Name: studying dna looping by single-molecule fret
Uploaded: 2014-06-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET at JoVE.com

Damos las gracias a James Waters, Gable Wadsworth y Bo Broadwater para la lectura crítica del manuscrito. También agradecemos a cuatro revisores anónimos por proporcionar comentarios útiles. Reconocemos el apoyo financiero del Instituto de Tecnología de Georgia, el premio a la Trayectoria Fondo Burroughs Wellcome en la interfaz de la Ciencia y la concesión de la red de investigación de estudiantes de la NSF Física de Sistemas Vivos.

1. Preparación de la muestra de ADN bicatenario <ol><li> Diseñar ADNs curvas a nivel mundial mediante la repetición de una secuencia de 10-mer. Por ejemplo, 5&#39;-GTGCCAGCAACAGATAGC - (TTTATCATCCTTTATCATCC X) 7 - TTTCATTCGAGCTCGTTGTTG-3 &#39;es un ADN curvada 186-pb donde X es una base adicional al azar y la secuencia que flanquea la secuencia de 10-mer repitiendo son secuencias adaptadoras. NOTA: En este ejemplo se seleccionaron dos 10-meros con preferencias opuestas a la formación de nucleosomas en base a un estudio a gran escala de ocupación nucleosoma por Kaplan et al 15.. Desde la repetición helicoidal de ADN de doble cadena es cerca de 10 pb, cualquier desviación neta del eje helicoidal de la 10-mer se acumulan para producir una forma como un arco circular (Figura 3A). Desde el período helicoidal está más cerca de 10,5 pb, una base extra se inserta después de cada dos repeticiones para mantener la estructura curvada como plana como sea posible. Estas secuencias más cortas de 200 pb se pueden pedir a companies que el servicio de síntesis de genes oferta. Es conveniente para flanquear estas secuencias con secuencias adaptadoras comunes para las etapas subsiguientes. El procedimiento se esquematiza en la Figura 3B. </li><li> Lleve a cabo PCR con cebador 1 (GTGCCAGCAACAGATAGC) y cebador 2 (/ 5Cy3/TAAATTCCTACAACAACGAGCTCGAATG). NOTA: Cebador 2 se etiqueta con el Cy3 donante de FRET en el extremo 5 &#39;. Una receta típica PCR y protocolo de ciclos se presentan en las tablas 1 y 2. </li><li> Lleve a cabo PCR con Primer 3 (/ 5BioTEG/GAAACATAG/iCy5/GAATTTACCGTGCCAGCAACAGATAGC) y Primer 4 (CAACAACGAGCTCGAATG). NOTA: Cebador 3 está etiquetado con el aceptor Cy5 FRET a través de la columna vertebral y la biotina-enlazador en el extremo 5 &#39;. Receta PCR y protocolo de ciclos son como anteriormente. </li><li> Purificar los productos de PCR utilizando un kit de limpieza de PCR. </li><li> Mezclar el producto marcado con Cy3 y el producto marcado con Cy5 en un tampón para el intercambio de cadenas (100 mM NaCl, 10 mM de Tris-HCl, pH 7,0, EDTA 1 mM) a concentraciones finales de 0,4 y# 181; M y 0,1 M, respectivamente. NOTA: El exceso de Cy3-ADN aumenta la concentración del dúplex que lleva tanto Cy3 y Cy5 como resultado de la línea de cambio. </li><li> Tipo de hebras por incubación a 98,5 ° C durante 2 min, enfriar gradualmente a 5 ° C con velocidad de rampa de 0,1 º C / seg, e incubando a 5 &#160; ° C durante 2 horas. </li></ol> 2. Electroforesis en gel para detectar ADN de doble cadena Curvatura <ol><li> Verter el gel de poliacrilamida 16,17 mezclando soluciones de acrilamida y bis-acrilamida en relación 29.2:0.8, 5% (w / v) en 1X Tris / borato / EDTA (TBE) tampón a pH 8,0. Nota: 10 ml de solución de gel contiene: 1,217 ml de 40% de acrilamida, 0,667 ml de 2% de bis-acrilamida, 1 ml de TBE 10X, 100 persulfato L de amonio (APS) 10%, 10 L de TEMED, y el resto es dH 2 O. Solidificación completa del gel tarda unos 30 min. </li><li> Cargar el gel de poliacrilamida con muestras de ADN y la escalera de ADN en tampón de carga 1X (5% de glicerol, 0,03% (w / v) de bromofenol BLue) y ejecutar el gel a 5-8 V / cm a 4 ° C durante 45 min o hasta que el frente del colorante se acerca el final del gel. </li><li> Tinción del gel usando tampón TBE 1X que contiene 0,5 g / ml de bromuro de etidio durante 30 min. Identificar las bandas de ADN bajo iluminación UV. Comparar posiciones de las bandas con el marcador de tamaño (100 pb escalera de ADN) para calcular los tamaños aparentes de las moléculas de ADN. NOTA: Curved ADN generalmente se mueven más lento que los ADN rectas. </li></ol> 3. De flujo Preparación de células <ol><li> Perforar 6-7 pares de agujeros a lo largo de dos bordes opuestos de una lámina de vidrio (3&#39;&#39; x 1&#39;&#39;) usando un taladro y brocas de diamante. Después de la perforación, frote la diapositiva de agua que fluye para quitar polvo de vidrio visible. NOTA: Los agujeros sirven como entradas de perfusión y puntos de venta. Durante la perforación, el enfriamiento de la diapositiva con agua es importante para prevenir el agrietamiento. </li><li> Colocar los portaobjetos en posición vertical en un frasco de vidrio y llenarlo con agua. Déjelos en remojo durante 15 min y transferirlos a otro frasco de vidrio dedicated para la limpieza acetona. Rellenar con acetona y déjelos en remojo durante 15 min. Enjuagar los portaobjetos con etanol utilizando una botella de spray y luego con agua. Colóquelos en un recipiente de polipropileno, llenarlo de 5 M de hidróxido de potasio y déjelos en remojo durante 15 min. Por último, sonicar las diapositivas de agua durante 15 min. Limpiar los cubreobjetos (n º 1, 24 x 40 mm) utilizando el mismo protocolo. NOTA: diapositivas y cubreobjetos limpios pueden almacenarse en dH 2 O para el uso a largo plazo. </li><li> Mezclar 1 mg de biotina-PEG-silano (MW 3400) con 80 mg de mPEG-silano (MW 2000) en 340 L de solución de bicarbonato de sodio 0,1 M. Mezclar bien y centrifugar la mezcla brevemente para eliminar las burbujas. NOTA: La funcionalización de la superficie con polietilenglicol (PEG) ayuda a reducir la unión no específica de ADN a la superficie. </li><li> Ponga 80 L de la solución de PEG en cada diapositiva y bajar suavemente un cubreobjetos sobre ella. Espere 45 min. Separe el cubreobjetos de la diapositiva con pinzas, enjuáguelos con abundante cantidad de dH 2 O y dejar que tseco dobladillo al aire libre. </li><li> Coloque tiras delgadas de cinta adhesiva de doble cara en toda la diapositiva para formar canales. Alinear un cubreobjetos sobre ella y presione firmemente el cubreobjetos contra la corredera para formar canales estancos a los líquidos. Utilice 5 minutos epoxi para sellar los bordes de los canales. </li></ol> 4. Preparación de la solución de Trolox <ol><li> Ponga ~ 30 mg Trolox y 10 ml de dH2O en un matraz y usar una barra de agitación imán para agitar la solución al aire libre durante 18 horas. </li><li> Filtrar la solución usando un filtro de 0,2 micras y ajustar el pH a 7 mediante la adición de ~ 6 l de 1 M Tris base (pH 11). Nota: Trolox es un reactivo anti-parpadeo que se utiliza comúnmente en una sola molécula estudia 18. La acción antifading de Trolox proviene de su derivado oxidado que está presente en la solución de Trolox parcialmente degradada 19. Disolviendo rápidamente Trolox en metanol o una solución de Tris pH alto se debe evitar debido a la oxidación ineficiente. </li></ol> 5. Individual-molImaging ecule <ol><li> Inyectar 15 l de solución de NeutrAvidin (0,5 mg / ml) en el canal y esperar durante 2 minutos antes de enjuagar con 100 l de tampón de T50 (10 mM de Tris-HCl, NaCl 50 mM, pH 7,0). </li><li> Inyectar 50 l de muestra de ADN (50-100 pM) en el canal. Esperar 5 minutos y enjuagar el ADN no unido de distancia con 100 L de tampón de T50. NOTA: moléculas de ADN se unirán específicamente a la superficie a través de la interacción biotina-NeutrAvidin. </li><li> Llenar el canal con el buffer de imágenes que contiene un sistema de eliminación de oxígeno 20 (100 mM de PCD, 5 mM de PCA, 1 mM de Trolox, y NaCl 500 mM). </li><li> Ajuste el EMCCD en modo de transferencia de fotogramas para transmitir 2 x 2 imágenes agrupadas (256 x 256) a la computadora a 25 fotogramas por segundo. </li><li> Poner el aceite de inmersión sobre el objetivo del microscopio, y fijar la celda de flujo en la platina del microscopio utilizando clips de muestra. De grano grueso, ajuste el enfoque mirando el patrón de reflexión láser en la pared. Ajuste con precisión el enfoque utilizando la visualización en vivo de fluorescencia imlas edades en el monitor. </li><li> Comience la adquisición de datos con el láser de 532 nm en. Compruebe la vista en vivo y ajuste el enfoque si es necesario. Deje de adquisición de datos cuando la mayoría de las moléculas han photobleached. NOTA: En esta instalación, se utiliza un programa de laboratorio-escrito C para controlar el microscopio y visualizar imágenes en directo en el monitor, ya que se guardan en el disco duro. </li></ol> 6. Procesamiento de imágenes y análisis de datos NOTA: Una serie de tiempo de 256 x 256 imágenes son procesadas por un código de MATLAB para generar una sola molécula de rastros de tiempo de Cy3 y Cy5 intensidades. Para emparejar píxeles entre el canal de donante y el canal aceptor de la imagen de vista dividida, 6-7 pares de Cy3 y Cy5 manchas, cada par de la misma molécula uniformemente dispersado a través del campo de vista, son recogidos manualmente, y una transformación afín se calcula utilizando las coordenadas de estos lugares como puntos de anclaje. <ol><li> El uso de un script de MATLAB, mirar a través de todos los tiempos de una sola molécula traza tsombrero muestran múltiples transiciones entre las señales de baja y alta traste. Identificar los estados en bucle y unlooped. NOTA: La señal de FRET se define como la intensidad de Cy5 (I a) dividido por la suma de Cy3 y Cy5 intensidades (I A + Id). Estado en bucle tiene un alto valor FRET mientras que el estado unlooped tiene valor bajo FRET. El histograma de las señales de FRET de una sola molécula se distribuye bimodal porque de bucle reversible y unlooping. </li><li> Encontrar el umbral que separa las dos distribuciones mediante la determinación de la intersección entre las dos curvas gaussianas armarios. </li><li> Calcular la eficiencia de FRET como <img fo:content-width="0.6in" src="/files/ftp_upload/51667/eq7.jpg" /> y asignar los estados en bucle con altos valores de FRET y los estados unlooped con valores bajos de FRET. </li><li> El uso de un script de MATLAB, analizar el número acumulado de moléculas (N (t)) que en bucle (oalcanzado el estado alto FRET) en diferentes lapsos de tiempo desde el inicio de la adquisición de datos. NOTA: Dado que una molécula de ADN de doble cadena puede iniciar en cualquier conformación del estado unlooped en el inicio de adquisición de datos, la tasa de aumento en la población en bucle refleja la tasa de bucle medios promediados sobre conformaciones iniciales. Extraer el bucle tasa de bucle K mediante el ajuste de N (t) con una función exponencial: <img fo:content-width="1.8in" src="/files/ftp_upload/51667/eq1.jpg" /> Si aumenta bifásica, que puede ser equipado con una función doble exponencial: <img fo:content-width="2.2in" src="/files/ftp_upload/51667/eq2.jpg" /> En este caso, el bucle k se obtiene a partir de: <img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51667/eq3.jpg" /> NOTA: En teoría, la probabilidad de supervivencia que un polímero no ha enrollado en el tiempo t no es un simple o doble función exponencial 12. Fitt Exponencialción se utiliza como un medio práctico para extraer el promedio de tiempo de bucle. </li></ol> 7. Determinación del factor J NOTA: El factor J representa cómo concentrada uno de los extremos de un ADN de doble cadena es alrededor del otro extremo. Se puede determinar por interpolación la concentración de un segmento extremo del ADN que produciría la misma velocidad de reacción con el otro segmento final como la tasa de bucle medido. Experimentalmente, un segmento extremo está inmovilizado sobre la superficie, y el otro segmento extremo se introduce a una cierta concentración c. Si la tasa de recocido medida entre los dos extremos es k recocido, entonces el factor de J 21 está dada por <img fo:content-width="0.6in" src="/files/ftp_upload/51667/eq4.jpg" /> . La constante de velocidad de recocido (k = k recocido recocido / C) es independiente de la concentración de la sonda. <ol><li> Caudal 20 l de 30-50 pM biotina-Cy5 oligo (Primer 3) iONT un canal recubierto de NeutrAvidin. Enjuague el canal con 100 l T50 para lavar oligos no consolidados. </li><li> Preparar el tampón de formación de imágenes tal como se describe en la parte 5 con la adición de Cy3 oligo (cebador 2) a una concentración final de 50 nM. Este flujo de buffer de imágenes en el canal. </li><li> Mientras se mantiene el láser 532 nm, gire brevemente el láser de 640 nm a identificar la ubicación de la superficie determinada Cy5 oligos. Apague el láser de 640 nm y empezar a monitorizar la señal de FRET. NOTA: Tras la hibridación de un oligo Cy3 a un Cy5 oligonucleótido unido a la superficie, Cy5 fluorescencia surgirá de FRET. </li><li> El uso de un script de MATLAB, analizar el número de moléculas que comienzan en el estado no ligado (baja intensidad de Cy5), pero más tarde se convierten en el estado (alta intensidad de Cy5) recocido como una función del tiempo a partir de los restos de intensidad Cy5. </li><li> Trace ese número de moléculas en función del tiempo de recocido. Ajuste esta curva con una sola función exponencial ( <img fo:content-width="1.8in" src="/files/ftp_upload/51667/eq5.jpg"/&gt;) Para obtener la tasa de recocido (k recocido). </li><li> Repita este experimento a diferentes concentraciones Cy3 oligo (60, 100, y 180 nm) para confirmar la linealidad entre la tasa de recocido y la concentración de reactivo. Extracto de la constante de velocidad de recocido de segundo orden (k recocido ) A partir de la pendiente. </li><li> Calcular el factor J de <img fo:content-width="0.6in" src="/files/ftp_upload/51667/eq6.jpg" /> , Donde bucle k es la tasa de bucle medido en las mismas condiciones tampón. </li></ol>

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	<li>Garcia, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+consequences+of+tightly+bent+DNA:+The+other+life+of+a+macromolecular+celebrity.">Biological consequences of tightly bent DNA: The other life of a macromolecular celebrity.</a> Biopolymers. 85, 115-130 (2007).</li><li>Wiggins, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+flexibility+of+DNA+on+short+length+scales+probed+by+atomic+force+microscopy.">High flexibility of DNA on short length scales probed by atomic force microscopy.</a> Nature Nanotechnology. 1, (2006).</li><li>Lionberger, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+kinking+at+distant+sites+in+mechanically+stressed+DNA.">Cooperative kinking at distant sites in mechanically stressed DNA.</a> Nucleic Acids Research. 41, 6785-6792 (2011).</li><li>Shore, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+flexibility+studied+by+covalent+closure+of+short+fragments+into+circles.">DNA flexibility studied by covalent closure of short fragments into circles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 4833-4837 (1981).</li><li>Geggier, S., Vologodskii, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+dependence+of+DNA+bending+rigidity.">Sequence dependence of DNA bending rigidity.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 107, 15421-15426 (1992).</li><li>Smith, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+mechanical+measurements+of+the+elasticity+of+single+DNA+molecules+by+using+magnetic+beads.">Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads.</a> Science. 258, 1122-1126 (1992).</li><li>Peters, J. P., Maher, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+curvature+and+flexibility+in+vitro+and+in+vivo.">DNA curvature and flexibility in vitro and in vivo.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 43, 23-63 (2010).</li><li>Cloutier, T. E., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+sharp+bending+of+double-stranded+DNA.">Spontaneous sharp bending of double-stranded DNA.</a> Molecular Cell. 14, 355-362 (2004).</li><li>Du, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclization+of+short+DNA+fragments+and+bending+fluctuations+of+the+double+helix.">Cyclization of short DNA fragments and bending fluctuations of the double helix.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 5397-5402 (2005).</li><li>Yuan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T4+DNA+ligase+is+more+than+an+effective+trap+of+cyclized+dsDNA.">T4 DNA ligase is more than an effective trap of cyclized dsDNA.</a> Nucl. Acids Res. 35, 5294-5302 (2007).</li><li>Manzo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+nonspecific+binding+of+lambda+repressor+on+DNA+looping+dynamics.">The effect of nonspecific binding of lambda repressor on DNA looping dynamics.</a> Biophysical Journal. 103, 1753-1761 (2012).</li><li>Le, T. T., Kim, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+shape-dependent+looping+probability+of+DNA.">Measuring shape-dependent looping probability of DNA.</a> Biophys. J. 104, 2068-2076 (2013).</li><li>Vafabakhsh, R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extreme+bendability+of+DNA+less+than+100+base+pairs+long+revealed+by+single-molecule+cyclization.">Extreme bendability of DNA less than 100 base pairs long revealed by single-molecule cyclization.</a> Science. 337, 1097-1101 (2012).</li><li>Friedman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viewing+dynamic+assembly+of+molecular+complexes+by+multi-wavelength+single-molecule+fluorescence.">Viewing dynamic assembly of molecular complexes by multi-wavelength single-molecule fluorescence.</a> Biophysical Journal. 91, 1023-1031 (2006).</li><li>Kaplan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-encoded+nucleosome+organization+of+a+eukaryotic+genome.">The DNA-encoded nucleosome organization of a eukaryotic genome.</a> Nature. 458, 362-366 (2009).</li><li>Koo, H. S., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+of+DNA+curvature+and+a+unified+description+of+sequence-directed+bending.">Calibration of DNA curvature and a unified description of sequence-directed bending.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 85, 1763-1767 (1988).</li><li>Prosseda, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+temperature-induced+narrow+DNA+curvature+range+sustains+the+maximum+activity+of+a+bacterial+promoter+in+vitro.">A temperature-induced narrow DNA curvature range sustains the maximum activity of a bacterial promoter in vitro.</a> Biochemistry. 49, 2778-2785 (2010).</li><li>Rasnik, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonblinking+and+long-lasting+single-molecule+fluorescence+imaging.">Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3, 891-893 (2006).</li><li>Cordes, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+mechanism+of+Trolox+as+antiblinking+and+antibleaching+reagent.">On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent.</a> J. Am. Chem. Soc. 131, 5018-5019 (2009).</li><li>Aitken, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oxygen+scavenging+system+for+improvement+of+dye+stability+in+single-molecule+fluorescence+experiments.">An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments.</a> Biophys J. 94, 1826-1835 (2008).</li><li>Taylor, W. H., Hagerman, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+method+of+phage+T4+DNA+ligase-catalyzed+ring-closure+to+the+study+of+DNA+structure:+II.+NaCl-dependence+of+DNA+flexibility+and+helical+repeat.">Application of the method of phage T4 DNA ligase-catalyzed ring-closure to the study of DNA structure: II. NaCl-dependence of DNA flexibility and helical repeat.</a> Journal of Molecular Biology. 212, 363-376 (1990).</li><li>Bolshoy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curved+DNA+without+A-A:+experimental+estimation+of+all+16+DNA+wedge+angles.">Curved DNA without A-A: experimental estimation of all 16 DNA wedge angles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 2312-2316 (1991).</li><li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+DNA+fragments+in+yeast+by+one-step+assembly+of+overlapping+oligonucleotides.">Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides.</a> Nucl. Acids Res. 37, 6984-6990 (2009).</li><li>Vologodskii, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bending+of+short+DNA+helices.">Bending of short DNA helices.</a> Artif DNA PNA XNA. 4, (2013).</li><li>Hoover, D. M., Lubkowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNAWorks:+an+automated+method+for+designing+oligonucleotides+for+PCR-based+gene+synthesis.">DNAWorks: an automated method for designing oligonucleotides for PCR-based gene synthesis.</a> Nucl. Acids Res. 30, (2002).</li><li>Waters, J. T., Kim, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibrium+Statistics+of+a+Surface-Pinned+Semiflexible+Polymer.">Equilibrium Statistics of a Surface-Pinned Semiflexible Polymer.</a> Macromolecules. 46, 6659-6666 (2013).</li><li>Mills, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+evidence+that+single-stranded+regions+of+1+or+more+nucleotides+dramatically+increase+the+flexibility+of+DNA.">Electrophoretic evidence that single-stranded regions of 1 or more nucleotides dramatically increase the flexibility of DNA.</a> Biochemistry. 33, 1797-1803 (1994).</li></ol>

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Se utilizó un ensayo simple de una sola molécula basado en FRET para estudiar la cinética de bucle de ADN de diferentes formas intrínsecas. ADNs curvados se pueden preparar mediante la repetición de una secuencia de 10-mer, en fase con el período helicoidal de 10,5 pb, y sus curvaturas pueden ser estimados utilizando la página. Estos dsDNAs están diseñados con extremos pegajosos para permitir la estabilización transitoria de bucle. Se extrajo la tasa de bucle desde el aumento exponencial en el número de molé...

La comprensión de las propiedades mecánicas de ADN de doble cadena es de importancia fundamental en las ciencias básicas y aplicaciones de ingeniería. La estructura de ADN de doble cadena es más complicado que una escalera helicoidal recto debido ángulos de balanceo, inclinación y giro entre pares de bases sucesivas pueden variar con la secuencia. Fluctuaciones térmicas pueden provocar dsDNA a someterse a diversos modos de fluctuaciones conformacionales como la flexión, torsión y estiramiento. Transiciones de fusión tales como el retorcimiento y también pueden ocurrir en condiciones extremas. Entre estos movimientos, dsDNA flexión tiene el impacto biológico más sensible 1. ADN de doble cadena de flexión está asociada con la represión de genes o la activación por la unión de dos sitios distantes cerca uno del otro. También juega un papel importante en el empaquetamiento del ADN dentro del núcleo de la célula o de una cápside viral. Deformación por flexión de ADN de doble cadena se puede visualizar experimentalmente por microscopía de alta resolución (AFM 2 y TEM 3), y la Thermodynamics y cinéticas pueden ser estudiadas mediante ensayos de bucle, que enlazan químicamente sitios yuxtapuestos del ADN de doble cadena. Uno de tales ensayos es ligasa dependiente de ciclación 4. En este ensayo, las moléculas de ADN de doble cadena con extremos &#39;pegajosos&#39; (cohesivos) se circularized o dimerizados por ADN ligasa. Mediante la comparación de las tasas de círculo y la formación de dímero, se puede obtener una concentración molar eficaz de uno de los extremos del ADN en la proximidad del otro extremo, que se conoce como el factor de J. Este factor J es dimensionalmente equivalente a la densidad de probabilidad de encontrar un extremo del ADN a una distancia corta desde el otro extremo, y por lo tanto refleja la flexibilidad del ADN. Medir el factor de J como una función de la longitud del ADN revela muchas características acerca de la mecánica de ADN incluyendo el 4,5 longitud de persistencia. La cadena de gusano-como modelo (WLC) ha sido ampliamente considerado como el modelo canónico de polímero para la mecánica dsDNA en función de su éxito en la explicaciónnando las curvas fuerza-extensión obtenidos en el ADN tirando experimentos 6 y predecir correctamente los factores de J dsDNAs más de 200 pb 7. Sin embargo, usando el ensayo de ciclación en las moléculas de ADN de doble cadena tan cortos como 100 pb, Cloutier y Widom midieron los factores J ser varios órdenes de magnitud mayor que la predicción del modelo WLC 8. Un año más tarde, Du et al. producido J factores de acuerdo con el modelo WLC usando el ensayo de ciclación con concentraciones más bajas de ligasa y atribuido el resultado anómalo del grupo Widom a concentraciones altas ligasa utilizada 9. Esta controversia es un ejemplo de la influencia inevitable de la ADN ligasa en la cinética de ciclación cuando se utiliza el ensayo convencional 9. Por otra parte, la ligasa de ADN también puede afectar a la estructura del ADN y la rigidez a través inespecífica 10,11 vinculante. Para eliminar los problemas técnicos de los ensayos de bucles de proteínas dependientes, hemos demostrado una protensayo de bucle ein-gratuito basado en energía de resonancia fluorescente Transfer (FRET) 12. En este método, las conformaciones en bucle se detectan por FRET entre el donante y aceptor unido cerca de los extremos pegajosos de una molécula de ADN. Un microscopio de fluorescencia de reflexión total interna de tipo objetivo (TIRFM) se utiliza para registrar las trayectorias de bucle reversible y eventos unlooping de moléculas individuales de ADN inmovilizado en la superficie por un período de tiempo prolongado. Este método cuenta con el montaje basado en la PCR de moléculas de ADN para generar moléculas de ADN-desajuste libre, que es una mejora crucial en un método similar por Vafabakhsh y Ha 13. El aspecto de una sola molécula de este protocolo permite la medición de distribuciones en adición a Ensemble promedios mientras que el aspecto de FRET permite medir la dinámica de bucle de ADN repetidamente de la misma molécula, incluso en condiciones que pueden afectar la actividad ligasa. La configuración TIRFM se muestra en la Figura 1. Una costumbrePlatina de diseño se coloca sobre un cuerpo del microscopio Olympus IX61. 532 nm y 640 nm láser se introducen desde el lado y son reflejados por espejos diminutos elípticas 14 en el alta NA objetivo de lograr ángulo crítico de incidencia en la interfaz agua-cubreobjetos. Observamos que más generalizada-a través de objetivo TIR utilizando espejos dicroicos o configuraciones de TIR a base de prisma también se puede utilizar para esta aplicación de FRET. La imagen de fluorescencia formado por el microscopio se divide en donante y aceptor de imágenes por un espejo dicroico. Ellos se vuelven a reflejados en dos mitades de una EMCCD. Filtros de emisión de paso de largo adicionales se utilizan para reducir la señal de fondo. El control de temperatura es esencial para la adquisición de los datos cinéticos reproducibles. Para el control de la temperatura, el objetivo se separa de la pieza de nariz del cuerpo del microscopio para minimizar la transferencia de calor, y el agua de un enfriador controlada / calentador de la temperatura se hace circular a través de un collar de latón que encaja herméticamentealrededor del metal interior debajo de la chaqueta objetivo. Esta configuración es capaz de alcanzar control de la temperatura robusta en la superficie cubreobjetos entre 15 y 50 ° C (Figura 2). En este trabajo, la temperatura de la muestra se mantuvo a 24 ° C. El protocolo siguiente se presenta el procedimiento paso a paso para la construcción de ADN, la estimación de la forma de ADN, el experimento de una sola molécula, y la determinación del factor J.

<table><tbody><tr><td>Small DNA FRAG Extract Kit-100PR</td><td>VWR</td><td>97060-558</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide 40% solution 500 ml</td><td>VWR</td><td>97064-522</td><td></td></tr><tr><td>Bis-acrylamide 2% (w/v) solution 500 ml</td><td>VWR</td><td>97063-948</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp DNA Ladder, 100-1,000 bp</td><td>Fermentas</td><td>SM0241</td><td></td></tr><tr><td>Mini Vertical PAGE System</td><td>VWR</td><td>89032-300</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filter 0.2 &amp;mu;m CS50</td><td>VWR</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238813-1G</td><td>triplet state quencher</td></tr><tr><td>Protocatechuic acid (PCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>08992-50MG</td><td>oxygen scavenging system</td></tr><tr><td>Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8279-25UN</td><td>oxygen scavenging system</td></tr><tr><td>mPEG-silane, MW 2,000 1 g</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SIL-2000-1g</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEG-Silane, MW 3,400</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotin-PEG-SIL-3400-1g</td><td></td></tr><tr><td>Avidin, NeutrAvidin Biotin-binding Protein</td><td>Invitrogen</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>F-540L</td><td></td></tr><tr><td>Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit</td><td>IBI Scientific</td><td>IB47020</td><td></td></tr><tr><td>Premium plain glass microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>VWR micro cover glass, rectangular, no. 1</td><td>VWR</td><td>48404-456</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Isotemp 1006S Recirculating Chiller/Heater</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>temperature control</td></tr><tr><td>Objective Cooling Collar</td><td>Bioptechs</td><td>150303</td><td>temperature control</td></tr><tr><td>KMI53 Biological Micrometer Measuring Stage</td><td>Semprex</td><td>KMI53</td><td></td></tr><tr><td>High Performance DPSS Laser 532 nm 50 mW</td><td>Edmund optics</td><td>NT66-968</td><td>Cy3 excitation</td></tr><tr><td>CUBE Fiber Pigtailed 640 nm, 30 mW, Fiber, FC/APC Connector</td><td>Coherent</td><td>1139604</td><td>Cy5 excitation</td></tr><tr><td>650 nm BrightLine Dichroic Beamsplitter</td><td>Semrock</td><td>FF650-Di01-25x36</td><td>splitting dichroic</td></tr><tr><td>LaserMUX Beam Combiner, reflects 514.5, 532, &amp;amp; 543.5 nm lasers, 25 mm</td><td>Semrock</td><td>LM01-552-25</td><td>combining dichroic</td></tr><tr><td>Brightline Fluorescence Filter 593/40</td><td>Semrock</td><td>FF01-593/40-25</td><td>Cy3 emission filter</td></tr><tr><td>635 nm EdgeBasic LWP longpass Filter, 25 mm</td><td>Semrock</td><td>BLP01-635R-25</td><td>Cy5 emission filter</td></tr><tr><td>EMCCD iXon+</td><td>Andor Technology</td><td>DU-897E-CS0-#BV</td><td></td></tr><tr><td>IX51 inverted microscope frame</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objective UApo N 100X/1.49 Oil TIRF</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersion oil type-F for fluorescence microscopy</td><td>Olympus</td><td>IMMOIL-F30CC</td><td></td></tr><tr><td>2 mm Diameter 45&amp;deg; Rod Lens Aluminum Coated&amp;nbsp;</td><td>Edmund optics</td><td>54-092</td><td>miniature mirror</td></tr><tr><td>1/4&quot; Travel Single-Axis Translation Stage</td><td>Thorlabs</td><td>MS-1</td><td>translation of miniature mirror</td></tr><tr><td>&amp;Oslash;1&quot; Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=200 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-200-A</td><td>focusing lens</td></tr><tr><td>Adjustable Mechanical Slit</td><td>Thorlabs</td><td>VA100</td><td></td></tr><tr><td>Dielectric Mirror</td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E02</td><td></td></tr><tr><td>&amp;Oslash;1&quot; Achromatic Doublet, f = 100 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-100-A</td><td>relay lens</td></tr><tr><td>Lens Mount for &amp;Oslash;1&quot; Optics</td><td>Thorlabs</td><td>LMR1</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic Filter Mount</td><td>Thorlabs</td><td>FFM1</td><td></td></tr><tr><td>Fixed Cage Cube Platform</td><td>Thorlabs</td><td>B3C</td><td></td></tr><tr><td>Kinematic Mount for &amp;Oslash;1&quot; Optics</td><td>Thorlabs</td><td>KM100</td><td></td></tr><tr><td>N-BK7 Plano-Convex Lens, &amp;Oslash;1&quot;, f = 40 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LA1422-A</td><td>collimating lens</td></tr><tr><td>N-BK7 Plano-Convex Lense, &amp;Oslash;6.0 mm, f = 15 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LA1222-A</td><td>telescope lens</td></tr><tr><td>N-BK7 Plano-Convex Lense, &amp;Oslash;6.0 mm, f = 150 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LA1433-A</td><td>telescope lens</td></tr></tbody></table>

studying dna looping by single-molecule fret

De flexión de ADN de doble cadena (dsDNA) se asocia con muchos procesos biológicos importantes, tales como el reconocimiento de DNA-proteína y el empaquetamiento del ADN en nucleosomas. Termodinámica de ADN de doble cadena de flexión se ha estudiado mediante un método denominado ciclación que se basa en la ADN ligasa para unir covalentemente los extremos pegajosos cortos de un ADN de doble cadena. Sin embargo, la eficiencia de la ligadura puede verse afectada por muchos factores que no están relacionados con dsDNA bucle tales como la estructura del ADN que rodea los extremos pegajosos unidas, y ligasa también puede afectar a la velocidad de bucle evidente a través de mecanismos tales como la unión no específica. Aquí, se muestra la forma de medir la cinética de bucle de ADN bicatenario sin ligasa mediante la detección de la formación de bucle de ADN transitoria por FRET (transferencia de energía de resonancia fluorescente). moléculas de ADN de doble cadena se construyen usando un simple protocolo basado en PCR con un par de FRET y un enlazador biotina. La densidad de probabilidad de bucle conocido como el factor de J se extrae de la tasa de bucle y la tasa de recocido entre dos desconexiónted extremos pegajosos. Al poner a prueba dos dsDNAs con diferentes curvaturas intrínsecas, se muestra que el factor J es sensible a la forma intrínseca de la ADN de doble cadena.

Moléculas de ADN utilizados para el estudio de bucle consisten en una región dúplex de la secuencia y longitud variables y salientes monocatenarios que son complementarios entre sí. Los salientes, que son 7 bases de longitud, pueden hibridar entre sí para capturar el estado de bucle. Cada saliente contiene ya sea Cy3 o Cy5 que está vinculado en la columna vertebral del ADN a través de la química amidita. El Cy5-alero también está vinculado con biotina-TEG (15-átomo de Tetra-etilenglicol espaciador) para la in...

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Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Este estudio presenta un procedimiento experimental detallado para medir la dinámica de bucle de ADN de doble cadena utilizando una sola molécula de transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET). El protocolo también se describe cómo extraer la densidad de probabilidad de bucle llamado factor J.

El estudio de ADN Looping por FRET sola molécula

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

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Research

JoVE Journal

Biology

15.3K vistas.  Georgia Institute of Technology.  Este estudio presenta un procedimiento experimental detallado para medir la dinámica de bucle de ADN de doble cadena utilizando una sola molécula de transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET). El protocolo también se describe cómo extraer la densidad de probabilidad de bucle llamado factor J. 

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A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, glass coverslips are functionalized in a one-step reaction with silane-PEG-biotin. Flow cells are constructed by sandwiching an adhesive tape with pre-cut channels between a functionalized coverslip and a PDMS slab containing inlet and outlet holes. Multiple channels are integrated into one flow cell and the flow of reagents into each channel can be fully automated, which significantly increases the assay throughput and reduces hands-on time per assay. Inside each channel, biotin-&#955;-DNAs are immobilized on the surface and a laminar flow is applied to flow-stretch the DNAs. The DNA molecules are stretched to &#62;80% of their contour length and serve as spatially extended templates for studying the binding and transport activity of fluorescently labeled molecules. The trajectories of single molecules are tracked by time-lapse Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) imaging. Raw images are analyzed using streamlined custom single particle tracking software to automatically identify trajectories of single molecules diffusing along DNA and estimate their 1D diffusion constants.

This protocol demonstrates a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying one-dimensional (1D) diffusion of molecules along DNA.

Una sola molécula Simple, robusto y alto rendimiento flujo estiramiento aplicación de análisis para el estudio de transporte de moléculas a lo largo de la DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Investigación

Bioquímica

Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. To investigate its mechanism, there are two essential technical requirements. First is single-nt resolution that can resolve normal translocation from frameshifting, during which the ribosome moves by other than 3 nt. The second is the capability to probe both the entrance and exit sides of mRNA in order to elucidate the whole picture of translocation. We report the dual DNA ruler assay that is based on the critical dissociation forces of DNA-mRNA duplexes, obtained by force-induced remnant magnetization spectroscopy (FIRMS).&#160; With 2-4 pN force resolution, the dual ruler assay is sufficient to distinguish different translocation steps. By implementing a long linker on the probing DNAs, they can reach the mRNA on the opposite side of the ribosome, so that the mRNA position can be determined for both sides. Therefore, the dual ruler assay is uniquely suited to investigate the ribosome translocation, and nucleic acid motion in general. We show representative results which indicated a looped mRNA conformation and resolved normal translocation from frameshifting.

Dual DNA ruler assay is developed to determine the mRNA position during ribosome translocation, which relies on the dissociation forces of the formed DNA-mRNA duplexes. With single-nucleotide resolution and capability of reaching both ends of mRNA, it can provide mechanistic insights for ribosome translocation and probe other nucleic acid displacements.

Los gobernantes de ADN dual estudiarán el mecanismo de la translocación ribosoma con resolución de un solo nucleótido

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. ...

R-Loop Analysis by Dot-Blot

The three-stranded nucleic acid structure, R-loop, is increasingly recognized for its role in gene regulation. Initially, R-loops were thought to be the by-products of transcription; but recent findings of fewer R-loops in diseased cells made it clear that R-loops have functional roles in a variety of human cells. Next, it is critical to understand the roles of R-loops and how cells balance their abundance. A challenge in the field is the quantitation of R-loops since much of the work relies on the S9.6 monoclonal antibody whose specificity for RNA-DNA hybrids has been questioned. Here, we use dot-blots with the S9.6 antibody to quantify R-loops and show the sensitivity and specificity of this assay with RNase H, RNase T1, and RNase III that cleave RNA-DNA hybrids, single-stranded RNA, and double-stranded RNA, respectively. This method is highly reproducible, uses general laboratory equipment and reagents, and provides results within two days. This assay can be used in research and clinical settings to quantify R-loops and assess the effect of mutations in genes such as senataxin on R-loop abundance.

This protocol details a simple method that quantifies R-loop, a three-stranded nucleic acid structure that comprises of an RNA-DNA hybrid and a displaced DNA strand.

The three-stranded nucleic acid structure, R-loop, is increasingly recognized for its role in gene regulation. Initially, R-loops were thought to be the ...

Genética

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Visualización de una sola molécula de ADN de replicación con microscopía de fluorescencia

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Biología

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for hundreds of individual restriction endonuclease (REase) molecules in one experiment. This assay does not require protein labeling and can be carried out with a single imaging channel. In addition, the results of multiple individual experiments can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions. Analysis of the resulting dwell-time distributions can help elucidate the DNA cleavage mechanism by revealing the presence of kinetic steps that cannot be directly observed. Example data collected using this assay with the well-studied REase, EcoRV - a dimeric Type IIP restriction endonuclease that cleaves the palindromic sequence GAT&#8595;ATC (where &#8595; is the cut site) - are in agreement with prior studies. These results suggest that there are at least three steps in the pathway to DNA cleavage that is initiated by introducing magnesium after EcoRV binds DNA in its absence, with an average rate of 0.17 s-1 for each step.

Using quantum-dot-labeled DNA and total internal reflection fluorescence microscopy, we can investigate the reaction mechanism of restriction endonucleases while using unlabeled protein. This single-molecule technique allows for massively multiplexed observation of individual protein-DNA interactions, and data can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions.

Análisis de tiempo de permanencia de una sola molécula de la escisión de ADN mediada por endonucleasas de restricción

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

La observación directa de ADN Enzimas Replicar El uso de un ADN de una sola molécula de estiramiento de ensayo

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 (FET) family of fusion oncoproteins, is one of the most frequently involved fusion genes in Ewing sarcoma. These FET family fusion proteins typically harbor a low-complexity domain (LCD) of FET protein at their N-terminus and a DNA-binding domain (DBD) at their C-terminus. EWS-FLI1 has been confirmed to form biomolecular condensates at its target binding loci due to LCD-LCD and LCD-DBD interactions, and these condensates can recruit RNA polymerase II to enhance gene transcription. However, how these condensates are assembled at their binding sites remains unclear. Recently, a single-molecule biophysics method-DNA Curtains-was applied to visualize these assembling processes of EWS-FLI1 condensates. Here, the detailed experimental protocol and data analysis approaches are discussed for the application of DNA Curtains in studying the biomolecular condensates assembling on target DNA.

Here, we describe the use of the single-molecule imaging method, DNA Curtains, to study the biophysical mechanism of EWS-FLI1 condensates assembling on DNA.

Imágenes de una sola molécula de condensados EWS-FLI1 ensamblados en ADN

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

<meta charset="utf8"></head><body>Reconstitución de nucleosomas in situ para estudios de moléculas individuales

In Situ Nucleosome Assembly for Single-Molecule Correlative Force and Fluorescence Microscopy

Nucleosomes constitute the primary unit of eukaryotic chromatin and have been the focus of numerous informative single-molecule investigations regarding their biophysical properties and interactions with chromatin-binding proteins. Nucleosome reconstitution on DNA for these studies typically involves a salt dialysis procedure that provides precise control over the placement and number of nucleosomes formed along a DNA tether. However, this protocol is time-consuming and requires a substantial amount of DNA and histone octamers as inputs. To offer an alternative strategy, an in situ nucleosome reconstitution method for single-molecule force and fluorescence microscopy that utilizes the histone chaperone Nap1 is described. This method enables users to assemble nucleosomes on any DNA template without the need for strong nucleosome positioning sequences, adjust nucleosome density on demand, and use fewer reagents. In situ nucleosome formation occurs within seconds, offering a simpler experimental workflow and a convenient transition into single-molecule measurements. Examples of two downstream assays for probing nucleosome mechanics and visualizing the behavior of individual proteins on chromatin are further described.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Reconstitución eficiente de nucleosomas para técnicas de molécula única

This article presents a detailed experimental procedure for reconstituting nucleosome-containing DNA tethers for single-molecule correlative force and fluorescence microscopy. It further describes several downstream experiments that can be conducted to visualize the binding behavior of chromatin-interacting proteins and analyze changes in the physical properties of nucleosomes.

Ensamblaje de nucleosomas in situ para microscopía de fuerza correlativa y fluorescencia de una sola molécula

Nucleosomes constitute the primary unit of eukaryotic chromatin and have been the focus of numerous informative single-molecule investigations regarding ...

El estudio de ADN Looping por FRET sola molécula

Resumen

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Una sola molécula Simple, robusto y alto rendimiento flujo estiramiento aplicación de análisis para el estudio de transporte de moléculas a lo largo de la DNA

Los gobernantes de ADN dual estudiarán el mecanismo de la translocación ribosoma con resolución de un solo nucleótido

R-Loop Analysis by Dot-Blot

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Ensamblaje de nucleosomas in situ para microscopía de fuerza correlativa y fluorescencia de una sola molécula

Ensamblaje de nucleosomas in situ para microscopía de fuerza correlativa y fluorescencia de una sola molécula

Ensamblaje de nucleosomas in situ para microscopía de fuerza correlativa y fluorescencia de una sola molécula