression profiling and western blot assays, as well as a small-scale format for microscopy or FACS assays. The rapid synchronizability and high cell yields of Caulobacter make this organism a powerful model system for studies of the bacterial cell cycle.

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Synchronization of bacterial cells is essential for studies of the bacterial cell cycle and development. Caulobacter crescentus is synchronizable through density centrifugation allowing a rapid and powerful tool for studies of the bacterial cell cycle. Here we provide a detailed protocol for the synchronization of Caulobacter cells.

의 동기화<em&gt; Caulobacter Crescentus</em&gt; 세균 세포주기의 조사에 대한

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The contractile characteristics can be evaluated independently of external influences such as vascular tonus or neurohumoral status. It depicts a scientific approach between single cell measurements with isolated cardiac myocytes and in vivo studies like echocardiography. Thus, papillary muscle preparations serve as an excellent model to study cardiac physiology/pathophysiology and can be used for investigations like the modulation by pharmacological agents or the exploration of transgenic animal models. Here, we describe a method of isolating the murine left anterior papillary muscle to investigate cardiac contractility in an organ bath setup. In contrast to a muscle strip preparation isolated from the ventricular wall, the papillary muscle can be prepared in toto without damaging the muscle tissue severely. The organ bath setup consists of several temperature-controlled, gassed and electrode-equipped organ bath chambers. The isolated papillary muscle is fixed in the organ bath chamber and electrically stimulated. The evoked twitch force is recorded using a pressure transducer and parameters such as twitch force amplitude and twitch kinetics are analyzed. Different experimental protocols can be performed to investigate the calcium- and frequency-dependent contractility as well as dose-response curves of contractile agents such as catecholamines or other pharmaceuticals. Additionally, pathologic conditions like acute ischemia can be simulated.

Murine left ventricular papillary muscle can be used to investigate cardiac contractility in vitro. This article describes in detail the isolation and experimental protocols to study cardiac contractile characteristics.

마우스의 심장 수축력의 조사에 대 한 격리 유두 근육의 수축력 측정

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The ...

MRM Microcoil Performance Calibration and Usage Demonstrated on Medicago truncatula Roots at 22 T

This protocol describes a signal-to-noise ratio (SNR) calibration and sample preparation method for solenoidal microcoils combined with biological samples, designed for high-resolution magnetic resonance imaging (MRI), also referred to as MR microscopy (MRM). It may be used at pre-clinical MRI spectrometers, demonstrated on Medicago truncatula root samples. Microcoils increase sensitivity by matching the size of the RF resonator to the size of the sample of interest, thereby enabling higher image resolutions in a given data acquisition time. Due to the relatively simple design, solenoidal microcoils are straightforward and cheap to construct and can be easily adapted to the sample requirements. Systematically, we explain how to calibrate new or home-built microcoils, using a reference solution. The calibration steps include: pulse power determination using a nutation curve; estimation of RF-field homogeneity; and calculating a volume-normalized signal-to-noise ratio (SNR) using standard pulse sequences. Important steps in sample preparation for small biological samples are discussed, as well as possible mitigating factors such as magnetic susceptibility differences. The applications of an optimized solenoid coil are demonstrated by high-resolution (13 x 13 x 13 &#956;m3, 2.2 pL) 3D imaging of a root sample.

MRM Microcoil Performance Calibration and Usage Demonstrated on Medicago truncatula Roots at 22 T

A protocol to study biological tissue at high spatial resolution using ultra-high field magnetic resonance microscopy (MRM) using microcoils is presented. Step-by-step instructions are provided for characterizing the microcoils. Finally, optimization of imaging is demonstrated on plant roots.

MRM 마이크로코일 성능 교정 및 사용 에 설명 된 메디카고 트런카툴라 뿌리에 22 T

This protocol describes a signal-to-noise ratio (SNR) calibration and sample preparation method for solenoidal microcoils combined with biological ...

Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to investigate the biological activities during development and diseases. Metabolomics approaches&#160;are widely employed in the study of cancer, nutrition/diet, diabetes, and other physiological and pathological conditions involving metabolic processes. An advantageous tool that aids in metabolomic profiling advocated in this paper is matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI). Its ability to detect metabolites in situ without labeling, structural modifications, or other specialized reagents, such as those used in immunostaining, makes MALDI MSI a unique tool in advancing methodologies relevant in the field of metabolomics. An appropriate sample preparation process is critical to yield optimal results and will be the focus of this paper.

The goal of this protocol is to provide detailed guidance on the sample preparation when planning for experiments using MALDI MSI to maximize metabolic and molecular detection in biological samples.

MALDI 질량 분광화상 영상을 이용한 대사 프로파일링을 위한 샘플 준비

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to ...

Divergence of Root Microbiota in Different Habitats based on Weighted Correlation Networks

The root microbiome plays an important role in plant growth and environmental adaptation. Network analysis is an important tool for studying communities, which can effectively explore the interaction relationship or co-occurrence model of different microbial species in different environments. The purpose of this manuscript is to provide details on how to use the weighted correlation network algorithm to analyze different co-occurrence networks that may occur in microbial communities due to different ecological environments. All analysis of the experiment is performed in the WGCNA package. WGCNA is an R package for weighted correlation network analysis. The experimental data used to demonstrate these methods were microbial community data from the NCBI (National Center for Biotechnology Information) database for three niches of the rice (Oryza sativa) root system. We used the weighted correlation network algorithm to construct co-abundance networks of microbial community in each of the three niches. Then, differential co-abundance networks among endosphere, rhizoplane and rhizosphere soil were identified. In addition, the core genera in network were obtained by the "WGCNA" package, which plays an important regulated role in network functions. These methods enable researchers to analyze the response of microbial network to environmental disturbance and verify different microbial ecological response theories. The results of these methods show that the significant differential microbial networks identified in the endosphere, rhizoplane and rhizosphere soil of rice.

Network analysis was applied to evaluate the association of various ecological microbial communities, such as soil, water and rhizosphere. Presented here is a protocol on how to use the WGCNA algorithm to analyze different co-occurrence networks that may occur in the microbial communities due to different ecological environments.

가중 상관 관계 네트워크에 따라 다른 서식지에서 루트 미생물의 발산

The root microbiome plays an important role in plant growth and environmental adaptation. Network analysis is an important tool for studying communities, ...