Este trabajo fue apoyado por la Miocardiopatía la Fundación del Niño (SDG2462390204001) American Heart Association y, y los Institutos Nacionales de Salud (HL114669). CM es un beneficiario de una beca de investigación postdoctoral concedida por la Fundación La miocarditis, NJ.

Declaración de Ética: Todos los procedimientos con animales se realizaron de conformidad con las directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y aprobados por la Universidad de Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE. 1. Inducción de la EAE <ol><li> Para inducir la EAE, preparar la emulsión péptido / adyuvante completo de Freund (CFA) como se describe en 11 con las siguientes modificaciones: Paso 1.1:. Preparar PLP139b151 a una concentración de 1 mg / ml en 1x tampón fosfato salino (PBS) Paso 1.4:. utilizar 200 l de CFA de emulsión que contiene 100 g de PLP139b151 por animal Paso 1.4.1: para inmunizar a diez animales, preparar 2 ml de emulsión mediante la mezcla de 1 ml de PLP139b151 (1 mg / ml en 1x . de PBS) y un volumen igual de CFA Paso 1.5: inyectar 200 l de emulsión en dosis divididas por vía subcutánea en las dos regiones inguinales (~ 75 l cada uno) y región esternal (~ 50 l) de cinco a seis semanas de edad femalos ratones le SJL / J. Los pasos 1.7 y 1.8 no son aplicables para la inducción de la EAE. </li></ol> 2. Puntuación clínica de ratones con EAE y recolección de cerebros <ol><li> Monitorear los animales para la aparición de signos clínicos, y la puntuación de la enfermedad-la gravedad todos los días de 9 días después de la vacunación de la siguiente manera: 0 - saludable; 1 - cojera cola o posterior debilidad de las extremidades, pero no tanto; 2 - cojera cola y posterior debilidad de las extremidades; 3 - parálisis parcial de las extremidades posteriores; 4 - parálisis completa de las extremidades posteriores; 5 - moribundos o muertos 12. </li><li> La eutanasia a los ratones cuando alcanzan una puntuación neurológica de 3 o 4 utilizando CO 2. Para practicar la eutanasia a los ratones, pre-llenar la cámara de eutanasia primero con CO 2 girando el regulador del tanque de CO 2 no superior a 6 psi y permitir que los animales se queden dentro de la cámara durante aproximadamente 5 minutos para lograr la asfixia completa. Remojar los animales sacrificados en el 70% de alcohol. Inmediatamente, colocar los animales en una almohadilla absorbente y el uso de un par de estéril paraceps y tijeras exponen los corazones por el corte a través de la cavidad torácica. Perforar las aurículas derecha e perfundir inyectando 10 ml de frío 1 × PBS en los ventrículos izquierdos de los corazones. </li><li> Excavar el cráneo al cortar el cráneo en forma circular con un par de tijeras curvas, y con cuidado, voltear los huesos del cráneo con unas pinzas. Se recoge el cerebro mediante disección roma y el uso de un bisturí limpio, cerebro separado del cerebelo. Coloque el cerebro en un tubo que contiene el frío 1 × PBS y dejar el tubo en hielo hasta su procesamiento. </li></ol> 3. In Situ La tinción de secciones cerebrales con MHC de clase II (IA s) / PLP139b151 Dextramers <ol><li> Preparar 4% tamponada con PBS bajo punto de fusión de agarosa, se funden por calentamiento a 50 ° C y se deja en un 40 ° C baño de agua hasta su uso. </li><li> Coloque el cerebro en un cassette histología molde de base profunda desechable mantuvieron sobre hielo y vierta fundido (40 ° C) de agarosa. Inmediatamente, presione suavemente el cerebrocon unas pinzas para sumergir el tejido. Deje el cartucho en hielo durante 15-20 minutos hasta que la solidificación es completa. </li><li> Llene la bañera con vibratome refrigerada 1x PBS. Llenar el espacio alrededor de vibratome baño con cubitos de hielo para mantener la temperatura de PBS entre 0 y 2 ° C. Fijar una hoja de afeitar limpia en el vibratome y ajuste el ángulo de la hoja a 15 °. </li><li> Colocación del tejido en vibratome. Recorte el exceso de agarosa de todos los lados del tejido incrustado y exponer ligeramente la superficie ventral del cerebro. <ol><li> Unte vibratome bloque de tejido con pegamento y transferir el tejido e inmovilizado sobre la superficie encolada mediante la colocación de la superficie ventral expuesta del cerebro sobre el pegamento para la sección transversal. No mueva el tejido, una vez que el tejido se fija sobre el bloque. </li><li> Coloque el bloque vibratome que contiene el tejido agarosa incrustados en el hielo, y permitir que el pegamento se seque durante 15 minutos. </li></ol></li><li> Mientras tanto, coloque la cámara de tejidoBers uno por pocillo de una placa de 24 pocillos. Llenar los pocillos que contienen las cámaras de tejido con 1 ml de PBS 1x frío, y dejar la placa en hielo. <ol><li> Preparar las cámaras de tejido uniendo una fina malla de nylon para el corte final de una pipeta de 25 ml de polipropileno utilizando pegamento; después de recortar el exceso de malla alrededor de la pipeta, cortar la pipeta a una longitud de 1 cm de la malla. </li></ol></li><li> Bajar la hoja vibrátomo al nivel de la superficie superior del tejido; establecer la velocidad vibratome a 0,22 mm / seg y empezar a cortar con un movimiento hacia adelante para hacer 200 micras de espesor secciones. Transferir una sección cerebral por pocillo usando un cepillo suave acuarela en las cámaras de tejidos colocados dentro de los pocillos de una placa de 24 pocillos. Guarde la placa de hielo hasta el seccionamiento es completo para evitar la degradación de los tejidos. Nota: Siga estos pasos para obtener en tres secciones, el total de pares de tres regiones diferentes del cerebro dorsal a la superficie ventral (Figura 2). Una sección decada par (en total tres secciones) colocados en tres cámaras de tejido individuales se designan para la tinción con dextramers específicos (IA s / PLP 139-151) y anti-CD4. Del mismo modo, otro grupo de tres secciones que se colocan en tres cámaras de tejido individuales se designan para la tinción con dextramers control (IA s / TMEV 70-86) y anti-CD4. </li><li> Transferencia de las tres cámaras de tejido que contienen las secciones designadas para la tinción con dextramers específicos en tres pozos en una placa de 24 pocillos con una cámara por pocillo en el que, 300 l de un cóctel que contiene aloficocianina (APC)-conjugados PLP139b151 dextramers (2,5 g / ml) y anti-CD4-ficoeritrina (PE; se añadió previamente 5 g / ml) en solución de bloqueo (1x PBS con 2% de suero normal de cabra). Cubrir los pocillos con una tapa. </li><li> Del mismo modo, transferir las tres cámaras de tejido que contienen las secciones designadas para la tinción con dextramers de control en tres pozos en una placa de 24 pocillos con una cámara por nosotrosll en el cual, se añadió previamente 300 l de un cóctel que contiene TMEV APC-conjugado 70-86 dextramers (2,5 mg / ml) y anti-CD4-PE (5 mg / ml) en solución de bloqueo. Cubrir los pocillos con una tapa. Nota: Consulte Massilamany et al 8, para la preparación de dextramers, y las moléculas de dextrano para preparar dextramers fueron amablemente proporcionados por Immudex, Copenhague, Dinamarca.. </li><li> Etiquetar los pozos, y envolver el plato con papel de aluminio y coloque la placa en una plataforma oscilante fijado a las rotaciones suaves durante 1,5 horas en la oscuridad a temperatura ambiente. </li><li> Después del período de incubación, lavar las secciones de tejido en la plataforma oscilante, mediante la transferencia de las cámaras de tejido a un nuevo pocillo que contenía 1 ml de PBS 1x frío, y evitar el goteo los contenidos de un pocillo en el otro. Repita el lavado tres veces, dejando al menos 10 min por lavado. Asegúrese de que las secciones de tejido no se les secan, ya que pueden pegarse a las paredes de la cámara. </li><li> Fijar las secciones mediante la transferencia de la cámara de tejidobros en un pozo fresco en placa de 24 pocillos que contenía 1 ml de filtrada paraformaldehído al 4% tamponada con PBS (pH 7,4) en una plataforma de agitación durante 2 horas con rotaciones suaves. </li><li> Repita el lavado tres veces como se describe en el paso 3.10. </li><li> Coloque las secciones teñidas y fijadas en un portaobjetos limpio con un cepillo suave acuarela. Limpie el exceso de agua sin tocar la sección, y montar la sección utilizando medio de montaje. Cubra con el cubreobjetos microscópica y deje que los portaobjetos se sequen a TA O / N en el cuarto oscuro. </li><li> Almacenar los portaobjetos en una caja de almacenamiento de diapositivas a prueba de luz a 4 ° C. </li></ol> 4. Inducción de EAM y Colección de corazones <ol><li> Inducir EAM como se describe en la referencia 11. </li><li> La eutanasia a los ratones en el día 21 después de la vacunación utilizando la cámara limpia equipado con CO 2 cilindro de gas, y disfrutar de los animales en el 70% de alcohol. Inmediatamente, colocar los animales en una almohadilla absorbente y utilizando un par de pinzas y tijeras exponer el corazóns cortando a través de la cavidad torácica. Perforar las aurículas derecha e perfundir inyectando 10 ml de frío 1 × PBS en los ventrículos izquierdos de los corazones. Recoge los corazones y lugar en tubos que contienen frío 1 × PBS. </li></ol> 5. In Situ La tinción de las secciones de corazón con MHC de clase II (IA k) / MyHC 334-352 Dextramers <ol><li> Preparar 4% PBS-tampón bajo punto de fusión de agarosa, se funden por calentamiento a 50 ° C y se deja en un 40 &#160; ° C baño de agua hasta su uso. </li><li> Coloque el corazón en un casete desechable profunda histología molde de base se mantuvo en hielo, y se vierte fundida 40 ° C agarosa hasta que los tejidos estén completamente sumergidos como se describe en el paso 3.2. </li><li> Siga el paso 3.3. </li><li> Recorte el exceso de agarosa de todos los lados del tejido incrustado y exponer ligeramente la base del corazón. Frotis de vibratome bloque de tejido con pegamento y transferir el tejido de agarosa-incrustado sobre la superficie pegada, mediante la colocación de la superficie expuesta de lacorazón sobre el pegamento. No mueva el tejido, una vez que el tejido se fija sobre el bloque. <ol><li> Coloque el bloque vibratome que contiene el tejido agarosa incrustados en el hielo, y permitir que el pegamento se seque durante 15 minutos. </li></ol></li><li> Siga los pasos 3.5 y 3.6. </li><li> Transferir las secciones del corazón usando un cepillo suave acuarela en las cámaras de tejidos colocados dentro de los pocillos de una placa de 24 pocillos. Mantener la placa en hielo hasta el seccionamiento es completa para prevenir la degradación del tejido. Nota: Siga estos pasos para obtener en total, ocho secciones emparejadas desde el vértice hasta la base del corazón (Figura 2). Coloque todas las secciones de cámaras de tejido, la asignación de hasta 3 secciones por cámara. Una sección de cada par (un total de ocho secciones) se designa para la tinción con dextramers específicos (IA K / MyHC 334 a 352) y anti-CD4. Del mismo modo, otro conjunto de ocho secciones se designa para la tinción con dextramers control (IA k / RNasa 43-56) y anti-CD4. </li><li> Transferir eltres cámaras de tejido que contienen las secciones designadas para la tinción con dextramers específicos en tres pozos en una placa de 24 pocillos con una cámara por pocillo en el que, 300 l de un cóctel que contiene APC-conjugados MyHC 334-352 dextramers (2,5 g / ml) y anti-CD4-PE (5 g / ml) en solución de bloqueo se añadió previamente. Cubrir los pocillos con una tapa. <ol><li> Del mismo modo, transferir las tres cámaras de tejido que contienen las secciones designadas para la tinción con dextramers de control en tres pozos en una placa de 24 pocillos con una cámara por pocillo en el que, 300 l de un cóctel que contiene RNasa APC-conjugado 43-56 dextramers (2,5 microgramos / ml) y anti-CD4-PE (5 g / ml) en solución de bloqueo se añadió previamente. Cubrir los pocillos con una tapa. </li></ol></li><li> Etiquetar los pozos, y envolver el plato con papel de aluminio y coloque la placa en una plataforma oscilante fijado a las rotaciones suaves durante 1,5 horas en la oscuridad a temperatura ambiente. </li><li> Siga los pasos, 3.10 a 3.11 </li><li> THR lavado Repitahielo, como se describe en el paso 3.10. </li><li> Coloque las secciones teñidas y fijos (hasta tres secciones / diapositivas) en un portaobjetos de microscopio limpio con un cepillo suave acuarela. Limpie el exceso de agua sin tocar las secciones, y montar las secciones utilizando medio de montaje. Cubra con el cubreobjetos microscópica y deje que los portaobjetos se sequen a TA O / N en el cuarto oscuro. </li><li> Almacenar los portaobjetos en una caja de almacenamiento de diapositivas a prueba de luz a las 4 ° C. </li></ol> 6. Análisis de Dextramer + (Dext +) las células T CD4 + por láser confocal de barrido microscopio (LSCM) (común a las dos secciones del cerebro y del corazón) <ol><li> Utilice Nikon A1-Eclipse sistema de microscopía confocal 90i para el escaneo de rutina y adquisición de imágenes. Para iniciar haga clic en Abrir, el software NIS Elementos AR (versión 4.13). <ol><li> Elija &quot;TRITC&quot; y canales &quot;Cy5&quot; del panel. Las longitudes de onda de excitación / emisión, respectivamente, para los canales de TRITC y Cy5, 561,5 nm / 553-618 nm y 640,7 nm / 663-738 nm aparece de forma predeterminada. </li><li> Asigne la pseudocolors &quot;verde&quot; y &quot;rojo&quot; para el TRITC (CD4-PE) y Cy5 (dextramer-APC) canales, respectivamente. </li><li> Coloque la diapositiva para ser examinado en la fase microscópica y enfoque manualmente bajo un aumento de 100X. Ajuste el &quot;HV&quot; para 110 y compensar a &quot;0&quot;. Haga clic en &quot;Focus&quot; y ajuste el &quot;voltaje&quot; para optimizar los lasers. </li><li> Haga clic en &quot;Focus&quot;; escanear la sección de arriba a abajo, y ajuste el nivel &#39;Z&#39; para la adquisición de imágenes. Haga clic en &quot;serie CH&quot; y adquirir la secuencia de imágenes. Identificar Dext + células T CD4 + que aparece como células puntiformes de color amarillo sobre la base de co-localización de las señales generadas a partir de tanto los canales rojo (dextramers) y verde (CD4). </li></ol></li><li> Utilice Olympus FV500-BX60 microscopio confocal para la enumeración cuantitativa fácil de las células T CD4 + + DEXT. Para empezarhaga clic en abierto, el software Fluoview (versión 4.3). <ol><li> Seleccione el tintes &quot;Cy3&quot; y &quot;Cy5&quot; en el menú desplegable, y haga clic en &quot;Aplicar&quot; para cargar los respectivos láseres. Nota: las longitudes de onda de excitación / emisión para Cy3 (543 nm / pseudocoloreada &quot;verde&quot;; CD4-PE); canales y Cy5 (dextramer-APC 633 nm / pseudocoloreada &quot;rojo&quot;). </li><li> Coloque la diapositiva para ser examinado en el portaobjetos de microscopio y se enfoque de forma manual a baja magnificación (4X o 10X). Haga clic en &quot;Focus&quot;, mientras que el láser Cy3 está encendido, y se centran el foco inflamatorio. </li><li> Cambie el objetivo de un aumento de 100X. Ajuste el tamaño del archivo a &quot;512/512&quot; en el menú desplegable. Haga clic en &quot;Focus&quot; y ajuste los valores para &quot;PMT&quot;, &quot;ganancia&quot; y &quot;Offset&quot; parámetros para optimizar los láseres por separado para Cy3 y Cy5. </li><li> Haga clic en &quot;fase Z&quot; y luego haga clic en &quot;Focus&quot;, mientras tanto los láseres están encendidas. Conjuntoel espesor de la &quot;etapa Z&quot; haciendo clic en las flechas &quot;abajo&quot; &quot;arriba&quot; y. Establezca el intervalo de &quot;Z&quot; a 2 micras. </li><li> Haga clic en &quot;Stop&quot;, y seleccione &quot;Seq123&quot;. A continuación, haga clic en &quot;XYZ&quot; y comenzar la adquisición de imágenes de la serie &quot;Z&quot; para el área seleccionada en el foco inflamatorio. Guarde los &quot;Z imágenes en serie&quot; como archivos AVI. Para guardar archivos de imágenes, seleccione la imagen de la &quot;Z imagen de serie&quot;, y luego guardarlo en formato &quot;tiff&quot;. </li></ol></li><li> Examine tres secciones emparejadas del cerebro donde se tiñó de un conjunto de tres secciones con IA s / PLP139b151 dextramers/anti-CD4 y el otro conjunto de tres secciones con IA s / TMEV 70-86 dextramers/anti-CD4 realizar análisis cuantitativo. <ol><li> Del mismo modo, analizar ocho secciones emparejadas para el corazón, en el cual, un conjunto de ocho secciones se tiñeron con IA k / MyHC 334-352 dextramers/anti-CD4 y otro sít de ocho secciones con RNasa 43-56 dextramers/anti-CD4. </li></ol></li><li> Examine 10 a 15 focos inflamatorios por sección en cerebro, y en cada foco, adquirir un conjunto de 15 a 25 imágenes en serie secuencialmente. <ol><li> Examine un total de 20 focos inflamatorios de todas las ocho secciones de corazón y de cada foco adquirir de 10 a 15 imágenes en serie secuencialmente. Tome los &#39;Z&#39; imágenes en serie mediante el escaneo de las diapositivas en un movimiento &quot;horizontal-vertical-up horizontal-vertical hacia abajo&quot; de manera que se evite la repetición de la serie &#39;Z&#39; dentro del mismo enfoque. </li><li> Una vez que las imágenes de serie &#39;Z&#39; son capturados, el nombre de los archivos mediante la identificación de los números de diapositiva, el nombre de las secciones y el número de los &#39;Z&#39; imágenes seriadas tomadas. <ol><li> Utilice el software &#39;ImageJ&#39; para contar las células T CD4 + + DEXT en relación con el número total de células T CD4 +. Seleccione la opción &quot;tipo de contador &#39;en&#39; ImageJ, comprobar y# 8216; mostrar todos &#39;y empezar a contar haciendo clic en el centro de cada célula y seguir contando en diferentes&#39; Z &#39;imágenes en serie utilizando las flechas laterales. Después de contar a todas las células T CD4, elige otro tipo de contador y contar el + en las células T CD4 + Dext. Haga clic en la ficha de resultados para obtener el número total de células contadas con los dos contadores diferentes. </li><li> Para obtener el número total, agregue el número de células en todos los &#39;Z&#39; imágenes en serie que representan a todas las tres secciones cerebrales o las ocho secciones del corazón. </li></ol></li></ol></li></ol>

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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+human+epitope-specific+T+cells+identified+by+class+II+tetramers+reside+within+a+CD4high,+proliferating+subset.">Activated human epitope-specific T cells identified by class II tetramers reside within a CD4high, proliferating subset.</a> Int Immunol. 13 (6), 799-806 (2001).</li><li>Reddy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+autoreactive+myelin+proteolipid+protein+139-151-specific+T+cells+by+using+MHC+II+(IAs)+tetramers.">Detection of autoreactive myelin proteolipid protein 139-151-specific T cells by using MHC II (IAs) tetramers.</a> J Immunol. 170 (2), 870-877 (2003).</li><li>Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+In+situ+tetramer+staining+of+antigen-specific+T+cells+in+tissues.">Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues.</a> J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).</li><li>Skinner, P. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+tetramer+staining.">In situ tetramer staining.</a> J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).</li><li>Skinner, P. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+staining+using+MHC+class+I+tetramers.">In situ staining using MHC class I tetramers.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 17, Unit 17.14.11 (2004).</li></ol>

Se declararon no tener conflictos de intereses.

A diferencia de tetrámeros de MHC de clase I, el uso de MHC de clase II tetrámeros para aplicaciones de rutina sigue siendo un reto, especialmente para enumerar las frecuencias precursoras de baja afinidad autorreactivos células T CD4, debido en parte a su dependencia de activación 6,15-17. Recientemente, este problema se evitó mediante la creación de la próxima generación de tetrámeros, llamado &quot;dextramers,&quot; que nos permite detectar células T CD4 específicas de antígeno para un número ...

El uso de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase II tetrámeros para la detección de las células CD4 T específicas de antígeno ha sido un reto 1-7. Para aumentar la sensibilidad de detección de MHC de clase II tetrámeros, el equipo de investigación ha creado tetrámeros de próxima generación, denominados &quot;dextramers&quot; 8. Dextramers contienen cadenas principales de dextrano en el que se conjugan múltiples restos de estreptavidina-fluoróforo, de manera que varios monómeros, MHC-péptido biotinilados atado se pueden unir a una molécula de dextrano 9. Por lo tanto, grandes agregados de dextramers MHC que contienen varios complejos de MHC-péptido pueden interactuar con múltiples receptores de células T (TCR). Este grupo recientemente generada dextramers para diversos antígenos propios y demostró que la sensibilidad de detección de dextramers fue aproximadamente cinco veces más que los tetrámeros 8. Los sistemas experimentales incluyen encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) inducida con proteína proteolípido (PLP) 139-151 en ratones SJL; EAE inducida con glicoproteína de mielina de oligodendrocitos (MOG) 35-55 en ratones C57BL / 6; y miocarditis autoinmune experimental (EAM) inducida con miosina cardíaca cadena pesada-α (MyHC) 334-352 en ratones A / J. Este estudio demuestra el uso de PLP139b151 - y MyHC 334-352 dextramers para detectar células T CD4 específicas de antígeno in situ con especificidad por el desarrollo de un protocolo de tinción directa, eliminando así la necesidad de amplificar las señales del uso de anticuerpos de fluoróforo, una enfoque empleado comúnmente con el uso de tetrámeros. Además, un método integral de evaluación de los tejidos también se ha ideado para enumerar de forma fiable las frecuencias de células T CD4 específicas de antígeno in situ 10. La detección de células T específicas de antígeno in situ permite la delineación de eventos causados ​​por estímulos antigénicos específicos de las causadas por la activación espectador. Del mismo modo, la técnica de in situ en también providES oportunidades para realizar un seguimiento de la cinética de infiltraciones de células T específicas de antígeno en los órganos diana.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:619px;">CFA</td>
			<td style="width:364px;">Sigma Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td style="width:219px;">5881</td>
			<td style="width:167px;">Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MTB&#160; H37Rv extract&#160;</td>
			<td>Difco Laboratories, Detroit, MI</td>
			<td>231141</td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">PT</td>
			<td>List Biologicals Laboratories, Campbell, CA</td>
			<td>181</td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">1x PBS&#160;</td>
			<td>Corning, Manassas, VA</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Female A/J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME</td>
			<td>646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Female SJL/J mice</td>
			<td>Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME</td>
			<td>686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leur-lok sterile 1 ml syrringe</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leur-lok sterile 3 ml syrringe</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile needle, 18 G</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile needle, 27 1/2 G</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-way stopcock&#160;</td>
			<td>Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH</td>
			<td>MX5311L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kerlix gauze bandage rolls&#160;</td>
			<td>Covidien, Mansfield, MA</td>
			<td>6720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade</td>
			<td>Promega corporation, Madison, WI</td>
			<td style="width:219px;">V2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Immunopure normal goat serum</td>
			<td>Thermo Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:219px;">31873</td>
			<td>Store at -20 &#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Anti-mouse CD4 conjugated with PE dye</td>
			<td style="width:364px;">eBioscience, San Diego, CA&#160;</td>
			<td style="width:219px;">12004185</td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA</td>
			<td style="width:219px;">19202</td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Faramount Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Dako, Carpinteria, CA</td>
			<td style="width:219px;">10073021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Conical tube (15ml)</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td style="width:219px;">352099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Conical tube (50 ml)</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td style="width:219px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well flat bottomed tissue culture plates</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td>356775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water color #2 brushes</td>
			<td>Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY</td>
			<td style="width:219px;">73502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plain Microscope slides, size: 3&#34; x 1&#34; x 1.2 mm</td>
			<td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:219px;">1255010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Premium Cover glass, 22 x 22-1</td>
			<td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:219px;">12548B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable deep base mold histology cassettes</td>
			<td>Laboratory prodcust, Rochester, NY</td>
			<td style="width:219px;">M-475-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Loctite Super glue</td>
			<td>Henkel Corporation, Westlake, OH</td>
			<td style="width:219px;">1471879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Razor blades</td>
			<td>Gillette SuperSilver</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK)</td>
			<td style="width:364px;">Neopeptide, Cambridge, MA</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF)</td>
			<td style="width:364px;">Neopeptide, Cambridge, MA</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MHC class II/IAs PLP 139-151 or TMEV 70-86 dextramers conjugated with APC dye</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MHC class II/IAk Myhc 334-352 or&#160; or RNase 40-56 dextramers conjugated with APC dye</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Dextran conjugated SA-APC</td>
			<td>&#160;Immundex, Copenhagen, Demark</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile surgical scissors and forceps</td>
			<td style="width:364px;">INOX tool Corporation</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro oven</td>
			<td style="width:364px;">GE Healthcare, Pittsuburgh, PA</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leica VT 1200 Vibratome</td>
			<td>Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus BX 60&#160; Laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Olympus America, Inc. Center Valley, PA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon A1-Eclipse 90i confocal microscope</td>
			<td>Nikon Inc. Melville, NY</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ detection of autoreactive cd4 t cells in brain and heart using major histocompatibility complex class ii dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-&#945; (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler&#8217;s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the &#8216;Z&#8217; serial images.

En este informe, la detección in situ de antígeno-específica, autoreactive células T CD4 por tinción directa con MHC de clase II dextramers se describe. Secciones cerebrales Corte recientemente se obtuvieron a partir de ratones con EAE y se tiñeron con cócteles que contienen PLP139b151 (control) dextramers y anti-CD4 (específica) o TMEV 70-86. Los paneles superiores de la Figura 1 muestra el análisis de secciones cerebrales LSCM costained con PLP 139-151 dextramers (rojo) y de...

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In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

El protocolo para detectar células autorreactivas T CD4 en el cerebro y el corazón mediante tinción directa con complejo mayor de histocompatibilidad de clase II dextramers se ha descrito en el presente informe. Para el análisis integral, un método fiable para enumerar las frecuencias de células T CD4 + específicas de antígeno in situ también se ideó.

La detección in situ de las células T CD4 Autoreactive en Cerebro y Corazón Uso Mayor de Histocompatibilidad clase II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

in-situ-detection-autoreactive-cd4-t-cells-brain-heart-using-major

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

11.6K vistas.  University of Nebraska, Lincoln.  El protocolo para detectar células autorreactivas T CD4 en el cerebro y el corazón mediante tinción directa con complejo mayor de histocompatibilidad de clase II dextramers se ha descrito en el presente informe. Para el análisis integral, un método fiable para enumerar las frecuencias de células T CD4 + específicas de antígeno in situ también se ideó. 

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Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Transducción retroviral de receptores de células T en ratones las células T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Investigación

Inmunología e Infección

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of human Type 1 diabetes (T1D). Cell transfer studies in irradiated recipient mice have established that T cells are pivotal in T1D pathogenesis in this model. We describe herein a simple method to rapidly induce T1D by adoptive transfer of purified, primary CD4+ T cells from pre-diabetic NOD mice transgenic for the islet-specific T cell receptor (TCR) BDC2.5 into NOD.SCID recipient mice. The major advantages of this technique are that isolation and adoptive transfer of diabetogenic T cells can be completed within the same day, irradiation of the recipients is not required, and a high incidence of T1D is elicited within 2 weeks after T cell transfer. Thus, studies of pathogenesis and therapeutic interventions in T1D can proceed at a faster rate than with methods that rely on heterogenous T cell populations or clones derived from diabetic NOD mice.

We provide a reproducible method to induce type 1 diabetes (T1D) in mice within two weeks by the adoptive transfer of islet antigen-specific, primary CD4+ T cells.

Tipo 1 Diabetes inducción acelerada en ratones por transferencia adoptiva de células CD4 + células T diabetogénico

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

La inducción de la inflamación intestinal murino por transferencia adoptiva de Efector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alta</sup&gt; T células en ratones inmunodeficientes

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&amp;#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Ratón Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Aislamiento de células T y<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciación en subconjuntos de células T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

&lt;em&gt;In Vitro&lt;/em&gt; Differentiation of Human CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;FOXP3&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&amp;#239;ve CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T Cells Using a TGF-&amp;#946;-containing Protocol

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

Diferenciación in vitro de las células CD4 + humano FOXP3 + células T reguladoras (Induced iTregs) de T naive CD4 + células utilizando un protocolo de TGF-β que contienen

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The development of stable, non-toxic, fluorescent dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) allows for rare, antigen-specific T cells to be distinguished from bystanders by diminution in fluorescent staining, as detected by flow cytometry. This method has the following advantages over alternative approaches: (i) it is very sensitive to low-frequency T cells, (ii) no knowledge of the antigen or epitope is required, (iii) the phenotype of the responding cells can be analyzed, and (iv) viable, responding cells can be sorted and used for further analysis, such as T cell cloning.

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Presented here is a protocol for measuring proliferating CD4+ T cells in response to antigenic proteins or peptides using dye dilution. This assay is particularly sensitive to rare antigen-specific T cells and can be modified to facilitate cloning of antigen-specific cells.

Cuantificación de células CD4+ T específicas de antígenos humanos que utilizan éster de succinidilo de carboxifluoresceína

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear ...

Assessing the Expression of Major Histocompatibility Complex Class I on Primary Murine Hippocampal Neurons by Flow Cytometry

Increasing evidence supports the hypothesis that neuro-immune interactions impact nervous system function in both homeostatic and pathologic conditions. A well-studied function of major histocompatibility complex class I (MHCI) is the presentation of cell-derived peptides to the adaptive immune system, particularly in response to infection. More recently it has been shown that the expression of MHCI molecules on neurons can modulate activity-dependent changes in the synaptic connectivity during normal development and neurologic disorders. The importance of these functions to the brain health supports the need for a sensitive assay that readily detects MHCI expression on neurons. Here we describe a method for primary culture of murine hippocampal neurons and then assessment of MHCI expression by flow cytometric analysis. Murine hippocampus is microdissected from prenatal mouse pups at the embryonic day 18. Tissue is dissociated into a single cell suspension using enzymatic and mechanical techniques, then cultured in a serum-free media that limits growth of non-neuronal cells. After 7 days in vitro, MHCI expression is stimulated by treating cultured cells pharmacologically with beta interferon. MHCI molecules are labeled in situ with a fluorescently tagged antibody, then cells are non-enzymatically dissociated into a single cell suspension. To confirm the neuronal identity, cells are fixed with paraformaldehyde, permeabilized, and labeled with a fluorescently tagged antibody that recognizes neuronal nuclear antigen NeuN. MHCI expression is then quantified on neurons by flow cytometric analysis. Neuronal cultures can easily be manipulated by either genetic modifications or pharmacologic interventions to test specific hypotheses. With slight modifications, these methods can be used to culture other neuronal populations or to assess expression of other proteins of interest.

This protocol describes a method for culturing primary hippocampal neurons from embryonic mouse brain. The expression of major histocompatibility complex class I on the extracellular surface of cultured neurons is then assessed by flow cytometric analysis.

Evaluación De La Expresión Del Complejo De Histocompatibilidad Mayor Clase I En Las Neuronas Primarias Murinas Del Hipocampo Por Citometría De Flujo

Increasing evidence supports the hypothesis that neuro-immune interactions impact nervous system function in both homeostatic and pathologic conditions. A ...

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous &beta;2-Microglobulin

The major histocompatibility complex (MHC) plays a pivotal role in antigen peptide presentation and T cell immune responses against infectious disease and tumor development. The hybrid MHC I complexed with heterologous &#946;2-microglobulin (&#946;2m) substitution from different species can be stabilized in vitro. This is a feasible means to study MHC I of mammals, when the homologous &#946;2m is not available. Meanwhile, it is indicated that mammalian &#946;2m substitution does not significantly affect peptide presentation. However, there is limited summarization regarding the methodology and the technology for the hybrid MHC I complexed with heterologous &#946;2-microglobulin (&#946;2m). Herein, methods to evaluate the feasibility of heterologous &#946;2m substitution in MHC I study are presented. These methods include preparation of expression constructs; purification of inclusion bodies and refolding of the MHC complex; determination of protein thermostability; crystal screening and structure determination. This study provides a recommendation for understanding function and structure of MHC I, and is also significant for T cell response evaluation during infectious disease and tumor immunotherapy.

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous &amp;#946;2-Microglobulin

The protocol describes experimental methods to obtain stable major histocompatibility complex (MHC) class I through potential &#946;2-microglobulin (&#946;2m) substitutions from different species. The structural comparison of MHC I stabilized by homologous and heterologous &#946;2m were investigated.

Estabilidad y estructura de Murciélago Mayor Histocompatibilidad Complejo Clase I con Heterologous β2-Microglobulina

The major histocompatibility complex (MHC) plays a pivotal role in antigen peptide presentation and T cell immune responses against infectious disease and ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA in cell line&#160;and three-dimensional (3D) cultures of human airway epithelium. The method allows highly specific and sensitive visualization of viral RNA by relying on HCR initiated by probe localization. Split-initiator probes help amplify the signal by fluorescently labeled amplifiers, resulting in negligible background fluorescence in confocal microscopy. Labeling amplifiers with different fluorescent dyes facilitates the simultaneous recognition of various targets. This, in turn, allows the mapping of the infection in tissues to better understand viral pathogenesis and replication at the single-cell level. Coupling this method with immunofluorescence may facilitate better understanding of host-virus interactions, including alternation of the host epigenome and immune response pathways. Owing to sensitive and specific HCR technology, this protocol can also be used as a diagnostic tool. It is also important to remember that the technique may be modified easily to enable detection of any RNA, including non-coding RNAs and RNA viruses that may emerge in the future.

Here, we describe a simple method that combines RNA fluorescence in situ&#160;hybridization (RNA-FISH) with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA. This protocol may increase understanding of the molecular characteristics of SARS-CoV-2 RNA-host interactions at a single-cell level.

Visualización Del SARS-CoV-2 Usando Inmuno ARN-Fluorescencia Hibridación In Situ

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique

T cell-mediated immunity plays an important role in controlling flavivirus infection, either after vaccination or after natural infection. The "quality" of a T cell needs to be assessed by function, and higher function is associated with more powerful immune protection. T cells that can simultaneously produce two or more cytokines or chemokines at the single-cell level are called polyfunctional T cells (TPFs), which mediate immune responses through a variety of molecular mechanisms to express degranulation markers (CD107a) and secrete interferon (IFN)-&#947;, tumor necrosis factor (TNF)-&#945;, interleukin (IL)-2, or macrophage inflammatory protein (MIP)-1&#945;. There is increasing evidence that TPFs are closely related to the maintenance of long-term immune memory and protection and that their increased proportion is an important marker of protective immunity and is important in the effective control of viral infection and reactivation. This evaluation applies not only to specific immune responses but also to the assessment of cross-reactive immune responses. Here, taking the Japanese encephalitis virus (JEV) as an example, the detection method and flow cytometry color scheme of JEV-specific TPFs produced by peripheral blood mononuclear cells of children vaccinated against Japanese encephalitis were tested to provide a reference for similar studies.

Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique

The present protocol combines ex vivo stimulation and flow cytometry to analyze polyfunctional T cell (TPF)&#160;profiles in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) within Japanese encephalitis virus (JEV)-vaccinated children. The detection method and flow cytometry color scheme of JEV-specific TPFs were tested to provide a reference for similar studies.

Detección de células T polifuncionales en niños vacunados con la vacuna contra la encefalitis japonesa mediante la técnica de citometría de flujo

T cell-mediated immunity plays an important role in controlling flavivirus infection, either after vaccination or after natural infection. The "quality" ...