Nos gustaría dar las gracias a Gilad Silberberg, Michele Pignatelli, Thomas K. Berger, Luca Gambazzi, y Sonia García de valiosos consejos sobre mejoras para la automatización de proceso de patch-clamp. Agradecemos Rajnish Ranjan para el asesoramiento y la asistencia en la implementación de software de valor. Este trabajo fue financiado en parte por el proyecto Sinapsis de la UE y en parte por el Programa Científico Fronteras Humanos.

1. Equipo de preparación <ol><li> Manipuladores de control desde un ordenador <ol><li> Conecte cada caja del controlador micromanipulador a una computadora a través de puertos serie (RS-232). </li><li> Implementar los comandos para el posicionamiento, consultar y ajustar la configuración para ser enviados a través del puerto serie. Problemas de velocidad y compatibilidad de hardware Dadas C / C + + se recomienda como el lenguaje de programación. </li><li> Estandarizar el sistema de referencia de los manipuladores de modo que el cero es la posición más próxima posible con respecto a los motores y movimiento positivo se dirige lejos de los motores. </li><li> Coloque el microscopio a su posición central 2 mm por encima de la muestra de plano focal (coordenadas [0, 0, 2000]). </li><li> Almacenar, para cada manipulador, las coordenadas locales que permiten que la punta de una pipeta que se observó en el centro del campo de visión del microscopio. Este es el punto de referencia inicial para cada electrodo. </li></ol></li><li> Visuaposiciones de los electrodos Lize. Es muy útil ser capaz de seguir la posición de cada electrodo durante un experimento. Una representación gráfica es la forma más intuitiva de lograr esto. Para ello los sistemas de referencia de cada electrodo y la del microscopio deben coincidir. Una manera sencilla de lograr esto es: <ol><li> Llevar la punta de un electrodo al centro del campo de vista. </li><li> Almacenar la posición en cada eje del manipulador y cada eje del microscopio. </li><li> Ejecutar con el eje x del manipulador de un movimiento relativamente grande (1 mm). </li><li> Ubique la punta una vez más se mueve sólo el microscopio. </li><li> Calcular la diferencia en la posición de microscopio, ya que se midió última. Estas son las proyecciones del movimiento del eje del electrodo en los ejes de microscopio. </li><li> Repita los pasos 2.3 a 2.5 para el Y y Z ejes del manipulador electrodo. Esto permite una matriz de proyecciones en el microscopio ejes por determinar (&lt;strong&gt; Figura 2) también llamado matriz coseno: <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/50630/50630eq1.jpg" /></li><li> Invertir esta matriz para que sea posible calcular los movimientos en tres dimensiones, requeridos por el manipulador de electrodos para llegar a una posición determinada en el microscopio sistema de coordenadas: <img alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/50630/50630eq2.jpg" /></li><li> Usando el punto de referencia inicial y la matriz de coseno determinar la posición de cada electrodo en el microscopio de coordenadas. </li><li> Mostrar gráficamente, basado en el microscopio de coordenadas, la posición de cada electrodo a intervalos regulares. Hemos elegido utilizar / C + + bibliotecas dibujo C (GDI +) para dibujar posiciones de los electrodos cada 40 ms. </li><li> Repetir los pasos 1.2.1 - 1.2.7 cada vez que se cambian los ángulos de manipulador o si se necesitan cambios de posición de varios milímetros, por ejemplo, cuando el tipo de electrodo se cambia. </li></ol></li><li> Habilitar el almacenamiento de la positions de características relevantes en el tejido, tales como células o puntos de referencia anatómicos, en microscopio coordenadas. </li><li> Adquirir vídeo y superponer información pertinente. <ol><li> Mecánicamente alinear el eje x de movimiento del microscopio con el eje horizontal de la cámara del microscopio. </li><li> Instalar en el equipo un framegrabber con vídeo en directo y la capacidad de recubrimiento y un kit de desarrollo de software (SDK). </li><li> Implementar la operación de visualización de vídeo en directo con el SDK. </li><li> Convertir el microscopio sistema de coordenadas en el sistema de referencia de la cámara por la traducción de escala apropiado. </li><li> Dibuje las características relevantes en coordenadas de cámara y superposición sobre el vídeo en directo la imagen resultante a intervalos regulares de unos 40 ms (Figura 3). </li></ol></li><li> Amplificadores de control. <ol><li> Utilice el software de amplificador de controlar los ajustes del amplificador de la interfaz. </li></ol></li><li> Control osciloscopios. <ol><li> Conecte los osciloscopios para PC mediante puertos serie. </li><li> Determinar la escala osciloscopio, acoplamiento y resolución temporal para los diferentes pasos del procedimiento de patch-clamp en de fijación de voltaje (por ejemplo, electrodo en el baño, la formación del sello, configuración de célula completa) y la corriente-abrazadera. </li><li> Envíe los comandos de ajuste de osciloscopio apropiadas cuando los comandos de amplificación se emiten desde la interfaz. </li></ol></li><li> Presión pipeta de control. <ol><li> Montar un sistema de control de presión de acuerdo con la Figura 4. <ol><li> Utilice una fuente de alimentación de 12 V / 5 V para suministrar cada componente electrónico adecuada. </li><li> Conectar la salida de una bomba de membrana en el búfer de presión positiva (un recipiente de 100 ml). </li><li> Conectar la entrada de una bomba de membrana en el búfer de presión negativa (un recipiente de 100 ml). </li><li> Conecte el tubo de soporte de pipeta a un sensor de presión en el pressure sistema de control y una válvula neumática que se conecta al compartimento principal de presión. </li><li> Conectar cada uno de los tampones de presión a una válvula conectada al compartimento principal de presión. </li><li> Conecte una válvula entre el compartimiento de presión principal y la atmósfera. </li><li> Conecte un sensor de presión en el compartimento principal de presión. </li><li> Conecte un sensor de presión para cada búfer. </li><li> Conecte el sistema de control de presión para una tarjeta de adquisición de datos. </li><li> Conecte cada sensor de presión a una entrada analógica. </li><li> Conectar cada válvula a una salida digital. </li></ol></li><li> Retire desplazamiento de todos los sensores mediante la apertura de todas las válvulas excepto las que conectan a las bombas de membrana y restando la presión medida de la presión atmosférica. </li><li> Implementar el control de presión <ol><li> Definir en la interfaz de un control para activar o desactivar el control de presión positiva para cada pipeta. </li><li> Definir una presión positiva mínima para la pipetas de aproximadamente 70 mbar. </li><li> Periódicamente (cada 0,5 segundos) detectar cuando la presión en pipetas bajo control de presión activa desciende por debajo del umbral establecido. </li><li> Al cruce del umbral de abrir el amortiguador de presión positiva al compartimento de presión principal y este compartimiento hacia la pipeta en cuestión durante breves períodos de tiempo (20 ms) hasta que la presión en las pipetas es superior al umbral. Cierre todas las válvulas. </li><li> De-activar aún más el control de presión como se inicia la aproximación final hacia una célula de interés. </li></ol></li><li> Aplique presión negativa para la formación del sello <ol><li> Cierre todas las válvulas y abra la válvula de amortiguador de presión negativa hacia el compartimiento de presión principal y este compartimiento hacia la pipeta en cuestión durante el tiempo que el experimentador requiere manteniendo un botón pulsado. </li></ol></li></ol></li><li> Centralizar los comandos en un dispositivo de interfaz humana. <ol><li> Conecte un wirele comercialmente disponibless gamepad para PC. </li><li> Implementar la lectura del estado de joystick. Por ejemplo, usar las bibliotecas de DirectX para C / C + + para realizar lecturas cada 5 ms. </li><li> Comparar la situación actual con el estado anterior de detectar que se han pulsado, soltado o se mantiene pulsado los botones ya que paso la última vez. </li><li> Asignar funciones a cada botón en el mando de juegos. Un ejemplo de este mapeo se muestra en la Figura 5. </li></ol></li></ol> 2. Procedimiento Patch-clamp <ol><li> Preparar las rodajas de cerebro de la región de interés. </li><li> Coloque un trozo de cerebro de interés, con la región de interés en el centro del rango de desplazamiento del microscopio. </li><li> La selección de la célula <ol><li> Identificar las células de interés por la navegación con el microscopio. Guarde la posición de las células sobre la base del microscopio sistema de coordenadas con un derecho del ratón haga clic en la pantalla de vídeo en directo en la parte superior de la célula de interés. </li&gt; <li> La interfaz gráfica mostrará las celdas seleccionadas, así como las micropipetas para una visión general y global de software añadirá un marcador en la posición de la celda que se superponen sobre las imágenes. Además de una imagen de la célula es capturada para futuras referencias en el archivo &#39;Celda #. Jpg&#39;. </li></ol></li><li> Atribución de las células para pipetas <ol><li> Después de seleccionar las células de interés, asignar qué pipeta registrará cada celda. La interfaz gráfica proporciona controles de asignación que se debe establecer. Visualice una vista previa de la configuración final seleccionando la casilla &#39;Mostrar Posiciones Finales&#39;. </li><li> Seleccione cada pipeta para el que se desea la vista previa de la posición final o marque la casilla &#39;Seleccionar todo&#39;. Desactivar la visualización de la posición actual para una mejor visualización, si es necesario. </li></ol></li><li> Preparar las pipetas <ol><li> Llene las pipetas (6-8 MΩ suelen ser mejores si se usan muchas pipetas) with solución intracelular y cargarlos en sus titulares. Coloca los Headstages en sus fijaciones, pero no se deslicen hacia adelante para evitar tocar el baño con la punta de la pipeta. </li><li> Habilitar el control de la presión positiva y seleccionar todas las pipetas para asegurar que las puntas se mantendrán limpios. Deslice suavemente cada headstage en su lugar. </li></ol></li><li> Localización de las puntas de pipeta <ol><li> Coloque el microscopio a una posición central con el foco 3 mm por encima de la rebanada pulsando el botón R2 mientras sostiene el botón &#39;A&#39;. Use la posición correspondiente para cada manipulador como se almacena en el experimento anterior pulsando el botón L2 mientras mantiene pulsado el botón A. Nota: En este punto no debe haber ya sea una sombra distintiva de una pipeta a la vista o un pequeño movimiento a lo largo del eje de la pipeta debe ser suficiente para observar que en la mayoría de los casos. La compensación por las ligeras diferencias en la forma de la pipeta tiene que ser realizada manualmente. </li><li> Llevar la punta de la pipeta en el foco. Coloque la punta en el punto central de color rojo de la pantalla de vídeo sin mover el microscopio (debe estar aún en la posición [0, 0, 2000]). </li><li> Informar al software que la pipeta está en el centro de la pantalla pulsando el botón Z mientras mantiene el botón C. Después de cada punta de la pipeta se encuentra, enviar ese pipeta hacia atrás de modo que la siguiente se puede localizar pulsando el botón L1 mientras mantiene pulsado el botón A. </li></ol></li><li> Acercarse a las células <ol><li> Una vez que todas las puntas de las pipetas se han localizado con precisión y cada pipeta se atribuye a una celda, coloque automáticamente las pipetas cercanas a sus respectivas celdas. Simplemente haga clic derecho en el centro del grupo de celdas y seleccionar la opción &#39;Cluster&#39; en el menú emergente. En la ventana de opciones de clúster que aparecerá, seleccione todas las pipetas que desea posicionarse en este momento y haga clic en &#39;Ir con todas las pipetas controladas ». Repita esta operación para cada grupo de células de interés. </li><li> Performa la aproximación final manualmente. La posición de las pipetas en relación con las células se puede especificar de manera diferente, pero por lo general es simplemente 200 m de distancia de la celda en el eje de la pipeta y 200 micras por encima de ella en la dirección vertical, que es suficiente para mantener la punta de la pipeta fuera del tejido . Espere a que termine la colocación de las pipetas y mover el microscopio hacia una pipeta presionando el botón R1 mientras mantiene el botón C. </li><li> Vuelva a calibrar cada posición de la pipeta, centrándose el microscopio en la punta en cualquier lugar de la pantalla de vídeo y pulsando el botón B mientras mantiene el botón C. Una cuadrícula debería aparecer brevemente indicando la posición identificada de la pipeta. Si la posición no es correcta, coloque la punta en el punto central de la pantalla de vídeo y pulse el botón Z mientras mantiene el botón C. </li></ol></li><li> Establecer la configuración de la celda-adjunto <ol><li> Confirme que la célula de interés para la pipeta actual es correctamarcada. De lo contrario, mover el microscopio para que coincida con la célula de interés con el punto rojo central. Marque la celda presionando el botón Y mientras mantiene el botón pulsador C. Pulse L2 mientras mantiene el botón C para colocar la pipeta de 200 m de distancia de su celda asignada, el microscopio se moverá automáticamente a la posición correspondiente. </li><li> Ajuste la posición de la pipeta para que coincida con el punto rojo. Ajustar el offset pulsando el botón R1 mientras mantiene el botón X. pipeta </li><li> Active el impulso de prueba pulsando el botón L1 mientras mantiene el botón X. Poco a poco acercarse a la pipeta para su célula atribuido. </li><li> Al observar la formación de un hoyuelo en la superficie de la membrana de la célula de aplicar un breve pulso de la presión negativa pulsando el botón Y mientras mantiene el botón Z para permitir que la presión aplicada para llegar a la célula. Un potencial de mantenimiento de alrededor de-65mV debería establecido en este punto, pulse el botón L2 mientras mantiene el botón X. </li></ol></li><li> Configuración de célula completa<ol><li> Una vez que un sello Giga-se forma para cada celda, iniciar la ruptura de las membranas mediante la aplicación de presión negativa. </li></ol></li><li> Realizar grabaciones <ol><li> Utilice el sistema de estimulación / adquisición para realizar sus grabaciones. Aplicar impulsos o trenes de impulsos en una célula individual a la vez y observar las respuestas en las células restantes a mapa de conectividad entre las células registradas. </li></ol></li><li> Retroceder pipetas <ol><li> Una vez que las grabaciones se terminaron, retroceder pipetas lentamente del tejido con un clic derecho sobre el botón de radio tabla. Seleccione &#39;retroceden-&gt; Pipetas 500 m&#39; de tener las pipetas se alejan a una corta distancia a lo largo de sus ejes. Observar la deriva en el potencial de las células (la limpieza de las puntas aplicando un poco de presión positiva puede ayudar). </li><li> Para retroceder pipetas totalmente hacia atrás, ajuste la velocidad de posicionamiento en &#39;Fast&#39; y repetir la misma operación pero seleccione la opción &quot;Todos&quot;. Retire el utilizadopipetas deslizando suavemente los Headstages y desenroscar las pipetas de los poseedores. Es útil para evitar las torsiones de los titulares en sus cuencas ya que esto podría interferir en gran medida con la posición de la punta de la pipeta. </li></ol></li></ol>

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	<li>Perin, R., Berger, T. K., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synaptic+organizing+principle+for+cortical+neuronal+groups.">A synaptic organizing principle for cortical neuronal groups.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5419-5424 (2011).</li><li>Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+Bursts+Self-Inhibit+and+Correlate+the+Pyramidal+Network.">Brief Bursts Self-Inhibit and Correlate the Pyramidal Network.</a> PLoS Biol. 8, e1000473 (2010).</li><li>Fino, E., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense+inhibitory+connectivity+in+neocortex.">Dense inhibitory connectivity in neocortex.</a> Neuron. 69, 1188-1203 (2011).</li><li>Packer, A. M., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense,+Unspecific+Connectivity+of+Neocortical+Parvalbumin-Positive+Interneurons:+A+Canonical+Microcircuit+for+Inhibition.">Dense, Unspecific Connectivity of Neocortical Parvalbumin-Positive Interneurons: A Canonical Microcircuit for Inhibition.</a> J. Neurosci. 31, 13260-13271 (2011).</li><li>Berger, T. K., Perin, R., Silberberg, G., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency-dependent+disynaptic+inhibition+in+the+pyramidal+network:+a+ubiquitous+pathway+in+the+developing+rat+neocortex.">Frequency-dependent disynaptic inhibition in the pyramidal network: a ubiquitous pathway in the developing rat neocortex.</a> J. Physiol. 587, 5411-5425 (2009).</li><li>Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+whole-cell+patch-clamp+electrophysiology+of+neurons+in+vivo.">Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo.</a> Nat. Methods. 9, 585-587 (2012).</li><li>Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephaptic+coupling+of+cortical+neurons.">Ephaptic coupling of cortical neurons.</a> Nat. Neurosci. 14, 217-223 (2011).</li><li>Prakash, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+optogenetic+toolbox+for+fast+inhibition,+excitation+and+bistable+modulation.">Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation.</a> Nat. Methods. 9, 1171-1179 (2012).</li><li>Papagiakoumou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanless+two-photon+excitation+of+channelrhodopsin-2.">Scanless two-photon excitation of channelrhodopsin-2.</a> Nat Methods. 7, 848-854 (2010).</li><li>Ko, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+specificity+of+local+synaptic+connections+in+neocortical+networks.">Functional specificity of local synaptic connections in neocortical networks.</a> Nature. 473, 87-91 (2011).</li><li>Wickersham, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+Restriction+of+Transsynaptic+Tracing+from+Single,+Genetically+Targeted+Neurons.">Monosynaptic Restriction of Transsynaptic Tracing from Single, Genetically Targeted Neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li><li>Liang, C. W., Mohammadi, M., Santos, M. D., Tang, C. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+Photostimulation+with+Digital+Micromirror+Devices+to+Investigate+Dendritic+Integration+Across+Branch+Points.">Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points.</a> J. Vis. Exp. (49), e2003 (2011).</li><li>Nikolenko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLM+Microscopy:+Scanless+Two-Photon+Imaging+and+Photostimulation+with+Spatial+Light+Modulators.">SLM Microscopy: Scanless Two-Photon Imaging and Photostimulation with Spatial Light Modulators.</a> Front Neural Circuits. 2, (2008).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Una pregunta inmediata suele surgir en relación con la tasa de éxito del procedimiento que hemos descrito. Para altas tasas de éxito la preparación es esencial. Las pipetas deben tener aberturas de punta que sean adecuados a los seres células grabadas. Filtrado de la solución intracelular para evitar pipetas obstruidos también es importante. Pipetas extremadamente limpias, de barril son otro requisito. Una distribución binomial es el modelo más simple que se puede utilizar para entender cómo estos problemas af...

La capacidad para grabar y estimular múltiples sitios con precisión micrómetro es extremadamente útil para lograr experimentalmente una mejor comprensión de los sistemas neuronales. Muchas técnicas se han desarrollado para este fin pero ninguno permitir la resolución submillivolt logra mediante la técnica de patch-clamp, esencial para el estudio de la actividad subumbral y potenciales postsinápticos individuales. Aquí se describe el desarrollo de un sistema de patch-clamp asistida por ordenador de doce electrodo destinado a registrar y la estimulación de un gran número de células individuales con la suficiente precisión para el estudio de la conectividad neuronal simultáneamente. Mientras que muchas otras aplicaciones pueden ser concebidos para un sistema de este tipo, se presta particularmente bien para el estudio de la conectividad sináptica dado que el número de conexiones posibles dentro de un grupo de neuronas crece proporcionalmente al cuadrado del número de neuronas en cuestión. Por lo tanto, mientras que un sistema con tres electrodos permite probar laocurrencia de hasta seis conexiones y más a menudo grabación de una sola, la grabación de doce neuronas permite probar la ocurrencia de hasta 132 conexiones y observando con frecuencia más de una docena (Figura 1). La observación de decenas de conexiones simultáneamente hace posible el análisis de la organización de las redes de pequeñas y deducir propiedades estadísticas de la estructura de red que no se puede probar lo contrario 1. Por otra parte, la estimulación precisa de numerosas células también permite la cuantificación del reclutamiento de las células postsinápticas 2.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td>40X Immersion Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulators</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>SM-5</td>
			<td>Serial protocol used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifiers</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td>MultiClamp 700B</td>
			<td>SDK used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Till Photonics</td>
			<td>VS 55</td>
			<td>BNC analog output</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Framegrabber</td>
			<td>Data Translation</td>
			<td>DT3120</td>
			<td>SDK used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscopes</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>TDS 2014</td>
			<td>Serial communication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition</td>
			<td>InstruTECH</td>
			<td>ITC 1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>PCI-6221</td>
			<td>Library used (.dll)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure valve</td>
			<td>SMC</td>
			<td>SMC070C-6BG-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure sensor</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>24PCDFA6G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane pump</td>
			<td>Schego</td>
			<td>Optimal</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a computer-assisted multi-electrode patch-clamp system

La técnica de patch-clamp es hoy en día el método más bien establecido para el registro de la actividad eléctrica de las neuronas individuales o sus compartimentos subcelulares. Sin embargo, el logro de grabaciones estables, incluso a partir de células individuales, sigue siendo un procedimiento que consume tiempo de considerable complejidad. Automatización de los muchos pasos en conjunto con la pantalla de información eficiente puede ayudar enormemente experimentadores en la realización de un mayor número de grabaciones con una mayor fiabilidad y en menos tiempo. Con el fin de lograr grabaciones a gran escala concluimos el enfoque más eficiente no es para automatizar completamente el proceso, pero para simplificar los pasos experimentales y reducir las posibilidades de error humano al tiempo que incorpora de manera eficiente la experiencia del experimentador y la retroalimentación visual. Con estos objetivos en mente, hemos desarrollado un sistema de ayuda de computadora que centraliza todos los controles necesarios para una multi-electrodo experimento de patch-clamp en una sola interfaz, un comercgamepad inalámbrico ially disponibles, al tiempo que muestra de experimentos relacionados con las señales de información y orientación en la pantalla de ordenador. Aquí se describen los diferentes componentes del sistema que nos permitió reducir el tiempo requerido para alcanzar la configuración de grabación y aumentar considerablemente las posibilidades de grabar con éxito un gran número de neuronas al mismo tiempo.

Siguiendo los métodos descritos anteriormente hemos tenido éxito en la realización de la grabación de células enteras de hasta doce neuronas simultáneamente, casi duplicando el mayor número de neuronas simultáneamente parche-sujetada hasta ahora. Ejemplos de redes de conexiones sinápticas directas entre neuronas piramidales registrada en la capa V de la corteza somatosensorial de las ratas se muestran en la Figura 6. La determinación de los perfiles de probabilidad...

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A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

De múltiples electrodos patch-clamp grabaciones constituyen una tarea compleja. Aquí se muestra cómo, mediante la automatización de muchas de las medidas experimentales, es posible acelerar el proceso que conduce a una mejora cualitativa en el rendimiento y el número de grabaciones.

A multi-electrodo Sistema Patch-clamp asistida por ordenador

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

a-computer-assisted-multi-electrode-patch-clamp-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K vistas.  Ecole Polytechnique Federale de Lausanne.  De múltiples electrodos patch-clamp grabaciones constituyen una tarea compleja. Aquí se muestra cómo, mediante la automatización de muchas de las medidas experimentales, es posible acelerar el proceso que conduce a una mejora cualitativa en el rendimiento y el número de grabaciones. 

Video: A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Grabaciones de patch clamp de neuronas de ratón de retina en una rebanada preparación adaptada a la oscuridad

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Investigación

Neurociencias

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard of electrophysiology applied to disease models and pharmaceutical screens alike 1. The method traditionally involves gently contacting a cell with a glass pipette filled by a physiological solution in order to isolate a patch of the membrane under its apex 2. An electrode inserted in the pipette captures ion-channel activity within the membrane patch or, when ruptured, for the whole cell. In the last decade, patch-clamp chips have been proposed as an alternative 3, 4: a suspended film separates the physiological medium from the culture medium, and an aperture microfabricated in the film replaces the apex of the pipette. Patch-clamp chips have been integrated in automated systems and commercialized for high-throughput screening 5. To increase throughput, they include the fluidic delivery of cells from suspension, their positioning on the aperture by suction, and automated routines to detect cell-to-probe seals and enter into whole cell mode. We have reported on the fabrication of a silicon patch-clamp chip with optimized impedance and orifice shape that permits the high-quality recording of action potentials in cultured snail neurons 6; recently, we have also reported progress towards interrogating mammalian neurons 7. Our patch-clamp chips are fabricated at the Canadian Photonics Fabrication Centre 8, a commercial foundry, and are available in large series. We are eager to engage in collaborations with electrophysiologists to validate the use of the NRCC technology in different models. The chips are used according to the general scheme represented in Figure 1: the silicon chip is at the bottom of a Plexiglas culture vial and the back of the aperture is connected to a subterranean channel fitted with tubes at either end of the package. Cells are cultured in the vial and the cell on top of the probe is monitored by a measuring electrode inserted in the channel.The two outside fluidic ports facilitate solution exchange with minimal disturbance to the cell; this is an advantage compared to glass pipettes for intracellular perfusion.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig1.jpg" />
Figure 1. Principle of measurement using the NRCC patch-clamp chip
We detail here the protocols to sterilize and prime the chips, load them with medium, plate them with cells, and finally use them for electrophysiological recordings.

We show how planar patch-clamp chips fabricated at the National Research Council of Canada are sterilized, primed, loaded with medium, plated with cells, and used for electrophysiological recordings.

El cultivo y la electrofisiología de las células en NRCC de patch-clamp chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

Grabaciones de patch clamp en Inner células del oído pelo Aislado de pez cebra

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

Mitochondria are involved in many important cellular functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most important mitochondrial functions are related to the efficient production of ATP, the energy currency of the cell, by oxidative phosphorylation, and the mediation of signals for programmed cell death3.
The enzyme primarily responsible for the production of ATP is the F1FO-ATP synthase, also called ATP synthase4-5. In recent years, the role of mitochondria in apoptotic and necrotic cell death has received considerable attention. In apoptotic cell death, BCL-2 family proteins such as Bax enter the mitochondrial outer membrane, oligomerize and permeabilize the outer membrane, releasing pro-apoptotic factors into the cytosol6. In classic necrotic cell death, such as that produced by ischemia or excitotoxicity in neurons, a large, poorly regulated increase in matrix calcium contributes to the opening of an inner membrane pore, the mitochondrial permeability transition pore or mPTP. This depolarizes the inner membrane and causes osmotic shifts, contributing to outer membrane rupture, release of pro-apoptotic factors, and metabolic dysfunction. Many proteins including Bcl-xL7 interact with F1FO ATP synthase, modulating its function. Bcl-xL interacts directly with the beta subunit of F1FO ATP synthase, and this interaction decreases a leak conductance within the F1FOATPasecomplex, increasing the net transport of H+ by F1FO during F1FO ATPase activity8 and thereby increasing mitochondrial efficiency. To study the activity and modulation of the ATP synthase, we isolated from rodent brain submitochondrial vesicles (SMVs) containing F1FO ATPase. The SMVs retain the structural and functional integrity of the F1FO ATPase as shown in Alavian et al. Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of SMVs from rat brain and we delineate the patch clamp technique to analyze channel activity (ion leak conductance) of the SMVs.

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

A method to isolate submitochondrial vesicles enriched in F1FO ATP synthase complexes from rat brain is described. These vesicles allow the study of the activity of F1FO ATPase complex and its modulation using the technique of patch clamp recording.

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub&gt; ATPasa preparación de vesículas y técnica para realizar Patch clamp grabaciones de membranas de la vesícula submitocondriales

Mitochondria are involved in many important cellular  functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

It has been demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to elicit electrical responses in neural tissue, independent of any further modification of the target tissue. Infrared neural stimulation has been reported in a variety of peripheral and sensory neural tissue in vivo, with particular interest shown in stimulation of neurons in the auditory nerve. However, while INS has been shown to work in these settings, the mechanism (or mechanisms) by which infrared light causes neural excitation is currently not well understood. The protocol presented here describes a whole cell patch clamp method designed to facilitate the investigation of infrared neural stimulation in cultured primary auditory neurons. By thoroughly characterizing the response of these cells to infrared laser illumination in vitro under controlled conditions, it may be possible to gain an improved understanding of the fundamental physical and biochemical processes underlying infrared neural stimulation.

Infrared nerve stimulation has been proposed as an alternative to electrical stimulation in a range of nerve types, including those associated with the auditory system. This protocol describes a patch clamp method for studying the mechanism of infrared nerve stimulation in a culture of primary auditory neurons.

Whole Cell Patch Clamp para investigar los mecanismos de la Estimulación Neural infrarrojos

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

El aislamiento de las neuronas sensoriales de<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Se Patch clamp grabaciones de Corrientes glutamatérgicos

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

Patch Clamp Las grabaciones de las células embrionarias de pez cebra Mauthner

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Plenario de células patch-clamp grabaciones de Morphologically- e identificados-neuroquímicamente interneuronas del hipocampo

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Las grabaciones de células enteras Patch-clamp en rodajas de cerebro

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.