Este trabajo fue apoyado por el Research Triangle MRSEC de la NSF (DMR-1121107).

1. ELP Expresión <ol><li> Inocular 3 ml de medio Terrific Broth estériles con una madre de DMSO o colonia placa de agar de E. coli adecuado para la expresión de proteínas que contiene el plásmido ELP-codificación deseada bajo el control del promotor lac de T7. Añadir el antibiótico apropiado e incubar a 37 ° C durante la noche (O / N) con agitación continua a 200 rpm. </li><li> Añadir 1 ml del cultivo O / N para 1 l de caldo Terrific Broth medio estéril en un matraz de 4-L. Añadir el antibiótico apropiado e incubar a 37 ° C durante 24 h con agitación continua a 200 rpm. NOTA: El &quot;fugas&quot; expresión basal visto con el promotor T7-lac es suficiente para la expresión de alto nivel de muchos ELPs si el cultivo se incuba durante 24 horas. Sin embargo, un enfoque más convencional se puede utilizar, en el que la expresión de proteínas es inducida por la adición de 0,2-1 mM de isopropil-beta-D-tiogalactósido (IPTG) cuando la densidad óptica del cultivo alcanza 0,6. </li&gt; <li> Transferir el cultivo del matraz de 4-L a una botella de centrifugación de 1 l y se centrifuga a 4 ° C durante 15 min a 2000 x g. </li><li> Eliminar el sobrenadante. NOTA: Si se cultiva más de 1 litro de la cultura que se pueden condensar añadiendo otro litro de cultivo al sedimento y el paso 1.3 repitiendo. Hasta 2 l de cultivo se puede condensar en una sola sedimento celular. </li><li> Resuspender el sedimento en tampón fosfato salino (PBS), agua, u otro tampón deseado para llegar a 45 ml de suspensión de células y la transferencia a un tubo cónico de 50 ml. </li></ol> 2 de purificación: ELP. Pasos preliminares y Primera Ronda de Inverse Transición Ciclismo <ol><li> Sonicar el sedimento celular se resuspendió por un total de 9 minutos en ciclos de 10 seg &#39;ON&#39; y 20 seg &quot;off&quot; en una potencia de salida de 85 W, mientras se mantiene la muestra en hielo. Brevemente dejar que la muestra se enfríe sobre hielo y luego repetir el ciclo de 9 min, una vez más. NOTA: Si se ha previsto la ELP tener una T muy baja t </Sub&gt; el intervalo de &quot;off&quot; se puede aumentar hasta 40 seg para evitar el calentamiento de la solución por encima de la T t. </li><li> Transferir el lisado a un redondo de 50 ml tubo de centrífuga de fondo. </li><li> Añadir 2 ml de 10% (w / v) de polietilenimina (PEI) para cada litro de cultivo y agitar para mezclar. NOTA: PEI es un polímero cargado positivamente que ayuda en la condensación de contaminantes genéticos cargados negativamente. No realice este paso si el ELP está cargado negativamente, ya que el PEI también puede condensar y eliminar el producto ELP. </li><li> Centrifugar a 4 ° C durante 10 min a 16.000 x g. </li><li> Transferir el sobrenadante a un limpio redondo de 50 ml tubo de centrífuga inferior y desechar el sedimento. </li><li> Opcional &quot;bake out&quot; paso: Se incuba la muestra a 60 ° C durante 10 min para desnaturalizar proteínas contaminantes y luego se transfieren a 4 ° C o en hielo hasta que el ELP está completamente resolubilizó. Centrifugar la muestra a 4 º C durante 10 min a 16.000 x g. Transferir el sobrenadante a un clean redondo de 50 ml tubo de centrífuga inferior y desechar el sedimento. NOTA: No realice este paso si un péptido o proteína se fusiona a la ELP y se espera que para desnaturalizar en la condición de calor elevada. Esto puede causar la transición ELP se convierta en calor irreversibles o pueden destruir la actividad de la fracción de condensado. </li><li> Inducir la transición ELP con la adición de NaCl cristalino (no superior a 3 M). Alternativamente, citrato de sodio (no superior a 0,3 M) se puede utilizar para ELPs que tienen una mayor T t s o bajos rendimientos. NOTA: La solución debe girar nublado una vez que la sal se haya disuelto, lo que indica la separación de fases de ELP de la solución. ELPs Muy hidrófilos con alta T t s pueden requerir algún grado de calefacción, en combinación con la adición de sal, para inducir la separación de fases de la ELP en esta inducción preliminar de la transición ELP. </li><li> Centrifugar a temperatue ambiente (TA) durante 10 minutos a 16.000 xg (spin caliente). NOTA: Un pellet ELP debería se observado, cuyo tamaño depende de la rendimiento de expresión de la ELP. Este pellet ELP puede parecer a primera vista opaca, pero después de enfriarlo aparecerá translúcido y puede ser de color marrón. El pellet ELP será más incoloro como se quitan los ingresos de purificación y contaminantes. </li><li> Eliminar el sobrenadante y añadir 1-5 ml de tampón deseado a la pastilla. Resuspender el precipitado mediante pipeteado o establecer el tubo para girar a 4 ° C. NOTA: El volumen requerido de tampón dependerá del tamaño de la pastilla ELP, y por lo tanto el rendimiento de la expresión de ELP, donde se debe añadir una cantidad suficiente de tampón para permitir la resolubilización de la pastilla ELP. ELPs con alto contenido de cisteína beneficio de la purificación en agua con 10 mM Tris clorhidrato de (2-carboxietil) fosfina (TCEP-HCl) a un pH de 7 a eliminar las interacciones disulfuro con proteínas contaminantes. ELPs con alto contenido de carga en beneficio de la purificación a un pH ajustado para neutralizar su carga y reducir los elementosinteracciones ctrostatic con proteínas contaminantes. </li><li> Transferir la solución ELP resuspendido en alícuotas de 1 ml en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml limpio. </li><li> Centrifugar a 4 ° C durante 10 min a 16.000 xg (centrifugado en frío). Se debería observar un pequeño gránulo de contaminantes insolubles. </li><li> Transferir el sobrenadante a un tubo limpio y desechar el sedimento. </li></ol> . 3 ELP Purificación: las siguientes rondas de Inverse Transición Ciclismo <ol><li> Inducir la transición ELP con calor y / o la adición de NaCl. Las muestras pueden incubarse en un bloque de calor o en un baño de agua durante 15 min a una temperatura por encima de la T t. Si, sin embargo, el ELP está fusionado a una proteína (que impide el uso de calor) o si el PDA tiene una alta T T que no se puede llegar con calor solo, una solución 5 M de NaCl puede ser añadido gota a gota para inducir la transición ELP. NOTA: La solución debe girar nublado, lo que indica la separación de fases del ELP de la solución. </li><li&gt; Se centrifuga durante 10 min a 16.000 xg (spin caliente). Si se utiliza el calor en el paso 3.1, realizar esta etapa de centrifugación a una temperatura superior que la que se requiere para inducir la transición ELP. Si solo de NaCl se utilizó en el paso 3.1, realizar esta etapa de centrifugación a TA. NOTA: debe observarse un sedimento de ELP. </li><li> Descartar el sobrenadante, añadir 500-750 l de tampón deseado, y resuspender el precipitado mediante pipeteado o establecer el tubo para girar a 4 ° C. </li><li> Centrifugar a 4 ° C durante 10 min a 16.000 xg (centrifugado en frío). Se debería observar un pequeño gránulo de contaminantes insolubles. </li><li> Transferir el sobrenadante a un tubo limpio y desechar el sedimento. </li><li> Repita los pasos 3.1 a 3.5 hasta que desaparezca la pelotilla contaminante durante el paso 3.4. </li></ol> 4. Tratamiento Post-purificación (opcional) <ol><li> Si se desea, la muestra se dializa frente a un tampón adecuado para eliminar el exceso de sal de la solución purificada ELP. NOTA: ELPs a liofilizar deben serdializados contra ddH 2 OO / N a 4 ° C. </li><li> Si se desea, liofilizar la ELP para el almacenamiento a largo plazo mediante la congelación de la solución a -80 º C durante 30 min antes de la liofilización de O / N. NOTA: La liofilización no se debe utilizar para ELPs con proteínas adjuntas. </li><li> Si se desea, recuperar el péptido o proteína libre de un péptido o proteína de fusión ELP mediante la eliminación de la etiqueta ELP: <ol><li> Se digiere el péptido o proteína de fusión con la proteasa ELP biotinilado (según lo recomendado por el proveedor de la proteasa) o con una fusión ELP proteasa correspondiente al sitio de proteasa diseñado genéticamente entre el péptido o proteína y ELP. </li><li> Si procede, extraiga la proteasa biotinilado utilizando perlas modificada con estreptavidina (según lo recomendado por el proveedor de la proteasa). </li><li> Inducir la transición de la ELP escindido y / o ELP de fusión de la proteasa mediante la adición gota a gota de una solución 5 M de NaCl. </li><li> Centrifugar a TA durante 10 min a 16.000 x g. NOTA: debe observarse un sedimento de ELP. </li><li>Recoger el sobrenadante y desechar el sedimento de ELP. Se dializa el sobrenadante frente a un tampón deseado o utilizar un filtro centrífugo para llevar a cabo un intercambio de tampón con el fin de eliminar la alta concentración de sal a partir del péptido puro o solución de proteína. </li><li> Confirmar la escisión completa de péptido libre o la proteína de la etiqueta ELP por dodecil sulfato de sodio electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). </li></ol></li></ol> 5 Caracterización:. SDS-PAGE <ol><li> Preparar muestras ELP para SDS-PAGE al mezclar 10 l de ELP diluidas en agua con 10 l de tampón de muestra que contenía 2-mercaptoetanol. NOTA: 40 g de ELP es a menudo suficiente para evaluar el tamaño y la pureza del producto ELP. </li><li> Incubar la muestra a 100 ° C durante 2 min y luego cargar en un gel de poliacrilamida, junto con una escalera de proteína de tamaño adecuado. </li><li> Correr el gel a 180 V hasta que el colorante se aproxima a la parte inferior del gel (aproximadamente 45 min). </li><li> Tiña elgel con una solución 0,5 M de CuCl 2 durante 5 min, mientras se balancea. NOTA: ELPs normalmente no se visualizaron por tinción Coomassie Brilliant Azul, ya que algunas secuencias de ELP no interactúan con este colorante. Azul Brillante de Coomassie interactúa principalmente con los residuos de arginina e interactúa débilmente con otros residuos de histidina-básico y de lisina-y aromáticos residuos de triptófano, tirosina, fenilalanina y 26. Por lo tanto ELPs y el péptido o proteína ELP fusiones pueden ser teñidas con Azul Brillante de Coomassie sólo si su secuencia primaria incluye un número suficiente de estos residuos específicos. </li><li> Compruebe que el MW de la banda ELP corresponde a la de la MW teórico esperado a partir del gen ELP y que no hay bandas de contaminantes extraños están presentes. NOTA: Algunos ELPs migran con una aparente MW hasta un 20% más alto que su MW esperado 9, 27. </li></ol> 6 Caracterización:. Desorción por láser asistida por matriz /ionización tiempo de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF-MS) <ol><li> Preparar una solución ELP en acetonitrilo acuoso al 50% que contiene ácido trifluoroacético al 0,1% para lograr una concentración de ELP de aproximadamente 25 mM. NOTA: Esta solución debe estar libre de sal, para ELP debe dializa contra H2O después de la purificación. </li><li> Preparar una solución de matriz de ácido sinapínico saturado en acetonitrilo acuoso al 50% que contiene ácido trifluoroacético al 0,1%. </li><li> Añadir 1 l de la solución ELP a 9 l de la disolución de matriz para lograr una concentración de ELP de aproximadamente 2,5 pmol / l. NOTA: Esta mezcla puede diluirse adicionalmente con una solución de matriz para optimizar la señal de MALDI-TOF. </li><li> Depósito 1-2 l de mezcla ELP-matriz sobre una placa de MALDI de metal y dejó el lugar se seque por completo. </li><li> Obtener 5-10 espectros con MALDI-TOF para determinar la masa a carga (m / z) de la ELP y deducir su MW medido. </li></ol> 7. Characterization: La temperatura programada turbidimétrico y dispersión de luz dinámica <ol><li> Determine la camiseta t del PEL por turbidimetría a temperatura programada: <ol><li> Preparar una serie de diluciones (por ejemplo, de 5-100 mM) de soluciones de ELP en el tampón deseado. </li><li> El uso de un espectrofotómetro UV-Vis de temperatura controlada, medir la densidad óptica (DO) a 350 nm en una gama de temperaturas (por ejemplo, 20-80 ° C) a una velocidad de calentamiento de 1 º C / min. NOTA: Si no se observa incremento en la OD T t puede superar el límite superior de temperatura del instrumento. La aparente T t puede ser reducida por la adición de NaCl. Empiece en 1 M de NaCl y aumentar en pasos de 0,5 M hasta que se detecta la transición ELP dentro de un rango de temperatura mensurable. </li><li> Verificar la reversibilidad de la transición ELP midiendo la disminución en la OD en el mismo rango de temperatura a una velocidad de enfriamiento de 1 º C / min. </li><li> Determine la camiseta t del homopolímero ELP identificando el punto del perfil de turbidez de inflexión (OD representa gráficamente frente a la temperatura). NOTA: Esta temperatura puede ser fácilmente definido a partir de la derivada de la curva de OD, donde la temperatura correspondiente al máximo de la derivada se define como el T T. Arquitecturas ELP más complejos se mostrarán los perfiles de turbidez más complicados y deben ser analizados adicionalmente como se describe en la sección 7.2. </li></ol></li><li> Caracterización adicional de ELPs que muestran propiedades térmicas más complejos (por ejemplo, copolímeros de bloque doble ELP que la auto-ensamblan para formar micelas esféricas) se logra mediante dispersión de luz dinámica (DLS): <ol><li> Preparar una solución ELP en el tampón deseado y pasar la muestra a través de un filtro con un tamaño de poro 20-450 nm. NOTA: La elección de filtro de tamaño de poro dependerá de la presencia, el tamaño, y la estabilidad de los ensamblados ELP en solución. Se prefiere el tamaño de poro del filtro más pequeño posible para eliminar contaminantes, tales comopolvo, que disminuyen la calidad de las mediciones DLS. Un filtro de tamaño de poro más grande debe ser utilizada cuando se experimenta una resistencia significativa al pasar a través de una solución ELP pequeños tamaños de poro del filtro. </li><li> Medir el radio hidrodinámico (C H) en un rango de temperaturas que corresponde a una región de interés identificada en el perfil de turbidez. NOTA: unimers ELP tienen típicamente un C H &lt;10 nm, las asambleas de nanopartículas tienen un R H ~ 20-100 nm, y los agregados tienen un R H&gt; 500 nm. Cada aumento en C H debe corresponder a un aumento en la DO a 350 nm medido por espectrofotometría UV-Vis como una función de la temperatura, que es proporcional al tamaño de la partícula. </li></ol></li></ol>

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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+purification+by+reversible+phase+transition+following+Escherichia+coli+expression+of+genes+encoding+up+to+251+repeats+of+the+elastomeric+pentapeptide+GVGVP.">Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP.</a> Protein expression and purification. 7, 51-57 (1996).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+proteins+by+fusion+with+thermally-responsive+polypeptides.">Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides.</a> Nat Biotechnol. 17, 1112-1115 (1999).</li><li>McDaniel, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+thermally+responsive+nanoparticles+of+a+genetically+encoded+peptide+polymer+by+drug+conjugation.">Self-assembly of thermally responsive nanoparticles of a genetically encoded peptide polymer by drug conjugation.</a> Angewandte Chemie. 52, 1683-1687 (2013).</li></ol>

Los autores no tienen intereses financieros en competencia a revelar.

ELPs ofrecen un medio económico y de cromatografía-libre de la purificación mediante la explotación de su comportamiento de fase de estímulo sensible. Este enfoque se aprovecha de el comportamiento LCST de PEL y péptido o proteína ELP fusiones para eliminar ambos contaminantes solubles e insolubles después de la expresión de ELPs codificados genéticamente en E. coli. Esta facilidad de purificación puede ser utilizado para producir ELPs para una variedad de aplicaciones, o se puede explotar para la purificación de péptidos o proteínas recombinantes en la que el ELP puede actuar como una etiqueta de purificación que se puede eliminar con el procesamiento post-purificación. Purificación ELP implica pasos preliminares para la lisis de la E. coli y eliminar los residuos celulares genómico e insoluble del lisado de cultivo bruto (Figura 1), seguido de la eliminación de los contaminantes solubles e insolubles residuales por el CCI (Figura 2). La centrifugación después de la activación de la transición ELP por la adiciónción de calor o sal se separa el PEL de los contaminantes solubles en el sobrenadante, en un paso denomina un giro caliente. Después de resolubilizing la ELP, la solución se centrifugó de nuevo a una temperatura por debajo de la T t para eliminar el sedimento contaminante insoluble, en un paso denomina un giro frío. Alterna giros calientes y frías mejora la pureza de la solución ELP con cada ciclo, en un pequeño coste para producir. Rendimientos de purificación varían dependiendo de la ELP T t, longitud y péptidos o proteínas fusionadas. Por lo general, este protocolo se obtiene 100 mg de ELP purificado por litro de E. cultivo de E. coli, sin embargo los rendimientos puede alcanzar hasta 500 mg / L. La pureza final del producto ELP se confirmó por SDS-PAGE (Figura 3). El MW de la purificado ELP debe coincidir estrechamente con el MW teórico codificada por el gen ELP. Sin embargo, algunos ELPs migran en SDS-PAGE con un peso molecular aparente de hasta 20% más alto que su MW esperado 9, 27. Un análisis más preciso de la ELPMW se puede lograr mediante MALDI-TOF-MS, que también puede proporcionar información adicional sobre la pureza del producto ELP junto con las técnicas analíticas ortogonales tales como la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Después de la purificación, el ELP T t se mide por turbidimetría a temperatura programada. Esta técnica monitoriza la OD de una solución ELP mientras que la temperatura se incrementa. El T t es dependiente de la concentración por lo que es recomendable para caracterizar una serie de concentración correspondiente a la aplicación prevista del ELP. Para ELP homopolímeros del perfil de turbidez exhibe un único incremento brusco que corresponde a la transición ELP de Unimer agregados a escala micrométrica (Figura 4A). El T t se define como la temperatura correspondiente al punto de inflexión en el perfil de turbidez, determinado con precisión como el máximo de la primera derivada de la OD con respecto a la temperatura. La reversibilidad de laTransición de fase ELP se confirmó por una disminución en la OD a la línea base como se baja la temperatura por debajo de la T T (Figura 4B). El perfil de la turbiedad con el aumento y la disminución de rampas de temperatura será diferente en magnitud y la cinética debido a la sedimentación de coacervados ELP e histéresis variable del ELP resolubilización. Péptido o proteína ELP fusiones exhiben de manera similar comportamiento LCST de esta manera, donde el péptido o proteína fusionada a la ELP afecta a la T t. Para la proteína ELP fusiona la transición es reversible por debajo de la temperatura de fusión de la proteína. Mientras turbidimetría a temperatura programada es un método excelente para la caracterización térmica inicial de productos ELP, técnicas alternativas, tales como calorimetría diferencial de barrido (DSC), también se puede utilizar para medir la ELP T t. ELPs con más complejas arquitecturas de exposiciones más complicados comportamientos térmicos que también se pueden caracterizar por la temperatura progra-turbidimetría nmed. Copolímeros de dos bloques ELP, por ejemplo, exhiben un perfil de turbidez característica correspondiente a su temperatura de auto-ensamblaje-desencadenado en micelas esféricas a su temperatura crítica de formación de micelas. Para este tipo de copolímeros de dos bloques ELP la OD típicamente primero aumenta 0,1-0,5 unidades por encima de la línea de base que indican la transición de la unimers a las micelas, después de que un fuerte aumento de la OD (hasta 2,0 unidades por encima de la línea de base) a una temperatura más alta indica la formación de escala micrométrica agregados (Figura 5a). Información adicional sobre los auto-ensambladas estructuras ELP temperatura provocado se obtiene con DLS, una técnica que mide la R H de las asambleas de ELP en solución. Los cambios en C H están de acuerdo estrechamente con los cambios en la DO medidos con turbidimetría (Figura 5B). Unimers ELP exhiben típicamente un C H &lt;10 nm, mientras que conjuntos de nanopartículas presentan un C H ~ 20-100 nm y agregados exhibir un C H </sub &gt;&gt; 500 nm. Información adicional sobre las nanopartículas ELP auto-ensambladas, como el número de agregación y la morfología, se puede obtener mediante dispersión de luz estática o la microscopía electrónica de transmisión criogénica 17, 23, 29. Debido a la capacidad de ajuste de las propiedades térmicas de ELP, una gama de T t s se obtiene mediante varios diseños ELP. Es importante tener en cuenta que la inherente T t influirá la optimización del protocolo de purificación para cada ELP, donde extremadamente alta o baja T t s requerirá más modificaciones a este protocolo estándar. ELPs con temperaturas extremadamente altas de transición pueden ser inadecuados para la purificación con este enfoque. Si el diseño de nuevos ELPs y péptidos o proteínas ELP fusiones puede comprometer la respuesta térmica de la ELP, una simple etiqueta de histidina puede ser incluido para la purificación alternativa mediante cromatografía de afinidad con metal inmovilizado. Además,características de la secuencia ELP pueden requerir la modificación de este protocolo si el resto de huéspedes está cargada. La manipulación de la solución tampón de pH se puede utilizar como un método para cambiar la carga total de la ELP en un esfuerzo para eliminar interacciones electrostáticas con los contaminantes 17. Además, este protocolo es apropiado para la circunstancia especial de las fusiones ELP con péptidos y proteínas cuando se toman las medidas apropiadas para garantizar que el proceso de purificación no perturba la actividad de la fracción fundida. Notas de todo el protocolo sobre las modificaciones sirven para dirigir la purificación de ELPs que pueden presentar estos retos con respecto a T t, cargo o preocupaciones de fusión. La purificación de ELPs por medio de su comportamiento LCST presenta un enfoque sencillo y cromatografía de libre para purificar la mayoría de los PEL y péptido o proteína ELP fusiones expresado en E. coli. El protocolo que aquí se resume permite la purificación of ELPs en un solo día utilizando el equipo que es común a la mayoría de los laboratorios de biología. La facilidad de purificación de ELPs y sus fusiones será, esperamos, fomentar una diversidad cada vez mayor de diseños ELP para nuevas aplicaciones en la ciencia de materiales, la biotecnología y la medicina.

Polipéptidos elastina-como (ELPS) son biopolímeros formados por la repetición VPGXG pentapéptido donde X, el residuo de invitados, es cualquier aminoácido excepto prolina. ELPs exhibición temperatura de solución crítica inferior (LCST) comportamiento de transición de fase, de tal manera que una solución homogénea ELP se separará en dos fases con el calentamiento a su LCST, que comúnmente se llama la temperatura de transición inversa (T t) en la literatura ELP 1. Las dos fases se componen de una fase muy diluida glóbulo ELP y una fase rica en sedimentos ELP. Los ricos sedimentos ELP se forma en un corto plazo de tiempo tras la agregación de las cadenas de ELP en partículas de tamaño micrométrico que posteriormente se unen. Este comportamiento se produce en un intervalo de pocos grados Celsius y es normalmente reversible, como se recupera una solución homogénea al regresar a una temperatura por debajo de la T t. ELPs se sintetizan típicamente en Escherichia coli (E. coli) lado a otrom un gen artificial que se ligó en un plásmido de expresión. Este plásmido se transforma entonces en una E. línea celular coli que es óptimo para la expresión de proteínas. Hemos utilizado exclusivamente el sistema de vector T7-lac pET para la expresión de una gran variedad de ELPs en E. coli, aunque otros sistemas de expresión en levadura 2-4, 5 hongos, plantas y 6-8 también han sido utilizadas por otros investigadores. Una serie de enfoques que existen para construir genéticamente genes repetitivos ELP, incluyendo ligadura recursiva direccional (RDL) 9, la ligadura direccional recursiva por la reconstrucción plásmido (Pre-RDL) 10, y la superposición de extensión amplificación por círculo rodante (OERCA) 11. La capacidad para diseñar ELPs a nivel genético brinda la oportunidad de utilizar técnicas de ADN recombinante para crear ELPs con una variedad de arquitecturas (por ejemplo, monobloques, dibloques, tribloques, etc), que se puede añadir adicionalmente con funcionalespéptidos y proteínas. De control a nivel genético también se asegura de que cada ELP se expresa con la longitud y la composición dictados por su plantilla plásmido genética exacta, proporcionando productos de biopolímeros perfectamente monodispersas. Las propiedades térmicas de cada ELP dependen de parámetros intrínsecos a la biopolímero tal como su peso molecular (MW) y la secuencia, así como los factores extrínsecos incluyendo su concentración en la solución y la presencia de otros cosolutos, tales como sales. La longitud de la ELP 12 y su composición residuo huésped 1, 13, 14 son dos parámetros ortogonales en el diseño de ELP que se pueden utilizar para controlar la T t, donde los residuos hidrofóbicos de los huéspedes y longitudes de cadena más larga da como resultado menor T t s, mientras que hidrófilo residuos de huéspedes y longitudes de cadena más corta resultan en una mayor T t s. Concentración ELP está inversamente relacionada con la T t, donde las soluciones de GRconcentración ELP comedor tiene menor T t s 12. El tipo y la concentración de sales también influyen en la ELP T t, donde el efecto de las sales sigue la serie de Hofmeister 15. Aniones Kosmotropic (Cl - y más alto en la serie de Hofmeister) bajan el ELP T t y aumentando la concentración de sal aumenta este efecto. Estos parámetros intrínsecos y extrínsecos pueden ajustarse para obtener comportamiento térmico dentro de un rango de temperatura objetivo que se requiere para una aplicación específica de un ELP. El comportamiento de respuesta de estímulo-PEL es útil para una amplia gama de aplicaciones, incluyendo biosensores 16, 17, la ingeniería de tejidos 18, y de suministro de medicamento 19, 20. Además, cuando ELPs se fusionan a péptidos o proteínas a nivel genético, el ELP puede servir como una simple etiqueta de purificación para proporcionar un método por lotes de bajo costo para la purificación de Pep recombinantemareas o proteínas que no requiere de cromatografía 21. Modificación del proceso de purificación asegura que se mantiene la actividad del péptido o proteína fusionada a la ELP. Péptido o proteína ELP fusiones pueden ser purificados para aplicaciones en las que la etiqueta ELP es útil 22, 23 o, alternativamente, cuando se requiere el péptido o la proteína libre, un sitio de reconocimiento de la proteasa puede ser insertado entre el péptido o proteína y ELP. La eliminación de la etiqueta ELP puede entonces lograrse mediante la digestión con proteasa libre o una fusión ELP proteasa, donde este último ofrece la facilidad adicional de procesamiento como una ronda final de purificación ELP puede separar la etiqueta y la proteasa ELP ELP fusión del péptido diana o proteína en un solo paso 24, 25. El siguiente protocolo describe el procedimiento de purificación para ELPs y péptidos o proteínas ELP fusiones por medio de sus propiedades térmicas y se analizan las técnicas básicas para la caracterizaciónla respuesta térmica de productos ELP.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1503">
	<tbody>
		<tr>
			<td>pET-24a(+) 
			pET-25b(+)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69749-3 
			69753-3</td>
			<td>T7-lac expression vectors with resistance to kanamycin (pET-24) or ampicillin (pET-25).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra BL21 (DE3) competent cells</td>
			<td>Edge BioSystems</td>
			<td>45363</td>
			<td>Competent E. coli for recombinant protein expression.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth (TB) Dry Powder Growth Media</td>
			<td>MO BIO Laboratories</td>
			<td>12105</td>
			<td>Media is reconstituted in DI H2O and autoclaved before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I2481C</td>
			<td>IPTG is reconstituted in DI H2O, sterile filtered, and added to cultures to induce enhanced expression.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) tablet</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>524650</td>
			<td>These PBS tablets, when dissolved in 1 L of DI H2O, yield a 10 mM phosphate buffer with 140 mM NaCl, and 3 mM KCl with a pH of 7.4 at 25 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethyleneimine (PEI) Solution (~50% w/v)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>195444</td>
			<td>PEI is prepared as a 10% (w/v) solution in deionized H2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Oak Ridge high-speed centrifuge tubes, 50 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3138-0050</td>
			<td>These round-bottom tubes withstand high-speed centrifugation of 30-50 ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP-HCl)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20491</td>
			<td>A stock solution of TCEP-HCl is prepared at 100 mM in DI H2O and adjusted to pH 7.0. For ELPs with a high cysteine content the stock solution of this reducing agent is added to the ELP pellet to reach 10 mM in H2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ready Gel Tris-HCL gel, 4-20% linear gradient polyacrylamide gel, 10 well, 30 &#956;l</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>161-1105</td>
			<td>These linear gradient gels offer good visualization of ELPs with a range of MWs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cupric chloride dihydrate (CuCl2-2H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C454-500</td>
			<td>A filtered 0.5 M solution is prepared for negative staining of Tris-HCL polyacrylamide gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anotop 10 syringe filter: 
			0.02 &#956;m 
			0.1 &#956;m 
			0.2 &#956;m</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>6809-1002 
			6809-1012 
			6809-1022</td>
			<td>These 10 mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes for DLS measurements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV filter: 
			0.45 &#956;m</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLHVX13NK</td>
			<td>These 13 mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes of solutions with large nanoparticle assemblies for DLS measurements.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-chromatographic purification of recombinant elastin-like polypeptides and their fusions with peptides and proteins from escherichia coli

Polipéptidos elastina-como son biopolímeros repetitivas que exhiben un comportamiento de transición de fases temperatura de solución crítica inferior, unimers solubles existente por debajo de una temperatura de transición característica y la agregación en coacervados escala de micras por encima de su temperatura de transición. El diseño de polipéptidos-elastina como a nivel genético permite un control preciso de su secuencia y longitud, que determina sus propiedades térmicas. Polipéptidos Elastina-como se utilizan en una variedad de aplicaciones, incluyendo biosensores, la ingeniería de tejidos, y la administración de fármacos, donde la temperatura de transición y la arquitectura biopolímero de la ELP se pueden sintonizar para la aplicación específica de interés. Además, el comportamiento de transición de fase la temperatura de solución crítica inferior de polipéptidos tipo elastina permite su purificación por su respuesta térmica, de tal manera que su coacervación selectivo y resolubilización permite la eliminación de tanto contaminante soluble e insolubles siguiente expresión en Escherichia coli. Este enfoque puede ser utilizado para la purificación de polipéptidos tipo elastina solos o como una herramienta para la purificación de péptidos o proteínas fusiones donde péptidos recombinantes o proteínas adjuntas genéticamente para etiquetas de polipéptidos tipo elastina se pueden purificar sin cromatografía. Este protocolo describe la purificación de polipéptidos tipo elastina y sus péptidos o proteínas fusiones y discute técnicas básicas de caracterización para evaluar el comportamiento térmico de productos de polipéptidos tipo elastina puros.

Aquí se describen los resultados representativos para la purificación y caracterización de un homopolímero de ELP y un copolímero de dos bloques ELP. Después de 24 h de expresión en E. coli, las células se recogieron por centrifugación y se lisaron por sonicación. Típicamente, un cambio sutil en color se produce después de la sonicación, confirmando la lisis celular suficiente (Figura 1A). Después de la adición de PEI, componentes genómicos y los restos celulares se recogieron por centrifugación, la separación de una gran pastilla de contaminantes insolubles de la ELP soluble en el sobrenadante (Figura 1B). ELP se purifica aún más por el ciclismo transición inversa (ITC), que explota el comportamiento LCST para separar la ELP de contaminantes solubles e insolubles (Figura 2) 28. La transición de fase de la ELP se desencadena por la adición de calor y / o sal. Resultados de centrifugación en la formación de un sedimento en la parte inferior del tubo que consta de un ELPnd algunos contaminantes insolubles (Figura 1C). Este paso-denomina un spin-descartes calientes contaminantes solubles en el sobrenadante mientras que el pellet ELP se retiene y se resuspendió en tampón frío. El resolubilizado ELP se centrifugó de nuevo a 4 ° C. Este paso-denomina un resfriado spin-descartes la pelotilla de contaminantes insolubles, mientras se mantiene el sobrenadante que contiene ELP soluble. Repitiendo el ciclo de alternancia de giros calientes y frías aumenta la pureza de la ELP, pero a costa de disminuir ligeramente el rendimiento, como se pierde ELP residual durante cada ronda CCI en tubos de centrífuga y en puntas de pipeta. Purificación con éxito de los PEL y el péptido o proteína fusiones ELP se confirmó por SDS-PAGE. Pequeñas alícuotas tomadas durante todo el proceso de purificación demuestran la purificación progresiva de ELP de la E. lisado coli. ELP se sobreexpresa en el crudo E. coli lisado y contaminantes disminuyen ingenioh sucesivas rondas de ITC (Figura 3). ELP purificada aparece como una única banda cerca de la PM teórico predicho. El ELP T t se caracteriza por turbidimetría a temperatura programada. El perfil de la turbidez de un homopolímero ELP exhibe una fuerte aumento en la DO a 350 nm (aproximadamente 2,0 unidades por encima de la línea de base para una concentración de ELP de 25 M) (Figura 4). Enfriamiento exploraciones de turbidez confirman la naturaleza reversible de la transición PEL como la DO regresa a la línea base cuando la temperatura se reduce por debajo de la T T (Figura 4B). Copolímeros de dos bloques ELP exhiben un perfil de turbidez más complejo, en comparación con el homopolímero ELPs. El OD aumenta típicamente primero en 0,1-0,5 unidades por encima de la línea de base, después de lo cual los OD aumenta bruscamente a 2,0 unidades por encima de la línea de base (Figura 5A). DLS mediciones proporcionan información sobre el cambio en C H con respecto a la temperatura, CO<html> rroborating la información obtenida a partir del perfil de turbidez (Figura 5B). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1. Purificación preliminar ELP. Después de 24 horas de expresión, E. coli células se recogieron por centrifugación y se resuspendieron en PBS.) Las células A se lisaron por sonicación, que se acompaña de un cambio sutil en el color de tal manera que el lisado se oscurece después de la sonicación. B) Después de la adición de PEI para condensar contaminantes de ADN, el lisado se centrifugó y un gran residuo de restos insolubles se separa de ELP soluble en el sobrenadante. C) La transición ELP se induce con la adición de calor y / o formas de sal y un pellet de centrifugación ELP translúcido.ank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig2highres.jpg" width="600" /> Figura 2. Ciclismo transición inversa. ELP se purifica por medio de su comportamiento LCST de los contaminantes solubles e insolubles. A partir de la ELP-rica lisado (1) la transición ELP se induce con la adición de calor y / o sal y el ELP se separa por centrifugación (spin caliente) (2). El sedimento de ELP se retiene (3a), mientras que el sobrenadante que contiene contaminantes solubles se descarta (3b). El ELP se resuspende en tampón frío (4) y se centrifugó de nuevo a 4 º C (centrifugado en frío) (5). El sedimento que contiene los contaminantes insolubles se descarta (6a), mientras que se conserva el sobrenadante que contiene ELP soluble en (6b). Los ciclos de alternancia giros fríos y calientes se repiten hasta que se alcanza la pureza deseada, tal como se determina conSDS-PAGE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3. Análisis de SDS-PAGE de productos de purificación de ELP. Purificación con éxito de un ELP se confirmó por SDS-PAGE. Overexpressed ELP es evidente en el crudo E. lisado coli después de la sonicación (2). Después de la adición de PEI y de la centrifugación el ELP solubles se retiene en gran medida en el sobrenadante (3), aunque algunos ELP se pierde en el sedimento descartado de contaminantes insolubles (4). El sobrenadante después de la primera vuelta caliente contiene niveles significativos de contaminantes solubles (5). El sobrenadante después de la primera vuelta fría indica una buena separación de ELP de contaminantes insolubles (6). Ciclos adicionales de calor (7) y cviejo gira (8) eliminar los contaminantes solubles e insolubles residuales, respectivamente, hasta que esté caliente (9) y centrifugado en frío (10) sobrenadantes finales no presentan bandas de contaminantes extraños, lo que confirma la pureza satisfactoria del producto ELP. Este homopolímero ELP, con una secuencia de SKGPG-(VGVPG) 80-Y, tiene un peso molecular esperado de 33,37 kDa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4. Caracterización de ELP homopolímero por turbidimetría a temperatura programada. El ELP T t se determina mediante el control de la DO a 350 nm, mientras que el aumento de la temperatura a una velocidad de 1 º C / min. Un) homopolímeros ELP exhiben una sola aumento agudo en OD que defInes su T T a una concentración dada. B) La reversibilidad de la transición ELP se verifica mediante el control de la DO a 350 nm de una solución de 25 μ M, mientras que la disminución de la temperatura, donde la reversibilidad se confirma por el retorno de la DO a la línea de base. Este homopolímero ELP tiene la secuencia SKGPG-(VGVPG) 80-Y. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="La figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig5highres.jpg" width="600" /> Figura 5. Caracterización de ELP copolímero de dos bloques por turbidimetría a temperatura programada y la dispersión de luz dinámica. ELPs que sufren de auto-ensamblaje nano-escala, como ELP copolímeros de dos bloques que la auto-ensamblan para formar micelas esféricas, presentan perfiles de turbidez más complejos. <stronG&gt; A) Moderado aumento en la OD indica la transición de unimers a las micelas, antes de un rápido aumento en la OD que indica la agregación completa de la ELP en agregados escala de micras. B) DLS mediciones confirman el comportamiento inferido a partir del perfil de turbidez para un solución a 25 M, proporcionando información sobre el cambio en C H con respecto a la temperatura. Aquí el Unimer ELP tiene un R H ~ 8 nm y la micela tiene un R H ~ 25 nm. Este copolímero dibloque ELP tiene la secuencia GCGWPG-(VGVPG) 60 - (AGVPGGGVPG) 30-PGGS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig5highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Polipéptidos elastina-como son biopolímeros de estímulo sensible con aplicaciones que van desde la purificación de proteínas recombinantes para la administración de fármacos. Este protocolo describe la purificación y caracterización de polipéptidos tipo elastina y sus péptidos o proteínas fusiones a partir de Escherichia coli utilizando su comportamiento de transición de fase la temperatura de solución crítica inferior como una alternativa simple a cromatografía.

La purificación no cromatográfico de polipéptidos recombinantes Elastina-como y sus fusiones con Péptidos y Proteínas de<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

non-chromatographic-purification-recombinant-elastin-like

Research

JoVE Journal

Biology

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

21.5K vistas.  Duke University.  Polipéptidos elastina-como son biopolímeros de estímulo sensible con aplicaciones que van desde la purificación de proteínas recombinantes para la administración de fármacos. Este protocolo describe la purificación y caracterización de polipéptidos tipo elastina y sus péptidos o proteínas fusiones a partir de Escherichia coli utilizando su comportamiento de transición de fase la temperatura de solución crítica inferior como una alternativa simple ...

Video: Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Tinción de las proteínas en geles con Coomassie G-250, sin ácido disolvente orgánico y el acético

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Investigación

Biología

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

Cribado de alto rendimiento de la actividad endoglucanasa por hongos en Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identificación de los complejos de proteínas en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; La purificación mediante afinidad del péptido secuencial en combinación con espectrometría de masas tándem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

De alto rendimiento de purificación de afinidad de proteínas marcadas con recombinantes

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has become the method of choice for introducing DNA into prokaryotes that are not naturally competent. Electroporation is a rapid, efficient, and streamlined transformation method that, in addition to purified DNA and competent bacteria, requires commercially available gene pulse controller and cuvettes. In contrast to the pulsing step, preparation of electrocompetent cells is time consuming and labor intensive involving repeated rounds of centrifugation and washes in decreasing volumes of sterile, cold water, or non-ionic buffers of large volumes of cultures grown to mid-logarithmic phase of growth. Time and effort can be saved by purchasing electrocompetent cells from commercial sources, but the selection is limited to commonly employed E. coli laboratory strains. We are hereby disseminating a rapid and efficient method for preparing electrocompetent E. coli, which has been in use by bacteriology laboratories for some time, can be adapted to V. cholerae and other prokaryotes. While we cannot ascertain whom to credit for developing the original technique, we are hereby making it available to the scientific community.

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation is a commonly employed method for introducing DNA into bacteria in a process known as transformation. Traditional protocols for the preparation of electrocompetent cells are time consuming and labor intensive. This article describes an alternate, rapid, and efficient method for the preparation of electrocompetent cells presently employed by some laboratories.

Protocolo rápido para la preparación de electrocompetentes<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Y<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

High Throughput Screening Expresión cuantitativa y Purificación Aplicada a Recombinante Disulfide ricos en proteínas del veneno Producido en<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Fluorescente verde a base de proteína Expresión Proyección de proteínas de membrana en<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

Las multifacéticas beneficios de la proteína co-expresión en<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein belonging to the prion family. A chromatographic method for the purification of (His)6-tagged recombinant Shadoo expressed as inclusion bodies is described. The inclusion bodies are solubilized in 8 M urea and bound to a Ni2+-charged column to perform ion affinity chromatography. Bound proteins are eluted by a gradient of imidazole. Fractions containing Shadoo protein are subjected to size exclusion chromatography to obtain a highly purified protein. In the final step purified Shadoo is desalted to remove salts, urea and imidazole. Recombinant Shadoo protein is an important reagent for biophysical and biochemical studies of protein conformation disorders occurring in prion diseases. Many reports demonstrated that prion neurodegenerative diseases originate from the deposition of stable, ordered amyloid fibrils. Sample protocols describing how to fibrillate Shadoo into amyloid fibrils at acidic and neutral/basic pHs are presented. The methods on how to produce and fibrillate Shadoo can facilitate research in laboratories working on prion diseases, since it allows for production of large amounts of protein in a rapid and low cost manner.

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of His6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

A two-step chromatographic method is described for the purification of recombinant Shadoo protein expressed as inclusion bodies in Escherichia coli, as well as a protocol to fibrillate purified Shadoo into amyloid structures.

Purificación y replegamiento de amiloide fibrillas de (Su)<sub&gt; 6</sub&gt;-etiquetados proteína recombinante Shadoo Expresado como cuerpos de inclusión en<em&gt; E. coli</em

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules derived from the parental cells. EVs function as intra- and inter-species communication vectors while also contributing to the interaction between bacteria and host organisms in the context of infection and colonization. Given the multitude of functions attributed to EVs in health and disease, there is a growing interest in isolating EVs for in vitro and in vivo studies. It was hypothesized that the separation of EVs based on physical properties, namely size, would facilitate the isolation of vesicles from diverse bacterial cultures. 
The isolation workflow consists of centrifugation, filtration, ultrafiltration, and size-exclusion chromatography (SEC) for the isolation of EVs from bacterial cultures. A pump-driven tangential flow filtration (TFF) step was incorporated to enhance scalability, enabling the isolation of material from liters of starting cell culture. Escherichia coli was used as a model system expressing EV-associated nanoluciferase and non-EV-associated mCherry as reporter proteins. The nanoluciferase was targeted to the EVs by fusing its N-terminus with cytolysin A. Early chromatography fractions containing 20-100 nm EVs with associated cytolysin A - nanoLuc were distinct from the later fractions containing the free proteins. The presence of EV-associated nanoluciferase was confirmed by immunogold labeling and transmission electron microscopy. This EV isolation workflow is applicable to other human gut-associated gram-negative and gram-positive bacterial species. In conclusion, combining centrifugation, filtration, ultrafiltration/TFF, and SEC enables scalable isolation of EVs from diverse bacterial species. Employing a standardized isolation workflow will facilitate comparative studies of microbial EVs across species.

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Bacteria secrete nanometer-sized extracellular vesicles (EVs) carrying bioactive biological molecules. EV research focuses on understanding their biogenesis, role in microbe-microbe and host-microbe interactions and disease, as well as their potential therapeutic applications. A workflow for scalable isolation of EVs from various bacteria is presented to facilitate standardization of EV research.

Aislamiento escalable y purificación de vesículas extracelulares de Escherichia coli y otras bacterias

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...