Nos gustaría dar las gracias a Gilad Silberberg, Michele Pignatelli, Thomas K. Berger, Luca Gambazzi, y Sonia García de valiosos consejos sobre mejoras para la automatización de proceso de patch-clamp. Agradecemos Rajnish Ranjan para el asesoramiento y la asistencia en la implementación de software de valor. Este trabajo fue financiado en parte por el proyecto Sinapsis de la UE y en parte por el Programa Científico Fronteras Humanos.

1. Equipo de preparación <ol><li> Manipuladores de control desde un ordenador <ol><li> Conecte cada caja del controlador micromanipulador a una computadora a través de puertos serie (RS-232). </li><li> Implementar los comandos para el posicionamiento, consultar y ajustar la configuración para ser enviados a través del puerto serie. Problemas de velocidad y compatibilidad de hardware Dadas C / C + + se recomienda como el lenguaje de programación. </li><li> Estandarizar el sistema de referencia de los manipuladores de modo que el cero es la posición más próxima posible con respecto a los motores y movimiento positivo se dirige lejos de los motores. </li><li> Coloque el microscopio a su posición central 2 mm por encima de la muestra de plano focal (coordenadas [0, 0, 2000]). </li><li> Almacenar, para cada manipulador, las coordenadas locales que permiten que la punta de una pipeta que se observó en el centro del campo de visión del microscopio. Este es el punto de referencia inicial para cada electrodo. </li></ol></li><li> Visuaposiciones de los electrodos Lize. Es muy útil ser capaz de seguir la posición de cada electrodo durante un experimento. Una representación gráfica es la forma más intuitiva de lograr esto. Para ello los sistemas de referencia de cada electrodo y la del microscopio deben coincidir. Una manera sencilla de lograr esto es: <ol><li> Llevar la punta de un electrodo al centro del campo de vista. </li><li> Almacenar la posición en cada eje del manipulador y cada eje del microscopio. </li><li> Ejecutar con el eje x del manipulador de un movimiento relativamente grande (1 mm). </li><li> Ubique la punta una vez más se mueve sólo el microscopio. </li><li> Calcular la diferencia en la posición de microscopio, ya que se midió última. Estas son las proyecciones del movimiento del eje del electrodo en los ejes de microscopio. </li><li> Repita los pasos 2.3 a 2.5 para el Y y Z ejes del manipulador electrodo. Esto permite una matriz de proyecciones en el microscopio ejes por determinar (&lt;strong&gt; Figura 2) también llamado matriz coseno: <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/50630/50630eq1.jpg" /></li><li> Invertir esta matriz para que sea posible calcular los movimientos en tres dimensiones, requeridos por el manipulador de electrodos para llegar a una posición determinada en el microscopio sistema de coordenadas: <img alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/50630/50630eq2.jpg" /></li><li> Usando el punto de referencia inicial y la matriz de coseno determinar la posición de cada electrodo en el microscopio de coordenadas. </li><li> Mostrar gráficamente, basado en el microscopio de coordenadas, la posición de cada electrodo a intervalos regulares. Hemos elegido utilizar / C + + bibliotecas dibujo C (GDI +) para dibujar posiciones de los electrodos cada 40 ms. </li><li> Repetir los pasos 1.2.1 - 1.2.7 cada vez que se cambian los ángulos de manipulador o si se necesitan cambios de posición de varios milímetros, por ejemplo, cuando el tipo de electrodo se cambia. </li></ol></li><li> Habilitar el almacenamiento de la positions de características relevantes en el tejido, tales como células o puntos de referencia anatómicos, en microscopio coordenadas. </li><li> Adquirir vídeo y superponer información pertinente. <ol><li> Mecánicamente alinear el eje x de movimiento del microscopio con el eje horizontal de la cámara del microscopio. </li><li> Instalar en el equipo un framegrabber con vídeo en directo y la capacidad de recubrimiento y un kit de desarrollo de software (SDK). </li><li> Implementar la operación de visualización de vídeo en directo con el SDK. </li><li> Convertir el microscopio sistema de coordenadas en el sistema de referencia de la cámara por la traducción de escala apropiado. </li><li> Dibuje las características relevantes en coordenadas de cámara y superposición sobre el vídeo en directo la imagen resultante a intervalos regulares de unos 40 ms (Figura 3). </li></ol></li><li> Amplificadores de control. <ol><li> Utilice el software de amplificador de controlar los ajustes del amplificador de la interfaz. </li></ol></li><li> Control osciloscopios. <ol><li> Conecte los osciloscopios para PC mediante puertos serie. </li><li> Determinar la escala osciloscopio, acoplamiento y resolución temporal para los diferentes pasos del procedimiento de patch-clamp en de fijación de voltaje (por ejemplo, electrodo en el baño, la formación del sello, configuración de célula completa) y la corriente-abrazadera. </li><li> Envíe los comandos de ajuste de osciloscopio apropiadas cuando los comandos de amplificación se emiten desde la interfaz. </li></ol></li><li> Presión pipeta de control. <ol><li> Montar un sistema de control de presión de acuerdo con la Figura 4. <ol><li> Utilice una fuente de alimentación de 12 V / 5 V para suministrar cada componente electrónico adecuada. </li><li> Conectar la salida de una bomba de membrana en el búfer de presión positiva (un recipiente de 100 ml). </li><li> Conectar la entrada de una bomba de membrana en el búfer de presión negativa (un recipiente de 100 ml). </li><li> Conecte el tubo de soporte de pipeta a un sensor de presión en el pressure sistema de control y una válvula neumática que se conecta al compartimento principal de presión. </li><li> Conectar cada uno de los tampones de presión a una válvula conectada al compartimento principal de presión. </li><li> Conecte una válvula entre el compartimiento de presión principal y la atmósfera. </li><li> Conecte un sensor de presión en el compartimento principal de presión. </li><li> Conecte un sensor de presión para cada búfer. </li><li> Conecte el sistema de control de presión para una tarjeta de adquisición de datos. </li><li> Conecte cada sensor de presión a una entrada analógica. </li><li> Conectar cada válvula a una salida digital. </li></ol></li><li> Retire desplazamiento de todos los sensores mediante la apertura de todas las válvulas excepto las que conectan a las bombas de membrana y restando la presión medida de la presión atmosférica. </li><li> Implementar el control de presión <ol><li> Definir en la interfaz de un control para activar o desactivar el control de presión positiva para cada pipeta. </li><li> Definir una presión positiva mínima para la pipetas de aproximadamente 70 mbar. </li><li> Periódicamente (cada 0,5 segundos) detectar cuando la presión en pipetas bajo control de presión activa desciende por debajo del umbral establecido. </li><li> Al cruce del umbral de abrir el amortiguador de presión positiva al compartimento de presión principal y este compartimiento hacia la pipeta en cuestión durante breves períodos de tiempo (20 ms) hasta que la presión en las pipetas es superior al umbral. Cierre todas las válvulas. </li><li> De-activar aún más el control de presión como se inicia la aproximación final hacia una célula de interés. </li></ol></li><li> Aplique presión negativa para la formación del sello <ol><li> Cierre todas las válvulas y abra la válvula de amortiguador de presión negativa hacia el compartimiento de presión principal y este compartimiento hacia la pipeta en cuestión durante el tiempo que el experimentador requiere manteniendo un botón pulsado. </li></ol></li></ol></li><li> Centralizar los comandos en un dispositivo de interfaz humana. <ol><li> Conecte un wirele comercialmente disponibless gamepad para PC. </li><li> Implementar la lectura del estado de joystick. Por ejemplo, usar las bibliotecas de DirectX para C / C + + para realizar lecturas cada 5 ms. </li><li> Comparar la situación actual con el estado anterior de detectar que se han pulsado, soltado o se mantiene pulsado los botones ya que paso la última vez. </li><li> Asignar funciones a cada botón en el mando de juegos. Un ejemplo de este mapeo se muestra en la Figura 5. </li></ol></li></ol> 2. Procedimiento Patch-clamp <ol><li> Preparar las rodajas de cerebro de la región de interés. </li><li> Coloque un trozo de cerebro de interés, con la región de interés en el centro del rango de desplazamiento del microscopio. </li><li> La selección de la célula <ol><li> Identificar las células de interés por la navegación con el microscopio. Guarde la posición de las células sobre la base del microscopio sistema de coordenadas con un derecho del ratón haga clic en la pantalla de vídeo en directo en la parte superior de la célula de interés. </li&gt; <li> La interfaz gráfica mostrará las celdas seleccionadas, así como las micropipetas para una visión general y global de software añadirá un marcador en la posición de la celda que se superponen sobre las imágenes. Además de una imagen de la célula es capturada para futuras referencias en el archivo &#39;Celda #. Jpg&#39;. </li></ol></li><li> Atribución de las células para pipetas <ol><li> Después de seleccionar las células de interés, asignar qué pipeta registrará cada celda. La interfaz gráfica proporciona controles de asignación que se debe establecer. Visualice una vista previa de la configuración final seleccionando la casilla &#39;Mostrar Posiciones Finales&#39;. </li><li> Seleccione cada pipeta para el que se desea la vista previa de la posición final o marque la casilla &#39;Seleccionar todo&#39;. Desactivar la visualización de la posición actual para una mejor visualización, si es necesario. </li></ol></li><li> Preparar las pipetas <ol><li> Llene las pipetas (6-8 MΩ suelen ser mejores si se usan muchas pipetas) with solución intracelular y cargarlos en sus titulares. Coloca los Headstages en sus fijaciones, pero no se deslicen hacia adelante para evitar tocar el baño con la punta de la pipeta. </li><li> Habilitar el control de la presión positiva y seleccionar todas las pipetas para asegurar que las puntas se mantendrán limpios. Deslice suavemente cada headstage en su lugar. </li></ol></li><li> Localización de las puntas de pipeta <ol><li> Coloque el microscopio a una posición central con el foco 3 mm por encima de la rebanada pulsando el botón R2 mientras sostiene el botón &#39;A&#39;. Use la posición correspondiente para cada manipulador como se almacena en el experimento anterior pulsando el botón L2 mientras mantiene pulsado el botón A. Nota: En este punto no debe haber ya sea una sombra distintiva de una pipeta a la vista o un pequeño movimiento a lo largo del eje de la pipeta debe ser suficiente para observar que en la mayoría de los casos. La compensación por las ligeras diferencias en la forma de la pipeta tiene que ser realizada manualmente. </li><li> Llevar la punta de la pipeta en el foco. Coloque la punta en el punto central de color rojo de la pantalla de vídeo sin mover el microscopio (debe estar aún en la posición [0, 0, 2000]). </li><li> Informar al software que la pipeta está en el centro de la pantalla pulsando el botón Z mientras mantiene el botón C. Después de cada punta de la pipeta se encuentra, enviar ese pipeta hacia atrás de modo que la siguiente se puede localizar pulsando el botón L1 mientras mantiene pulsado el botón A. </li></ol></li><li> Acercarse a las células <ol><li> Una vez que todas las puntas de las pipetas se han localizado con precisión y cada pipeta se atribuye a una celda, coloque automáticamente las pipetas cercanas a sus respectivas celdas. Simplemente haga clic derecho en el centro del grupo de celdas y seleccionar la opción &#39;Cluster&#39; en el menú emergente. En la ventana de opciones de clúster que aparecerá, seleccione todas las pipetas que desea posicionarse en este momento y haga clic en &#39;Ir con todas las pipetas controladas ». Repita esta operación para cada grupo de células de interés. </li><li> Performa la aproximación final manualmente. La posición de las pipetas en relación con las células se puede especificar de manera diferente, pero por lo general es simplemente 200 m de distancia de la celda en el eje de la pipeta y 200 micras por encima de ella en la dirección vertical, que es suficiente para mantener la punta de la pipeta fuera del tejido . Espere a que termine la colocación de las pipetas y mover el microscopio hacia una pipeta presionando el botón R1 mientras mantiene el botón C. </li><li> Vuelva a calibrar cada posición de la pipeta, centrándose el microscopio en la punta en cualquier lugar de la pantalla de vídeo y pulsando el botón B mientras mantiene el botón C. Una cuadrícula debería aparecer brevemente indicando la posición identificada de la pipeta. Si la posición no es correcta, coloque la punta en el punto central de la pantalla de vídeo y pulse el botón Z mientras mantiene el botón C. </li></ol></li><li> Establecer la configuración de la celda-adjunto <ol><li> Confirme que la célula de interés para la pipeta actual es correctamarcada. De lo contrario, mover el microscopio para que coincida con la célula de interés con el punto rojo central. Marque la celda presionando el botón Y mientras mantiene el botón pulsador C. Pulse L2 mientras mantiene el botón C para colocar la pipeta de 200 m de distancia de su celda asignada, el microscopio se moverá automáticamente a la posición correspondiente. </li><li> Ajuste la posición de la pipeta para que coincida con el punto rojo. Ajustar el offset pulsando el botón R1 mientras mantiene el botón X. pipeta </li><li> Active el impulso de prueba pulsando el botón L1 mientras mantiene el botón X. Poco a poco acercarse a la pipeta para su célula atribuido. </li><li> Al observar la formación de un hoyuelo en la superficie de la membrana de la célula de aplicar un breve pulso de la presión negativa pulsando el botón Y mientras mantiene el botón Z para permitir que la presión aplicada para llegar a la célula. Un potencial de mantenimiento de alrededor de-65mV debería establecido en este punto, pulse el botón L2 mientras mantiene el botón X. </li></ol></li><li> Configuración de célula completa<ol><li> Una vez que un sello Giga-se forma para cada celda, iniciar la ruptura de las membranas mediante la aplicación de presión negativa. </li></ol></li><li> Realizar grabaciones <ol><li> Utilice el sistema de estimulación / adquisición para realizar sus grabaciones. Aplicar impulsos o trenes de impulsos en una célula individual a la vez y observar las respuestas en las células restantes a mapa de conectividad entre las células registradas. </li></ol></li><li> Retroceder pipetas <ol><li> Una vez que las grabaciones se terminaron, retroceder pipetas lentamente del tejido con un clic derecho sobre el botón de radio tabla. Seleccione &#39;retroceden-&gt; Pipetas 500 m&#39; de tener las pipetas se alejan a una corta distancia a lo largo de sus ejes. Observar la deriva en el potencial de las células (la limpieza de las puntas aplicando un poco de presión positiva puede ayudar). </li><li> Para retroceder pipetas totalmente hacia atrás, ajuste la velocidad de posicionamiento en &#39;Fast&#39; y repetir la misma operación pero seleccione la opción &quot;Todos&quot;. Retire el utilizadopipetas deslizando suavemente los Headstages y desenroscar las pipetas de los poseedores. Es útil para evitar las torsiones de los titulares en sus cuencas ya que esto podría interferir en gran medida con la posición de la punta de la pipeta. </li></ol></li></ol>

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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+Restriction+of+Transsynaptic+Tracing+from+Single,+Genetically+Targeted+Neurons.">Monosynaptic Restriction of Transsynaptic Tracing from Single, Genetically Targeted Neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li><li>Liang, C. W., Mohammadi, M., Santos, M. D., Tang, C. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+Photostimulation+with+Digital+Micromirror+Devices+to+Investigate+Dendritic+Integration+Across+Branch+Points.">Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points.</a> J. Vis. Exp. (49), e2003 (2011).</li><li>Nikolenko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLM+Microscopy:+Scanless+Two-Photon+Imaging+and+Photostimulation+with+Spatial+Light+Modulators.">SLM Microscopy: Scanless Two-Photon Imaging and Photostimulation with Spatial Light Modulators.</a> Front Neural Circuits. 2, (2008).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Una pregunta inmediata suele surgir en relación con la tasa de éxito del procedimiento que hemos descrito. Para altas tasas de éxito la preparación es esencial. Las pipetas deben tener aberturas de punta que sean adecuados a los seres células grabadas. Filtrado de la solución intracelular para evitar pipetas obstruidos también es importante. Pipetas extremadamente limpias, de barril son otro requisito. Una distribución binomial es el modelo más simple que se puede utilizar para entender cómo estos problemas af...

La capacidad para grabar y estimular múltiples sitios con precisión micrómetro es extremadamente útil para lograr experimentalmente una mejor comprensión de los sistemas neuronales. Muchas técnicas se han desarrollado para este fin pero ninguno permitir la resolución submillivolt logra mediante la técnica de patch-clamp, esencial para el estudio de la actividad subumbral y potenciales postsinápticos individuales. Aquí se describe el desarrollo de un sistema de patch-clamp asistida por ordenador de doce electrodo destinado a registrar y la estimulación de un gran número de células individuales con la suficiente precisión para el estudio de la conectividad neuronal simultáneamente. Mientras que muchas otras aplicaciones pueden ser concebidos para un sistema de este tipo, se presta particularmente bien para el estudio de la conectividad sináptica dado que el número de conexiones posibles dentro de un grupo de neuronas crece proporcionalmente al cuadrado del número de neuronas en cuestión. Por lo tanto, mientras que un sistema con tres electrodos permite probar laocurrencia de hasta seis conexiones y más a menudo grabación de una sola, la grabación de doce neuronas permite probar la ocurrencia de hasta 132 conexiones y observando con frecuencia más de una docena (Figura 1). La observación de decenas de conexiones simultáneamente hace posible el análisis de la organización de las redes de pequeñas y deducir propiedades estadísticas de la estructura de red que no se puede probar lo contrario 1. Por otra parte, la estimulación precisa de numerosas células también permite la cuantificación del reclutamiento de las células postsinápticas 2.

<table><tbody><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>40X Immersion Objective</td></tr><tr><td>Manipulators</td><td>Luigs Neumann</td><td>SM-5</td><td>Serial protocol used</td></tr><tr><td>Amplifiers</td><td>Axon Instruments</td><td>MultiClamp 700B</td><td>SDK used</td></tr><tr><td>Camera</td><td>Till Photonics</td><td>VS 55</td><td>BNC analog output</td></tr><tr><td>Framegrabber</td><td>Data Translation</td><td>DT3120</td><td>SDK used</td></tr><tr><td>Oscilloscopes</td><td>Tektronix</td><td>TDS 2014</td><td>Serial communication</td></tr><tr><td>Data acquisition</td><td>InstruTECH</td><td>ITC 1600</td><td></td></tr><tr><td>Data acquisition</td><td>National Instruments</td><td>PCI-6221</td><td>Library used (.dll)</td></tr><tr><td>Pressure valve</td><td>SMC</td><td>SMC070C-6BG-32</td><td></td></tr><tr><td>Pressure sensor</td><td>Honeywell</td><td>24PCDFA6G</td><td></td></tr><tr><td>Membrane pump</td><td>Schego</td><td>Optimal</td><td></td></tr></tbody></table>

a computer-assisted multi-electrode patch-clamp system

La técnica de patch-clamp es hoy en día el método más bien establecido para el registro de la actividad eléctrica de las neuronas individuales o sus compartimentos subcelulares. Sin embargo, el logro de grabaciones estables, incluso a partir de células individuales, sigue siendo un procedimiento que consume tiempo de considerable complejidad. Automatización de los muchos pasos en conjunto con la pantalla de información eficiente puede ayudar enormemente experimentadores en la realización de un mayor número de grabaciones con una mayor fiabilidad y en menos tiempo. Con el fin de lograr grabaciones a gran escala concluimos el enfoque más eficiente no es para automatizar completamente el proceso, pero para simplificar los pasos experimentales y reducir las posibilidades de error humano al tiempo que incorpora de manera eficiente la experiencia del experimentador y la retroalimentación visual. Con estos objetivos en mente, hemos desarrollado un sistema de ayuda de computadora que centraliza todos los controles necesarios para una multi-electrodo experimento de patch-clamp en una sola interfaz, un comercgamepad inalámbrico ially disponibles, al tiempo que muestra de experimentos relacionados con las señales de información y orientación en la pantalla de ordenador. Aquí se describen los diferentes componentes del sistema que nos permitió reducir el tiempo requerido para alcanzar la configuración de grabación y aumentar considerablemente las posibilidades de grabar con éxito un gran número de neuronas al mismo tiempo.

Siguiendo los métodos descritos anteriormente hemos tenido éxito en la realización de la grabación de células enteras de hasta doce neuronas simultáneamente, casi duplicando el mayor número de neuronas simultáneamente parche-sujetada hasta ahora. Ejemplos de redes de conexiones sinápticas directas entre neuronas piramidales registrada en la capa V de la corteza somatosensorial de las ratas se muestran en la Figura 6. La determinación de los perfiles de probabilidad...

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A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

De múltiples electrodos patch-clamp grabaciones constituyen una tarea compleja. Aquí se muestra cómo, mediante la automatización de muchas de las medidas experimentales, es posible acelerar el proceso que conduce a una mejora cualitativa en el rendimiento y el número de grabaciones.

A multi-electrodo Sistema Patch-clamp asistida por ordenador

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

a-computer-assisted-multi-electrode-patch-clamp-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K vistas.  Ecole Polytechnique Federale de Lausanne.  De múltiples electrodos patch-clamp grabaciones constituyen una tarea compleja. Aquí se muestra cómo, mediante la automatización de muchas de las medidas experimentales, es posible acelerar el proceso que conduce a una mejora cualitativa en el rendimiento y el número de grabaciones. 

Video: A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which disrupt normal brain function. Despite treatment with currently available antiepileptic drugs targeting neuronal functions, one third of patients with epilepsy are pharmacoresistant. In this condition, surgical resection of the brain area generating seizures remains the only alternative treatment. Studying human epileptic tissues has contributed to understand new epileptogenic mechanisms during the last 10 years. Indeed, these tissues generate spontaneous interictal epileptic discharges as well as pharmacologically-induced ictal events which can be recorded with classical electrophysiology techniques. Remarkably, multi-electrode arrays (MEAs), which are microfabricated devices embedding an array of spatially arranged microelectrodes, provide the unique opportunity to simultaneously stimulate and record field potentials, as well as action potentials of multiple neurons from different areas of the tissue. Thus MEAs recordings offer an excellent approach to study the spatio-temporal patterns of spontaneous interictal and evoked seizure-like events and the mechanisms underlying seizure onset and propagation. Here we describe how to prepare human cortical slices from surgically resected tissue and to record with MEAs interictal and ictal-like events ex vivo.

We here describe how to perform multi-electrode array recordings of human epileptic cortical tissue. Epileptic tissue resection, slice preparation and multi-electrode array recordings of interictal and ictal events are demonstrated in detail.

Multi-electrodos Grabaciones variedad de epilepsia humana postoperatoria cortical del tejido

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Investigación

Medicina

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch clamp y técnicas de perfusión para el estudio de los canales iónicos expresados ​​en Xenopus Ovocitos

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Biología

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a challenging and low-throughput technique due to its complexity and high reliance on user operation and control. This manuscript demonstrates an image-guided automatic patch clamp system for in vitro whole-cell patch clamp experiments in acute brain slices. Our system implements a computer vision-based algorithm to detect fluorescently labeled cells and to target them for fully automatic patching using a micromanipulator and internal pipette pressure control. The entire process is highly automated, with minimal requirements for human intervention. Real-time experimental information, including electrical resistance and internal pipette pressure, are documented electronically for future analysis and for optimization to different cell types. Although our system is described in the context of acute brain slice recordings, it can also be applied to the automated image-guided patch clamp of dissociated neurons, organotypic slice cultures, and other non-neuronal cell types.

This protocol describes how to conduct automatic image-guided patch-clamp experiments using a system recently developed for standard in vitro electrophysiology equipment.

Aplicación de la abrazadera de parche guiada por imágenes automatizada para el estudio de neuronas en cortes cerebrales

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

Neurociencias

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic tectum, is a popular model to study how neural circuits self-assemble. The ability to carry out whole cell patch clamp recordings from tectal neurons and to record RGC-evoked responses, either in vivo or using a whole brain preparation, has generated a large body of high-resolution data about the mechanisms underlying normal, and abnormal, circuit formation and function. Here we describe how to perform the in vivo preparation, the original whole brain preparation, and a more recently developed horizontal brain slice preparation for obtaining whole cell patch clamp recordings from tectal neurons. Each preparation has unique experimental advantages. The in vivo preparation enables the recording of the direct response of tectal neurons to visual stimuli projected onto the eye. The whole brain preparation allows for the RGC axons to be activated in a highly controlled manner, and the horizontal brain slice preparation allows recording from across all layers of the tectum.

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

In this paper, we discuss three brain preparations used for whole cell patch clamp recording to study the retinotectal circuit of Xenopus laevis tadpoles. Each preparation, with its own specific advantages, contributes to the experimental tractability of the Xenopus tadpole as a model to study neural circuit function.

Preparaciones y protocolos para todo celular parche abrazadera de neuronas Tectal de Xenopus laevis

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Use of In Vivo Single-fiber Recording and Intact Dorsal Root Ganglion with Attached Sciatic Nerve to Examine the Mechanism of Conduction Failure

Single-fiber recording has been a classical and effective electrophysiological technique over the last few decades because of its specific application for nerve fibers in the central and peripheral nervous systems. This method is particularly applicable to dorsal root ganglia (DRG), which are primary sensory neurons that exhibit a pseudo-unipolar structure of nervous processes. The patterns and features of the action potentials passed along axons are recordable in these neurons. The present study uses in vivo single-fiber recordings to observe the conduction failure of sciatic nerves in complete Freund&#8217;s adjuvant (CFA)-treated rats. As the underlying mechanism cannot be studied using in vivo single-fiber recordings, patch-clamp-recordings of DRG neurons are performed on preparations of intact DRG with the attached sciatic nerve. These recordings reveal a positive correlation between conduction failure and the rising slope of the after-hyperpolarization potential (AHP) of DRG neurons in CFA-treated animals. The protocol for in vivo single fiber-recordings allows the classification of nerve fibers via the measurement of conduction velocity and monitoring of abnormal conditions in nerve fibers in certain diseases. Intact DRG with attached peripheral nerve allows observation of the activity of DRG neurons in most physiological conditions. Conclusively, single-fiber recording combined with electrophysiological recording of intact DRGs is an effective method to examine the role of conduction failure during the analgesic process.

Single-fiber recording is an effective electrophysiological technique that is applicable to the central and peripheral nervous systems. Along with the preparation of intact DRG with the attached sciatic nerve, the mechanism of conduction failure is examined. Both protocols improve the understanding of the peripheral nervous system&#39;s relationship with pain.

Uso de la grabación de una sola fibra In Vivo y el ganglio de raíz dorsal intacto con nervio ciático adjunto para examinar el mecanismo de falla de conducción

Single-fiber recording has been a classical and effective electrophysiological technique over the last few decades because of its specific application for ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Un canal celular conectado a Patch-clamp grabación

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Patch Clamp Electrophysiology

Neuron cell membranes are populated with ion channels that control the movement of charge into and out of the cell, thereby regulating neuron firing. One extremely useful technique for investigating the biophysical properties of these channels is called patch clamp recording. In this method, neuroscientists place a polished glass micropipette against a cell and apply suction to form a high resistance seal. This process isolates a small &#8220;patch&#8221; of membrane that contains one or more ion channels. Using an electrode within the micropipette, researchers can &#8220;clamp&#8221; or control the electrical properties of the membrane, which is important for analysis of channel activity. The electrode also allows for changes in the voltage across the membrane, or the flow of ions through the membrane, to be recorded. This video begins with an overview of the principles behind patch clamp electrophysiology, an introduction to the necessary equipment, and descriptions of the various patch configurations, including whole cell, cell-attached, perforated, inside-out, and outside-out patches. Next, the key steps of a typical whole-cell patch clamp experiment are outlined, in which a current-voltage (IV) curve is generated. Finally, applications of patch clamp recording are provided to demonstrate how the biophysical properties of ion channels, cell excitability, and neuroactive compounds are evaluated in neurophysiology labs today.

Patch Clamp Electrophysiology: Principle &amp; Applications

Electrofisiología de patch clamp

Neuron cell membranes are populated with ion channels that control the movement of charge into and out of the cell, thereby regulating neuron firing. One ...

Educación

JoVE Science Education

Biología avanzada

Neurociencia

Establishing a Whole-Cell Configuration through the Patch Clamp Method

Source: Segev, A. et al., <a href="https://app.jove.com/v/54024">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video demonstrates the whole-cell patch clamp technique in a mouse brain slice. This technique establishes a stable connection between micropipette and neuron membrane, which is further disrupted to establish a whole-cell configuration to study the neuron&#39;s health and physiological responses.

Establecimiento de una configuración de celda completa a través del método de fijación de parches

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. Slice ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Electrophysiology Techniques

Amphotericin-B Mediated Perforated Patch-Clamp Analysis: An Electrophysiological Technique to Study Ionic Currents in Urinary Bladder Cells

Source: Malysz, J. et al. <a href="https://www.jove.com/video/59884" target="_blank">Preparation and Utilization of Freshly Isolated Human Detrusor Smooth Muscle Cells for Characterization of 9-Phenanthrol-Sensitive Cation Currents.</a> J. Vis. Exp. (2020)
This video demonstrates the characterization of cationic currents from transient receptor potential melastatin type 4 (TRPM4) ion channels in detrusor smooth muscle cells using amphotericin-B mediated perforated patch-clamp technique. The technique helps evaluate the biophysical and pharmacological properties of ion channels.

Análisis de patch-clamp perforado mediado por anfotericina-B: una técnica electrofisiológica para estudiar las corrientes iónicas en las células de la vejiga urinaria

Source: Malysz, J. et al. Preparation and Utilization of Freshly Isolated Human Detrusor Smooth Muscle Cells for Characterization of ...

Investigación sobre el cáncer

Urinary Tract Cancer

In vitro studies

Whole-Cell Patch Clamp Electrophysiology: A Method to Study Electrical Properties of Neurons

Source: Roy, B., et al. <a href="https://www.jove.com/v/50551/" target="_blank">Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells</a>. J. Vis. Exp. (2013).
This protocol describes a technique called whole-cell patch clamp electrophysiology, which is a method to study electrical properties of Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos.

Electrofisiología de pinza de parche de célula completa: un método para estudiar las propiedades eléctricas de las neuronas

Source: Roy, B., et al. Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells. J. Vis. Exp. (2013).
This protocol describes a technique called ...

A multi-electrodo Sistema Patch-clamp asistida por ordenador

Resumen

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Capítulos en este video

Multi-electrodos Grabaciones variedad de epilepsia humana postoperatoria cortical del tejido

Patch clamp y técnicas de perfusión para el estudio de los canales iónicos expresados en Xenopus Ovocitos

Aplicación de la abrazadera de parche guiada por imágenes automatizada para el estudio de neuronas en cortes cerebrales

Preparaciones y protocolos para todo celular parche abrazadera de neuronas Tectal de Xenopus laevis

Uso de la grabación de una sola fibra In Vivo y el ganglio de raíz dorsal intacto con nervio ciático adjunto para examinar el mecanismo de falla de conducción

Un canal celular conectado a Patch-clamp grabación

Electrofisiología de patch clamp

Establecimiento de una configuración de celda completa a través del método de fijación de parches

Análisis de patch-clamp perforado mediado por anfotericina-B: una técnica electrofisiológica para estudiar las corrientes iónicas en las células de la vejiga urinaria

Electrofisiología de pinza de parche de célula completa: un método para estudiar las propiedades eléctricas de las neuronas

A multi-electrodo Sistema Patch-clamp asistida por ordenador

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Multi-electrodos Grabaciones variedad de epilepsia humana postoperatoria cortical del tejido

Patch clamp y técnicas de perfusión para el estudio de los canales iónicos expresados ​​en Xenopus Ovocitos

Aplicación de la abrazadera de parche guiada por imágenes automatizada para el estudio de neuronas en cortes cerebrales

Preparaciones y protocolos para todo celular parche abrazadera de neuronas Tectal de Xenopus laevis

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Electrofisiología de patch clamp

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Patch clamp y técnicas de perfusión para el estudio de los canales iónicos expresados en Xenopus Ovocitos