Name: studying dna looping by single-molecule fret
Uploaded: 2014-06-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET at JoVE.com

Ringraziamo James Waters, Gable Wadsworth e Bo Broadwater per criticamente la lettura del manoscritto. Ringraziamo anche quattro revisori anonimi per fornire commenti utili. Noi riconosciamo il sostegno finanziario Georgia Institute of Technology, il Burroughs Wellcome Fund Award Career l&#39;interfaccia scientifico, e la borsa di rete di ricerca studente dalla NSF Fisica dei sistemi viventi.

1. Preparazione dsDNA campione <ol><li> Progettare DNA curve globalmente ripetendo una sequenza di 10-mer. Ad esempio, 5&#39;-GTGCCAGCAACAGATAGC - (TTTATCATCCTTTATCATCC X) 7 - TTTCATTCGAGCTCGTTGTTG-3 &#39;è un DNA curvo 186-bp, dove X è una base supplementare casuale e la sequenza fiancheggiante la sequenza ripetuta 10-mer sono sequenze adattatore. NOTA:. In questo esempio 15 sono stati scelti due 10-mers con preferenze opposte alla formazione dei nucleosomi sulla base di una larga scala studio occupazione nucleosomi da Kaplan et al. Poiché la ripetizione dell&#39;elica di dsDNA è vicino a 10 bp, qualsiasi deviazione netto dell&#39;asse elicoidale del 10-mer si accumulerà per produrre una forma ad arco di cerchio (Figura 3A). Poiché il periodo elicoidale è più vicino a 10,5 bp, una base supplementare è inserito dopo ogni due ripetizioni di mantenere la struttura curva come planare possibile. Queste sequenze più brevi di 200 bp possono essere ordinati da companies che offrono gene servizio di sintesi. E &#39;conveniente per affiancare queste sequenze con sequenze adattatori comuni per i passi successivi. La procedura è schematizzata in Figura 3B. </li><li> Eseguire la PCR con Primer 1 (GTGCCAGCAACAGATAGC) e Primer 2 (/ 5Cy3/TAAATTCCTACAACAACGAGCTCGAATG). NOTA: Primer 2 è etichettato con il Cy3 donatore FRET all&#39;estremità 5 &#39;. Una tipica ricetta PCR e protocollo di ciclismo sono presentati nelle tabelle 1 e 2. </li><li> Eseguire la PCR con Primer 3 (/ 5BioTEG/GAAACATAG/iCy5/GAATTTACCGTGCCAGCAACAGATAGC) e Primer 4 (CAACAACGAGCTCGAATG). NOTA: Primer 3 è etichettato con l&#39;accettante Cy5 FRET attraverso la spina dorsale e la biotina-linker all&#39;estremità 5 &#39;. PCR ricetta e il protocollo ciclismo sono come sopra. </li><li> Purificare i prodotti di PCR utilizzando un kit di pulizia PCR. </li><li> Mescolare il prodotto Cy3 marcato e il prodotto Cy5 marcato in un buffer di scambio strand (NaCl 100 mM, 10 mM Tris-HCl pH 7,0, 1 mM EDTA) a concentrazioni finali di 0,4 &amp;# 181, M e 0,1 micron, rispettivamente. NOTA: L&#39;eccesso Cy3-DNA aumenta la concentrazione del duplex trasportare sia Cy3 e Cy5 per effetto dello scambio filamento. </li><li> Scambio trefoli incubando a 98,5 ° C per 2 min, gradualmente raffreddamento a 5 ° C con velocità di rampa di 0,1 ° C / sec, e incubando a 5 &#160; ° C per 2 ore. </li></ol> 2. Elettroforesi su gel per rilevare dsDNA curvatura <ol><li> Versare il gel poliacrilammide 16,17 mescolando acrilammide e soluzioni bis-acrilammide a 29.2:0.8 rapporto, 5% (w / v) in 1X Tris / Borato / EDTA (TBE) tampone a pH 8,0. Nota: 10 ml di soluzione di gel contiene: 1.217 ml 40% di acrilammide, 0.667 ml 2% bis-acrilammide, 1 ml di TBE 10X, 100 L persolfato di ammonio (APS) 10%, 10 L TEMED, e il resto è dH 2 O. Solidificazione completa del gel dura circa 30 min. </li><li> Caricare il gel di poliacrilammide con campioni di DNA e il DNA ladder in 1X tampone di caricamento (5% glicerolo, 0,03% (w / v) di bromofenolo blue) ed eseguire il gel a 5-8 V / cm a 4 ° C per 45 minuti o fino a quando il fronte del colorante si avvicina alla fine del gel. </li><li> Macchiare il gel utilizzando tampone 1X TBE contenente 0,5 g / ml di etidio bromuro per 30 min. Identificare le bande di DNA sotto illuminazione UV. Confronta le posizioni di banda con il marcatore di formato (100 bp DNA ladder) per calcolare le dimensioni apparenti delle molecole di DNA. NOTA: curvo DNA generalmente si muovono più lentamente rispetto DNA dritto. </li></ol> 3. Flusso Preparazione cellulare <ol><li> Praticare 6-7 coppie di fori lungo due lati opposti di un vetrino (3&#39;&#39; x 1&#39;&#39;) utilizzando un trapano a colonna e punte di diamante. Dopo la foratura, strofinare lo scivolo in acqua corrente per eliminare polvere di vetro visibile. NOTA: I fori servono come ingressi di perfusione e punti vendita. Durante la perforazione, raffreddando il vetrino con acqua è importante per evitare fessurazioni. </li><li> Porre i vetrini in posizione verticale in un barattolo di vetro e riempirlo con acqua. Ultrasuoni per 15 min e trasferirli in un altro vaso di vetro dedicated per pulizia acetone. Riempire con acetone e ultrasuoni per 15 min. Sciacquare i vetrini con etanolo utilizzando un flacone spray e poi con acqua. Metterli in un barattolo di polipropilene, riempirlo con idrossido di potassio 5 M, e ultrasuoni per 15 min. Infine, sonicare i vetrini in acqua per 15 minuti. Pulire i coprioggetti (n. 1, 24 x 40 mm) utilizzando lo stesso protocollo. NOTA: diapositive e vetrini puliti possono essere memorizzati in dH 2 O per l&#39;uso a lungo termine. </li><li> Mescolare 1 mg di biotina-PEG-silano (MW 3400) con 80 mg di MPEG-silano (MW 2000) in 340 L di soluzione di bicarbonato 0,1 M di sodio. Mescolare bene e centrifugare la miscela brevemente per sbarazzarsi di bolle. NOTA: La funzionalizzazione della superficie con polietilene glicole (PEG) aiuta a ridurre il legame non specifico del DNA alla superficie. </li><li> Mettere 80 L della soluzione di PEG in ogni diapositiva e abbassare delicatamente un coprioggetto su di esso. Attendere 45 min. Separare il vetrino dalla diapositiva con le pinzette, sciacquare con abbondante dH 2 O e lasciare torlo asciugare all&#39;aria aperta. </li><li> Mettere sottili strisce di nastro biadesivo in tutta la diapositiva di formare canali. Allineare un coprioggetto su di esso e premere con decisione il vetrino contro la diapositiva di formare canali a tenuta stagna. Utilizzare 5 minuti epossidica per sigillare i bordi dei canali. </li></ol> 4. Preparazione della Soluzione Trolox <ol><li> Mettere ~ 30 mg Trolox e 10 ml di dH 2 O in un pallone e utilizzare una barra di magnete scalpore per mescolare la soluzione all&#39;aria aperta per 18 ore. </li><li> Filtrare la soluzione con un filtro da 0,2 micron e regolare il pH a 7 con l&#39;aggiunta di ~ 6 microlitri di 1 base M Tris (pH 11). Nota: Trolox è un reagente anti-lampeggiante che viene comunemente usato in singola molecola studi 18. L&#39;azione antiscolorimento di Trolox deriva dal suo derivato ossidato che è presente in parzialmente degradata soluzione Trolox 19. Sciogliendo rapidamente Trolox in metanolo o ad alto pH della soluzione Tris deve essere evitato a causa dell&#39;ossidazione inefficiente. </li></ol> 5. Single-molImaging ecule <ol><li> Iniettare 15 ml di soluzione NeutrAvidin (0,5 mg / ml) nel canale e attendere 2 minuti prima di risciacquare con 100 microlitri di tampone T50 (10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7,0). </li><li> Iniettare 50 ml di campione di DNA (50-100 pM) nel canale. Attendere 5 minuti e risciacquare il DNA non legato via con 100 L di tampone T50. NOTA: molecole di DNA saranno specificatamente legarsi alla superficie attraverso l&#39;interazione NeutrAvidin-biotina. </li><li> Riempire il canale con il buffer di imaging che contiene un sistema che assorbe ossigeno 20 (PCD 100 mM, 5 mM PCA, 1 Trolox mM e NaCl 500 mM). </li><li> Impostare la EMCCD in modalità a trasferimento di quadro per lo streaming di 2 x 2 immagini categorizzate (256 x 256) al computer a 25 fotogrammi al secondo. </li><li> Mettete l&#39;olio per immersione sull&#39;obiettivo microscopio, e fissare la cella di flusso sul palco microscopio utilizzando clip campioni. Coarse-regolare il fuoco osservando il modello riflessione laser sulla parete. Fine-regolare la messa a fuoco utilizzando la visualizzazione in tempo reale della fluorescenza imetà sul monitor. </li><li> Iniziare acquisizione dati con il laser 532 nm su. Controllare il live view e regolare la messa a fuoco, se necessario. Smettere di acquisizione dati quando la maggior parte delle molecole sono fotodecolorate. NOTA: In questa struttura, viene utilizzato un programma-lab scritta C per controllare il microscopio e visualizzare le immagini in diretta sul monitor in quanto vengono salvati sul disco rigido. </li></ol> 6. Elaborazione delle immagini e analisi dei dati NOTA: Una serie temporale di 256 x 256 le immagini vengono elaborate da un codice MATLAB per generare singola molecola tempo tracce di Cy3 e Cy5 intensità. Per accoppiare pixel tra il canale donatore e accettore canale dell&#39;immagine split-view, 6-7 coppie di Cy3 e Cy5 macchie, ciascuna coppia dalla stessa molecola uniformemente dispersa attraverso il campo di vista, vengono raccolte manualmente, e una trasformazione affine viene calcolato utilizzando le coordinate di questi punti come punti di ancoraggio. <ol><li> Utilizzo di uno script MATLAB, guardare attraverso tutti i tempi singola molecola tracce tcappello mostrano più transizioni tra i segnali alte e basse tasto. Identificare gli stati in loop e in loop. NOTA: Il segnale FRET è definita come l&#39;intensità Cy5 (I a) diviso per la somma di Cy3 e Cy5 intensità (I a + I d). Stato Looped ha un alto valore FRET mentre lo stato in loop ha un valore basso FRET. L&#39;istogramma dei segnali FRET da una singola molecola è bimodale distribuito a causa di looping reversibile e unlooping. </li><li> Trova la soglia che separa le due distribuzioni determinando l&#39;intersezione tra le due curve gaussiane muro. </li><li> Calcolare l&#39;efficienza FRET come <img fo:content-width="0.6in" src="/files/ftp_upload/51667/eq7.jpg" /> e assegnare gli stati ansa con alti valori di FRET e gli stati in loop con valori bassi FRET. </li><li> Utilizzo di uno script MATLAB, analizzare il numero cumulativo di molecole (N (t)), che in loop (oraggiunto lo stato alto FRET) a diversi time-lapse da inizio acquisizione dati. NOTA: Dal momento che una molecola di dsDNA può iniziare in qualsiasi conformazione dello stato in loop all&#39;inizio di acquisizione dati, il tasso di aumento della popolazione loop riflette il tasso medio di ciclo media di oltre conformazioni iniziali. Estrarre il looping ciclo tasso k montando N (t) con una funzione esponenziale: <img fo:content-width="1.8in" src="/files/ftp_upload/51667/eq1.jpg" /> Se aumenta bifasico, può essere dotato di una doppia funzione esponenziale: <img fo:content-width="2.2in" src="/files/ftp_upload/51667/eq2.jpg" /> In questo caso, k ciclo è ottenuta da: <img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51667/eq3.jpg" /> NOTA: Teoricamente, la probabilità di sopravvivenza che un polimero non ha loop al tempo t non è una singola o doppia funzione esponenziale 12. FITT esponenzialeING è usato come un mezzo pratico per estrarre il tempo medio looping. </li></ol> 7. Determinazione del fattore J NOTA: Il fattore J rappresenta come concentrato un&#39;estremità di un dsDNA è intorno all&#39;altra estremità. Può essere determinato interpolando la concentrazione di una estremità del segmento di DNA che produrrebbe la stessa velocità di reazione con l&#39;altra estremità segmento come tasso loop misurata. Sperimentalmente, un segmento finale viene immobilizzato sulla superficie, e l&#39;altra estremità segmento viene introdotto ad una certa concentrazione c. Se il tasso di ricottura misurata tra le due estremità è k ricottura, allora il fattore J 21 è dato da <img fo:content-width="0.6in" src="/files/ftp_upload/51667/eq4.jpg" /> . La costante di velocità di ricottura (k = k ricottura ricottura / C) è indipendente dalla concentrazione sonda. <ol><li> Flusso 20 l di 30-50 pM biotina-Cy5 oligo (Primer 3) into un canale NeutrAvidin rivestita. Sciacquare il canale con 100 microlitri T50 per lavare via oligo non legato. </li><li> Preparare il tampone di imaging come descritto nella parte 5 con l&#39;aggiunta di Cy3 oligo (Primer 2) ad una concentrazione finale di 50 nM. Flusso questo buffer di imaging nel canale. </li><li> Pur mantenendo il laser 532 nm su, girare brevemente il laser 640 nm a identificare le posizioni di associazione superficie Cy5 oligo. Spegnere il laser 640 nm e iniziare a monitorare il segnale FRET. NOTA: Su ibridazione di un oligo Cy3 ad un Cy5 oligo-bound superficie, Cy5 fluorescenza derivare da FRET. </li><li> Utilizzo di uno script MATLAB, analizzare il numero di molecole che si aprono nello stato non legato (bassa intensità Cy5) ma poi si trasformano in stato (intensità alta Cy5) ricotto in funzione del tempo per l&#39;intensità tracce Cy5. </li><li> Tracciare questo numero di molecole vs tempo ricottura. Montare questa curva con una singola funzione esponenziale ( <img fo:content-width="1.8in" src="/files/ftp_upload/51667/eq5.jpg"/&gt;) Per ottenere il tasso di ricottura (k tempra). </li><li> Ripetere questo esperimento a diverse concentrazioni Cy3 oligo (60, 100 e 180 nm) per confermare la linearità tra il tasso di ricottura e la concentrazione reagente. Estrarre la costante di velocità di ricottura secondo ordine (k tempra ) Dal pendio. </li><li> Calcolare il fattore J da <img fo:content-width="0.6in" src="/files/ftp_upload/51667/eq6.jpg" /> , Dove k ciclo è il tasso loop misurata nelle stesse condizioni buffer. </li></ol>

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Gli autori dichiarano assenza di conflitti di interesse.

Un semplice test single-molecule basato su FRET è stato usato per studiare la cinetica di loop di DNA di diverse forme intrinseche. DNA curve possono essere preparati ripetendo una sequenza di 10-mer in fase con il periodo elicoidale di 10,5 bp, e le curvature possono essere stimati usando PAGE. Questi dsDNAs sono progettati con le estremità adesive per permettere la stabilizzazione ciclo transitorio. Abbiamo estratto il tasso loop dalla crescita esponenziale del numero di molecole in loop nel tempo. La costante di ve...

Comprendere le proprietà meccaniche di dsDNA è di fondamentale importanza nelle scienze di base e applicazioni di ingegneria. La struttura di dsDNA è più complicato di una scala elicoidale dritto, perché angoli di rollio, inclinazione e torsione tra coppie di basi successive possono variare con la sequenza. Fluttuazioni termiche possono causare dsDNA di sottoporsi a diversi modi di fluttuazioni conformazionali come la flessione, torsione e stretching. Transizioni come fusione e attorcigliamenti possono verificarsi anche in condizioni estreme. Tra questi movimenti, dsDNA flessione ha l&#39;impatto biologico più evidente 1. dsDNA piegatura è associato repressione genica o attivazione portando due siti distanti vicini tra loro. Esso gioca un ruolo importante nella confezione DNA all&#39;interno del nucleo cellulare o un capside virale. Deformazione piegatura di dsDNA possono essere visualizzati sperimentalmente microscopia ad alta risoluzione (AFM 2 e 3 TEM), e il Thermodynamics e cinetiche possono essere studiati mediante saggi di looping, che legano chimicamente siti giustapposte del dsDNA. Un tale saggio è ligasi-dipendente ciclizzazione 4. In questo saggio, le molecole di dsDNA con (coesivi) estremita &#39;adesive&#39; sono circolarizzato o dimerizzate da DNA ligasi. Confrontando i tassi di cerchio e la formazione di dimeri, si può ottenere una concentrazione molare efficace di una delle estremità del DNA in prossimità dell&#39;altra estremità, che è conosciuto come il fattore J. Questo fattore J è dimensionalmente equivalente alla densità di probabilità di trovare una estremità del DNA a breve distanza dall&#39;altra estremità, e riflette quindi la flessibilità del DNA. Misurare il fattore J in funzione della lunghezza del DNA rivela molte caratteristiche di meccanica DNA compresa la lunghezza di persistenza 4,5. La catena vermiforme (WLC) modello è stato ampiamente considerato come il modello di polimero canonico per la meccanica dsDNA in base al suo successo nel spiegazioneining le curve forza-estensione ottenuti in DNA tirare esperimenti 6, e correttamente predire i fattori di J dsDNAs più di 200 bp 7. Tuttavia, utilizzando il test ciclizzazione su molecole dsDNA più brevi 100 bp, Cloutier e Widom misurato i fattori J di essere diversi ordini di grandezza superiori rispetto al modello WLC previsione 8. Un anno dopo, Du et al. prodotta fattori J in accordo con il modello WLC utilizzando il test ciclizzazione con concentrazioni più basse di ligasi e attribuito il risultato anomalo dal gruppo Widom ad alte concentrazioni ligasi utilizzati 9. Questa controversia esemplifica l&#39;influenza inevitabile di DNA ligasi sulla cinetica di ciclizzazione quando si utilizza il test convenzionali 9. Inoltre, DNA ligasi può anche influenzare la struttura del DNA e la rigidità attraverso legame non specifico 10,11. Per eliminare le preoccupazioni tecniche di analisi looping proteina-dipendente, abbiamo recentemente dimostrato una prottest looping ein-libero basato sul Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) 12. In questo metodo, conformazioni loop vengono rilevati dal FRET tra donatore e accettore divisoria in prossimità delle estremità appiccicose di una molecola di DNA. Un microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale obiettivo di tipo (TIRFM) viene utilizzato per registrare traiettorie di ciclaggio reversibile e eventi unlooping di molecole di DNA a singola superficie immobilizzato per un periodo prolungato di tempo. Questo metodo offre assemblaggio basato su PCR di molecole di DNA per generare molecole di DNA senza disadattamento, che è un miglioramento fondamentale per un metodo simile per Vafabakhsh e Ha 13. L&#39;aspetto unico molecola di questo protocollo permette misura delle distribuzioni oltre Ensemble medie mentre l&#39;aspetto FRET permette di misurare la dinamica di ciclica DNA ripetutamente dalla stessa molecola, anche in condizioni che possono alterare ligasi attività. La configurazione TIRFM è mostrato in Figura 1. A personalizzatoPortaoggetti progettato è posto sopra un corpo del microscopio Olympus IX61. 532 nm e 640 nm laser vengono introdotti dal lato e sono riflessi da specchi ellittici minuscoli 14 nella alta obiettivo NA per ottenere l&#39;angolo di incidenza critico all&#39;interfaccia coprioggetto-acqua. Notiamo che più diffusa passante obiettivo TIR utilizzando specchi dicroici o configurazioni TIR basato prisma può essere utilizzato anche per questa applicazione FRET. L&#39;immagine di fluorescenza formata dal microscopio è suddiviso in immagini donatore e accettore da uno specchio dicroico. Vengono poi ri-masterizzata su due metà di un EMCCD. Ulteriori filtri di emissione passa-lungo sono utilizzati per ridurre segnale di fondo. Il controllo della temperatura è essenziale per acquisire dati cinetici riproducibili. Per il controllo della temperatura, l&#39;obiettivo è separato dal boccaglio del corpo del microscopio per ridurre al minimo il trasferimento di calore, e l&#39;acqua da un raffreddatore / riscaldatore di temperatura controllata è distribuito attraverso un collare di ottone che si adatta strettamenteattorno al metallo interno sotto la giacca obiettivo. Questa configurazione è in grado di ottenere il controllo della temperatura solido a superficie coprioggetto tra 15 e 50 ° C (Figura 2). In questo lavoro, la temperatura del campione è stata mantenuta a 24 ° C. Il protocollo seguente presenta la procedura step-by-step per la costruzione del DNA, la stima di forma del DNA, esperimento di singola molecola, e J determinazione fattore.

<table><tbody><tr><td>Small DNA FRAG Extract Kit-100PR</td><td>VWR</td><td>97060-558</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide 40% solution 500 ml</td><td>VWR</td><td>97064-522</td><td></td></tr><tr><td>Bis-acrylamide 2% (w/v) solution 500 ml</td><td>VWR</td><td>97063-948</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp DNA Ladder, 100-1,000 bp</td><td>Fermentas</td><td>SM0241</td><td></td></tr><tr><td>Mini Vertical PAGE System</td><td>VWR</td><td>89032-300</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filter 0.2 &amp;mu;m CS50</td><td>VWR</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238813-1G</td><td>triplet state quencher</td></tr><tr><td>Protocatechuic acid (PCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>08992-50MG</td><td>oxygen scavenging system</td></tr><tr><td>Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8279-25UN</td><td>oxygen scavenging system</td></tr><tr><td>mPEG-silane, MW 2,000 1 g</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SIL-2000-1g</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEG-Silane, MW 3,400</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotin-PEG-SIL-3400-1g</td><td></td></tr><tr><td>Avidin, NeutrAvidin Biotin-binding Protein</td><td>Invitrogen</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>F-540L</td><td></td></tr><tr><td>Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit</td><td>IBI Scientific</td><td>IB47020</td><td></td></tr><tr><td>Premium plain glass microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>VWR micro cover glass, rectangular, no. 1</td><td>VWR</td><td>48404-456</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Isotemp 1006S Recirculating Chiller/Heater</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>temperature control</td></tr><tr><td>Objective Cooling Collar</td><td>Bioptechs</td><td>150303</td><td>temperature control</td></tr><tr><td>KMI53 Biological Micrometer Measuring Stage</td><td>Semprex</td><td>KMI53</td><td></td></tr><tr><td>High Performance DPSS Laser 532 nm 50 mW</td><td>Edmund optics</td><td>NT66-968</td><td>Cy3 excitation</td></tr><tr><td>CUBE Fiber Pigtailed 640 nm, 30 mW, Fiber, FC/APC Connector</td><td>Coherent</td><td>1139604</td><td>Cy5 excitation</td></tr><tr><td>650 nm BrightLine Dichroic Beamsplitter</td><td>Semrock</td><td>FF650-Di01-25x36</td><td>splitting dichroic</td></tr><tr><td>LaserMUX Beam Combiner, reflects 514.5, 532, &amp;amp; 543.5 nm lasers, 25 mm</td><td>Semrock</td><td>LM01-552-25</td><td>combining dichroic</td></tr><tr><td>Brightline Fluorescence Filter 593/40</td><td>Semrock</td><td>FF01-593/40-25</td><td>Cy3 emission filter</td></tr><tr><td>635 nm EdgeBasic LWP longpass Filter, 25 mm</td><td>Semrock</td><td>BLP01-635R-25</td><td>Cy5 emission filter</td></tr><tr><td>EMCCD iXon+</td><td>Andor Technology</td><td>DU-897E-CS0-#BV</td><td></td></tr><tr><td>IX51 inverted microscope frame</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objective UApo N 100X/1.49 Oil TIRF</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersion oil type-F for fluorescence microscopy</td><td>Olympus</td><td>IMMOIL-F30CC</td><td></td></tr><tr><td>2 mm Diameter 45&amp;deg; Rod Lens Aluminum Coated&amp;nbsp;</td><td>Edmund optics</td><td>54-092</td><td>miniature mirror</td></tr><tr><td>1/4&quot; Travel Single-Axis Translation Stage</td><td>Thorlabs</td><td>MS-1</td><td>translation of miniature mirror</td></tr><tr><td>&amp;Oslash;1&quot; Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=200 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-200-A</td><td>focusing lens</td></tr><tr><td>Adjustable Mechanical Slit</td><td>Thorlabs</td><td>VA100</td><td></td></tr><tr><td>Dielectric Mirror</td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E02</td><td></td></tr><tr><td>&amp;Oslash;1&quot; Achromatic Doublet, f = 100 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-100-A</td><td>relay lens</td></tr><tr><td>Lens Mount for &amp;Oslash;1&quot; Optics</td><td>Thorlabs</td><td>LMR1</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic Filter Mount</td><td>Thorlabs</td><td>FFM1</td><td></td></tr><tr><td>Fixed Cage Cube Platform</td><td>Thorlabs</td><td>B3C</td><td></td></tr><tr><td>Kinematic Mount for &amp;Oslash;1&quot; Optics</td><td>Thorlabs</td><td>KM100</td><td></td></tr><tr><td>N-BK7 Plano-Convex Lens, &amp;Oslash;1&quot;, f = 40 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LA1422-A</td><td>collimating lens</td></tr><tr><td>N-BK7 Plano-Convex Lense, &amp;Oslash;6.0 mm, f = 15 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LA1222-A</td><td>telescope lens</td></tr><tr><td>N-BK7 Plano-Convex Lense, &amp;Oslash;6.0 mm, f = 150 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LA1433-A</td><td>telescope lens</td></tr></tbody></table>

studying dna looping by single-molecule fret

Curvatura del DNA a doppia elica (dsDNA) è associato con molti importanti processi biologici quali il riconoscimento DNA-proteine ​​e confezionamento DNA in nucleosomi. Termodinamica di dsDNA curvatura è stata studiata da un metodo chiamato ciclizzazione che si basa sul DNA ligasi di unirsi covalentemente brevi estremità coesive di un dsDNA. Tuttavia, l&#39;efficienza legatura può essere influenzata da molti fattori che non sono legati a dsDNA loop come la struttura del DNA che circonda le estremità appiccicose uniti, e ligasi può anche influenzare il tasso looping apparente attraverso meccanismi quali il legame non specifico. Qui mostriamo come misurare dsDNA cinetica looping senza ligasi rilevando formazione transitoria ciclo DNA mediante FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). molecole di dsDNA sono costruiti utilizzando un protocollo basato su PCR semplice con un paio FRET e un linker biotina. La densità di probabilità loop noto come fattore J viene estratto dal prezzo loop e il tasso di ricottura tra due sezionatoreTed estremità appiccicose. Testando due dsDNAs con curvature diverse intrinseche, mostriamo che il fattore J è sensibile alla forma intrinseca del dsDNA.

Molecole di DNA utilizzati per lo studio loop consistono in una regione duplex di sequenza e lunghezza variabile e sporgenze a singolo filamento che sono complementari tra loro. Le sporgenze, che sono lunghe 7-base, possono ricombinarsi tra loro per acquisire lo stato in loop. Ogni sbalzo contiene sia Cy3 o Cy5 che è collegato nella spina dorsale del DNA attraverso la chimica amidite. Il Cy5-sporgenza è anche collegata con biotina-TEG (15-atomo Tetra-glicole etilenico distanziale) per l&#39;immobilizzazione di superfi...

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Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Questo studio presenta una procedura sperimentale dettagliato per misurare le dinamiche di loop di DNA a doppio filamento con singola molecola Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). Il protocollo descrive inoltre come estrarre il ciclo di densità di probabilità chiamato il fattore J.

Studiare Looping DNA a singola molecola FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

studying-dna-looping-by-single-molecule-fret

Research

JoVE Journal

Biology

15.3K Views.  Georgia Institute of Technology.  Questo studio presenta una procedura sperimentale dettagliato per misurare le dinamiche di loop di DNA a doppio filamento con singola molecola Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). Il protocollo descrive inoltre come estrarre il ciclo di densità di probabilità chiamato il fattore J. 

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A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, glass coverslips are functionalized in a one-step reaction with silane-PEG-biotin. Flow cells are constructed by sandwiching an adhesive tape with pre-cut channels between a functionalized coverslip and a PDMS slab containing inlet and outlet holes. Multiple channels are integrated into one flow cell and the flow of reagents into each channel can be fully automated, which significantly increases the assay throughput and reduces hands-on time per assay. Inside each channel, biotin-&#955;-DNAs are immobilized on the surface and a laminar flow is applied to flow-stretch the DNAs. The DNA molecules are stretched to &#62;80% of their contour length and serve as spatially extended templates for studying the binding and transport activity of fluorescently labeled molecules. The trajectories of single molecules are tracked by time-lapse Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) imaging. Raw images are analyzed using streamlined custom single particle tracking software to automatically identify trajectories of single molecules diffusing along DNA and estimate their 1D diffusion constants.

This protocol demonstrates a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying one-dimensional (1D) diffusion of molecules along DNA.

Una singola molecola semplice, robusta e alta velocità di trasmissione del flusso Stretching Assay implementazione per studiare il trasporto di molecole lungo DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Ricerca

Biochimica

Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. To investigate its mechanism, there are two essential technical requirements. First is single-nt resolution that can resolve normal translocation from frameshifting, during which the ribosome moves by other than 3 nt. The second is the capability to probe both the entrance and exit sides of mRNA in order to elucidate the whole picture of translocation. We report the dual DNA ruler assay that is based on the critical dissociation forces of DNA-mRNA duplexes, obtained by force-induced remnant magnetization spectroscopy (FIRMS).&#160; With 2-4 pN force resolution, the dual ruler assay is sufficient to distinguish different translocation steps. By implementing a long linker on the probing DNAs, they can reach the mRNA on the opposite side of the ribosome, so that the mRNA position can be determined for both sides. Therefore, the dual ruler assay is uniquely suited to investigate the ribosome translocation, and nucleic acid motion in general. We show representative results which indicated a looped mRNA conformation and resolved normal translocation from frameshifting.

Dual DNA ruler assay is developed to determine the mRNA position during ribosome translocation, which relies on the dissociation forces of the formed DNA-mRNA duplexes. With single-nucleotide resolution and capability of reaching both ends of mRNA, it can provide mechanistic insights for ribosome translocation and probe other nucleic acid displacements.

I governanti del DOPPIO DNA studiano il meccanismo della traslocazione del ribosoma con la risoluzione Single-Nucleotide

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. ...

R-Loop Analysis by Dot-Blot

The three-stranded nucleic acid structure, R-loop, is increasingly recognized for its role in gene regulation. Initially, R-loops were thought to be the by-products of transcription; but recent findings of fewer R-loops in diseased cells made it clear that R-loops have functional roles in a variety of human cells. Next, it is critical to understand the roles of R-loops and how cells balance their abundance. A challenge in the field is the quantitation of R-loops since much of the work relies on the S9.6 monoclonal antibody whose specificity for RNA-DNA hybrids has been questioned. Here, we use dot-blots with the S9.6 antibody to quantify R-loops and show the sensitivity and specificity of this assay with RNase H, RNase T1, and RNase III that cleave RNA-DNA hybrids, single-stranded RNA, and double-stranded RNA, respectively. This method is highly reproducible, uses general laboratory equipment and reagents, and provides results within two days. This assay can be used in research and clinical settings to quantify R-loops and assess the effect of mutations in genes such as senataxin on R-loop abundance.

This protocol details a simple method that quantifies R-loop, a three-stranded nucleic acid structure that comprises of an RNA-DNA hybrid and a displaced DNA strand.

The three-stranded nucleic acid structure, R-loop, is increasingly recognized for its role in gene regulation. Initially, R-loops were thought to be the ...

Genetica

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Visualizzazione singola molecola di DNA replica con microscopia a fluorescenza

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Biologia

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for hundreds of individual restriction endonuclease (REase) molecules in one experiment. This assay does not require protein labeling and can be carried out with a single imaging channel. In addition, the results of multiple individual experiments can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions. Analysis of the resulting dwell-time distributions can help elucidate the DNA cleavage mechanism by revealing the presence of kinetic steps that cannot be directly observed. Example data collected using this assay with the well-studied REase, EcoRV - a dimeric Type IIP restriction endonuclease that cleaves the palindromic sequence GAT&#8595;ATC (where &#8595; is the cut site) - are in agreement with prior studies. These results suggest that there are at least three steps in the pathway to DNA cleavage that is initiated by introducing magnesium after EcoRV binds DNA in its absence, with an average rate of 0.17 s-1 for each step.

Using quantum-dot-labeled DNA and total internal reflection fluorescence microscopy, we can investigate the reaction mechanism of restriction endonucleases while using unlabeled protein. This single-molecule technique allows for massively multiplexed observation of individual protein-DNA interactions, and data can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions.

Analisi del tempo di permanenza di una singola molecola della scissione del DNA mediata da endonucleasi di restrizione

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

Osservazione diretta del DNA Enzimi Replica utilizzando un singolo-molecola di DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 (FET) family of fusion oncoproteins, is one of the most frequently involved fusion genes in Ewing sarcoma. These FET family fusion proteins typically harbor a low-complexity domain (LCD) of FET protein at their N-terminus and a DNA-binding domain (DBD) at their C-terminus. EWS-FLI1 has been confirmed to form biomolecular condensates at its target binding loci due to LCD-LCD and LCD-DBD interactions, and these condensates can recruit RNA polymerase II to enhance gene transcription. However, how these condensates are assembled at their binding sites remains unclear. Recently, a single-molecule biophysics method-DNA Curtains-was applied to visualize these assembling processes of EWS-FLI1 condensates. Here, the detailed experimental protocol and data analysis approaches are discussed for the application of DNA Curtains in studying the biomolecular condensates assembling on target DNA.

Here, we describe the use of the single-molecule imaging method, DNA Curtains, to study the biophysical mechanism of EWS-FLI1 condensates assembling on DNA.

Imaging a singola molecola dell'assemblaggio di condensati EWS-FLI1 sul DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

<meta charset="utf8"></head><body>Ricostituzione nucleosomiale in situ per studi su singole molecole

In Situ Nucleosome Assembly for Single-Molecule Correlative Force and Fluorescence Microscopy

Nucleosomes constitute the primary unit of eukaryotic chromatin and have been the focus of numerous informative single-molecule investigations regarding their biophysical properties and interactions with chromatin-binding proteins. Nucleosome reconstitution on DNA for these studies typically involves a salt dialysis procedure that provides precise control over the placement and number of nucleosomes formed along a DNA tether. However, this protocol is time-consuming and requires a substantial amount of DNA and histone octamers as inputs. To offer an alternative strategy, an in situ nucleosome reconstitution method for single-molecule force and fluorescence microscopy that utilizes the histone chaperone Nap1 is described. This method enables users to assemble nucleosomes on any DNA template without the need for strong nucleosome positioning sequences, adjust nucleosome density on demand, and use fewer reagents. In situ nucleosome formation occurs within seconds, offering a simpler experimental workflow and a convenient transition into single-molecule measurements. Examples of two downstream assays for probing nucleosome mechanics and visualizing the behavior of individual proteins on chromatin are further described.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Ricostituzione efficiente dei nucleosomi per tecniche a singola molecola

This article presents a detailed experimental procedure for reconstituting nucleosome-containing DNA tethers for single-molecule correlative force and fluorescence microscopy. It further describes several downstream experiments that can be conducted to visualize the binding behavior of chromatin-interacting proteins and analyze changes in the physical properties of nucleosomes.

Assemblaggio di nucleosomi in situ per la microscopia a forza correlativa e fluorescenza a singola molecola

Nucleosomes constitute the primary unit of eukaryotic chromatin and have been the focus of numerous informative single-molecule investigations regarding ...

Studiare Looping DNA a singola molecola FRET

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Una singola molecola semplice, robusta e alta velocità di trasmissione del flusso Stretching Assay implementazione per studiare il trasporto di molecole lungo DNA

I governanti del DOPPIO DNA studiano il meccanismo della traslocazione del ribosoma con la risoluzione Single-Nucleotide

R-Loop Analysis by Dot-Blot

Visualizzazione singola molecola di DNA replica con microscopia a fluorescenza

Analisi del tempo di permanenza di una singola molecola della scissione del DNA mediata da endonucleasi di restrizione

Osservazione diretta del DNA Enzimi Replica utilizzando un singolo-molecola di DNA Stretching Assay

Imaging a singola molecola dell'assemblaggio di condensati EWS-FLI1 sul DNA

Assemblaggio di nucleosomi in situ per la microscopia a forza correlativa e fluorescenza a singola molecola

Assemblaggio di nucleosomi in situ per la microscopia a forza correlativa e fluorescenza a singola molecola

Assemblaggio di nucleosomi in situ per la microscopia a forza correlativa e fluorescenza a singola molecola