Este trabalho foi financiado pela American Heart Association e Fundação Cardiomiopatia das Crianças (SDG2462390204001) e os Institutos Nacionais de Saúde (HL114669). CM é um receptor de um pós-doutorado concessão bolsa de pesquisa concedido pela Fundação Miocardite, NJ.

Declaração de Ética: Todos os procedimentos com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e aprovado pela Universidade de Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE. 1. Indução de EAE <ol><li> Para induzir a EAE, preparar a emulsão de péptido / adjuvante completo de Freund (CFA), como descrito em 11, com as seguintes modificações: Passo 1.1:. Preparar PLP 139-151 a uma concentração de 1 mg / ml em tampão fosfato salino 1x (PBS) Passo 1.4:. utilizar 200 ul de CFA emulsão contendo 100 ug de PLP 139-151 por animal Passo 1.4.1: imunizar dez animais, preparar 2 ml de emulsão por mistura de 1 ml de PLP 139-151 (1 mg / ml em 1x . PBS) e um volume igual de CFA Passo 1.5: injectar 200 ul de emulsão em doses divididas por via subcutânea, nas duas regiões inguinais (~ 75 ul de cada um) e a região do esterno (~ 50 ul) de cinco a seis semanas de idade femacamundongos le SJL / J. Passos 1.7 e 1.8 não são aplicáveis ​​para a indução de EAE. </li></ol> 2. Scoring Clínica de Ratos do EAE e colheita de Cerebrums <ol><li> Monitorar os animais para aparecimento de sinais clínicos, e marcar a doença gravidade diariamente a partir do dia 9 após a imunização da seguinte forma: 0 - saudável; 1 - mole cauda ou posterior membro fraqueza, mas não ambos; 2 - mole cauda e posterior membro fraqueza; 3 - paralisia parcial dos membros posteriores; 4 - paralisia completa dos membros posteriores; 5 - moribundo ou morto 12. </li><li> Eutanásia dos ratinhos quando atingem uma pontuação neurológica de 3 ou 4 com CO 2. Para eutanásia os ratos, pré-preencher a câmara de eutanásia primeiro com CO 2, rodando o regulador do CO 2 tanque não superior a 6 psi e permitir que os animais para ficar dentro da câmara por cerca de 5 min para conseguir asfixia completa. Mergulhe os animais sacrificados em 70% de álcool. Imediatamente, colocar os animais sobre uma almofada absorvente e utilizando um par de estéril paraceps e tesouras expor os corações, cortando através da cavidade torácica. Perfurar o aurículas direita e perfuse injetando 10 ml de frio 1x PBS nos ventrículos esquerdos dos corações. </li><li> Escavar o crânio cortando o crânio em uma forma circular usando um par de tesouras curvas, e com cuidado, virar os ossos do crânio com uma pinça. Colha o cérebro por embotar dissecção e com um bisturi limpo, cérebro separado do cerebelo. Coloque o cérebro num tubo contendo frio 1x PBS e deixar o tubo em gelo até ao processamento. </li></ol> 3. In Situ A coloração das secções cerebrais com MHC Classe II (IA s) / PLP 139-151 Dextramers <ol><li> Prepare-se 4% de agarose tamponado com PBS de ponto de fusão baixo, derreter-se aquecimento a 50 ° C e deixá-lo em um banho de água a 40 ° C até à sua utilização. </li><li> Coloque o cérebro em um cassete histologia molde base profunda descartável mantido sobre o gelo, e despeje fundido (40 ° C) de agarose. Imediatamente, pressione suavemente o cérebrocom uma pinça para submergir o tecido. Deixar a cassete em gelo durante 15-20 minutos até a solidificação é completa. </li><li> Encha a banheira com vibratome refrigerados 1x PBS. Encher o espaço em torno de vibratome banho com cubos de gelo para manter a temperatura de PBS entre 0 e 2 ° C. Corrigir uma lâmina de barbear limpa no vibratome e definir o ângulo da lâmina de 15 °. </li><li> Colocação de tecido em vibratome. Aparar o excesso de agarose a partir de todos os lados do tecido embebido e ligeiramente expor a superfície ventral do cérebro. <ol><li> Smear vibratome bloco de tecido com super cola e transferir o tecido incorporado-agarose sobre a superfície colada, colocando a superfície ventral do cérebro exposto sobre a cola para seccionamento transversal. Não mova o tecido, uma vez que o tecido é definido sobre o bloco. </li><li> Colocar o bloco vibratome contendo o tecido embebido-agarose em gelo, e permitir que a cola seque durante 15 minutos. </li></ol></li><li> Enquanto isso, coloque o tecido chamBers por um poço de uma placa de 24 poços. Encha as cavidades que contêm as câmaras de tecidos com 1 ml de PBS 1x frio, e deixar a placa em gelo. <ol><li> Prepare as câmaras do tecido, anexando uma fina malha de nylon para o corte final de uma pipeta de 25 ml de polipropileno com super-cola; após a remoção do excesso de malha em volta da pipeta, a pipeta para cortar um comprimento de 1 cm da malha. </li></ol></li><li> Diminuir a lâmina vibratome ao nível da superfície superior do tecido; definir a velocidade vibratome a 0,22 mm / seg e iniciar o corte com um movimento para frente para fazer 200 mm de espessura. Transferir uma parte cerebral por poço usando uma escova macia da aguarela nas câmaras de tecido colocados dentro dos poços de uma placa de 24 poços. Manter a placa em gelo até o corte está completa para evitar a degradação do tecido. Nota: Siga estes passos para obter no total, três seções pares de três regiões diferentes do cérebro dorsal à superfície ventral (Figura 2). Uma seção decada par (um total de três secções) colocados em três câmaras de tecido individuais são designadas por coloração com dextramers específicos (IA s / PLP 139-151) e anti-CD4. Da mesma forma, um outro conjunto de três seções que são colocados em três câmaras do tecido são atribuídas a cada coloração com dextramers controle (IA s / TMEV 70-86) e anti-CD4. </li><li> Transferir as três câmaras de tecido contendo as secções designadas por coloração com dextramers específicos em três poços de uma placa de 24 poços com uma câmara por poço no qual, a 300 uL de um cocktail contendo aloficocianina (APC)-conjugados PLP 139-151 dextramers (2,5 ug / ml) e anti-CD4-ficoeritrina (PE, 5 ug / ml) em solução (PBS 1x bloqueio com 2% de soro normal de cabra) foi previamente adicionado. Cobrir os poços com tampa. </li><li> Da mesma forma, transferir as três câmaras de tecido contendo as secções designadas por coloração com dextramers controlo em três poços de uma placa de 24 poços com uma câmara por nósll, em que, a 300 uL de um cocktail contendo TMEV APC-conjugado 70-86 dextramers (2,5 ug / ml) e anti-CD4-PE (5 ug / ml) em solução de bloqueio foi previamente adicionado. Cobrir os poços com tampa. Nota: Consulte o Massilamany et al, 8 para a preparação de dextramers, e as moléculas de dextrano para preparar dextramers foram gentilmente cedidas pelo Immudex, Copenhaga, Dinamarca.. </li><li> Rotular os poços, e enrole a placa com papel alumínio e coloque a placa em uma plataforma de balanço definido para rotações suaves durante 1,5 horas no escuro à temperatura ambiente. </li><li> Após o período de incubação, lavam secções de tecido na plataforma oscilante, através da transferência das câmaras de tecido para um novo poço contendo 1 ml de PBS 1x frio, e evitar que pinga do conteúdo de um poço para o outro. Repita três vezes de lavagem, permitindo que pelo menos 10 min por lavagem. Certifique-se que as secções de tecido não ficar seco como eles podem ficar com os lados da câmara. </li><li> Corrigir as seções transferindo o cham tecidobros num fresco bem na placa de 24 poços contendo 1 ml de filtrado de PBS paraformaldeído a 4% tamponado (pH 7,4) sobre uma plataforma oscilante durante 2 horas com rotação suave. </li><li> Repetir a lavagem três vezes tal como descrito no passo 3.10. </li><li> Coloque os cortes corados e fixas em uma lâmina de microscópio limpa com uma escova macia aquarela. Limpe o excesso de água, sem tocar na seção, e montar a seção usando meio de montagem. Cobrir com uma lamela microscópica e permitir que os slides para secar à temperatura ambiente O / N no quarto escuro. </li><li> Armazenar os slides em uma caixa de armazenamento de slides à prova de luz, a 4 ° C. </li></ol> 4. Indução de EAM e cobrança de corações <ol><li> Induzir EAM, como descrito na referência 11. </li><li> Eutanásia os ratos no dia 21 após a imunização usando câmara limpa equipados com CO 2 cilindro de gás, e mergulhar os animais em álcool 70%. Imediatamente, colocar os animais numa almofada absorvente, e usando um par de fórceps e tesouras expor o coraçãos, cortando através da cavidade torácica. Perfurar o aurículas direita e perfuse injetando 10 ml de frio 1x PBS nos ventrículos esquerdos dos corações. Colete os corações e coloque em tubos contendo frio 1x PBS. </li></ol> 5. In Situ Coloração de Seções do coração com MHC Classe II (IA k) / MyHC 334-352 Dextramers <ol><li> Prepare 4% PBS-tampão baixo ponto de fusão agarose, derreter por aquecimento a 50 ° C e deixá-lo em um 40 &#160; ° C banho de água até o uso. </li><li> Colocar o coração numa cassete descartável profunda histologia do molde da base mantidos em gelo, e derramar fundido a 40 ° C até que os tecidos de agarose são completamente submersa tal como descrito na etapa 3.2. </li><li> Siga o passo 3.3. </li><li> Aparar o excesso de agarose a partir de todos os lados do tecido embebido e ligeiramente expor a base do coração. Esfregaço vibratome bloco de tecido com super-cola e transferir o tecido embebidas em agarose sobre a superfície colada, colocando a superfície exposta dacoração sobre a cola. Não mova o tecido, uma vez que o tecido é definido sobre o bloco. <ol><li> Colocar o bloco vibratome contendo o tecido embebido-agarose em gelo, e permitir que a cola seque durante 15 minutos. </li></ol></li><li> Siga os passos 3.5 e 3.6. </li><li> Transferir as secções de coração utilizando uma escova macia aguarela nas câmaras de tecido colocadas no interior das cavidades de uma placa de 24 poços. Manter a placa em gelo até o corte está completa para evitar a degradação do tecido. Nota: Siga estas etapas para obter no total, oito seções pares do ápice para a base do coração (Figura 2). Coloque todas as seções em câmaras do tecido, destinando até 3 seções por câmara. Uma secção de cada par (um total de oito pontos) é designado por coloração com dextramers específicos (IA k / myhc 334-352) e anti-CD4. Da mesma forma, um outro conjunto de oito seções é designado para coloração com dextramers controle (IA k / RNase 43-56) e anti-CD4. </li><li> Transferir otrês câmaras de tecido contendo as secções designadas por coloração com dextramers específicos em três poços de uma placa de 24 poços com uma câmara por poço, em que, a 300 uL de um cocktail contendo APC-conjugados myhc 334-352 dextramers (2,5 ug / ml) e anti-CD4-PE (5 ug / ml) em solução de bloqueio foi previamente adicionado. Cobrir os poços com tampa. <ol><li> Da mesma forma, transferir as três câmaras de tecido contendo as secções designadas por coloração com dextramers controlo em três poços de uma placa de 24 poços com uma câmara por poço, em que, a 300 uL de um cocktail contendo RNase APC-conjugado 43-56 dextramers (2,5 ug / ml) e anti-CD4-PE (5 ug / ml) em solução de bloqueio foi previamente adicionado. Cobrir os poços com tampa. </li></ol></li><li> Rotular os poços, e enrole a placa com papel alumínio e coloque a placa em uma plataforma de balanço definido para rotações suaves durante 1,5 horas no escuro à temperatura ambiente. </li><li> Siga os passos, 3,10-3,11 </li><li> Repita thr lavagemgelo tal como descrito na etapa 3.10. </li><li> Coloque os cortes corados e fixos (até três seções / slide) em uma lâmina de microscópio limpa com uma escova macia aquarela. Limpe o excesso de água, sem tocar as seções, e montar as seções usando meio de montagem. Cobrir com uma lamela microscópica e permitir que os slides para secar à temperatura ambiente O / N no quarto escuro. </li><li> Armazenar os slides em uma caixa de armazenamento de slides à prova de luz a 4 ° C. </li></ol> 6. Análise de Dextramer + Cells (DEXT +) T CD4 + por Laser Scanning Confocal Microscope (LSCM) (comum a ambos cérebro eo coração Seções) <ol><li> Use Nikon A1-Eclipse sistema de microscópio confocal 90i para a digitalização de rotina e aquisição de imagens. Para iniciar clique em Abrir o software NIS Elements AR (versão 4.13). <ol><li> Escolha &quot;TRITC&quot; e &quot;Cy5&quot; canais do painel. Os comprimentos de onda, respectivamente excitação / emissão para canais TRITC e Cy5, 561,5 nm / 553-618 nm e 640,7 nm / 663-738 nm aparecem por padrão. </li><li> Atribuir o pseudocolors &quot;verde&quot; e &quot;vermelho&quot; para o TRITC (CD4-PE) e Cy5 canais (dextramer-APC), respectivamente. </li><li> Coloque o slide a ser examinado no palco microscópico e focar manualmente com aumento de 100X. Defina o &quot;HV&quot; para 110 e compensar a &quot;0&quot;. Clique em &quot;Focus&quot; e ajuste a &quot;tensão&quot; para otimizar os lasers. </li><li> Clique em &quot;Focus&quot;; digitalizar a seção de cima para baixo, e definir o nível de &#39;Z&#39; para a aquisição da imagem. Clique em &quot;séries CH&quot; e adquirir a seqüência de imagens. Identificar DEXT + células T CD4 + células aparecendo puntiformes como amarelas com base na co-localização dos sinais gerados a partir de ambos os canais vermelho (dextramers) e verde (CD4). </li></ol></li><li> Use Olympus FV500-BX60 microscópio confocal para enumeração quantitativa fácil de células T CD4 + + DEXT. Para começarclique aberto, o software FluoView (versão 4.3). <ol><li> Selecione o corantes &quot;Cy3&quot; e &quot;Cy5&quot; a partir do menu drop-down, e clique em &quot;aplicar&quot; para carregar os respectivos lasers. Nota: os comprimentos de onda de excitação / emissão para Cy3 (543 nm / pseudocolored &quot;verde&quot;; CD4-PE); canais e Cy5 (dextramer-APC 633 nm / pseudocolored &quot;vermelho&quot;). </li><li> Coloque o slide a ser examinado na lâmina de microscópio, e concentrá-la manualmente em pequeno aumento (4X ou 10X). Clique em &quot;Focus&quot;, enquanto o laser Cy3 está ligado, e se concentrar o foco inflamatório. </li><li> Altere o objetivo de aumento de 100X. Defina o tamanho do arquivo para &quot;512/512&quot; a partir do menu drop-down. Clique em &quot;Focus&quot; e ajuste os valores para &quot;PMT&quot;, &quot;Gain&quot; e &quot;Offset&quot; parâmetros para otimizar os lasers separadamente para Cy3 e Cy5. </li><li> Clique em &quot;fase Z&quot; e clique em &quot;Focus&quot;, enquanto ambos os lasers estão. Conjuntoa espessura da &quot;fase Z&quot; clicando no botão &quot;up&quot; e &quot;down&quot; setas. Defina o intervalo de &quot;Z&quot; para 2 m. </li><li> Clique em &quot;Stop&quot;, e escolha &quot;Seq123&quot;. Em seguida, clique em &quot;XYZ&quot; e começar a aquisição de imagens da série &quot;Z&quot; para a área selecionada dentro do foco inflamatório. Salve as &quot;imagens de série Z&quot;, como arquivos AVI. Para salvar os arquivos de imagem, selecione a imagem da &quot;imagem de série Z&quot;, e, em seguida, salvar como formato &quot;tiff&quot;. </li></ol></li><li> Examine três seções pares do cérebro, onde um conjunto de três seções foi corado com IA s / PLP 139-151 dextramers/anti-CD4 eo outro conjunto de três seções com IA s / TMEV 70-86 dextramers/anti-CD4 para executar análise quantitativa. <ol><li> Da mesma forma, analisar oito seções emparelhados para o coração, no qual, um conjunto de oito seções estava manchada de IA k / MyHC 334-352 dextramers/anti-CD4 e outro set de oito seções com RNase 43-56 dextramers/anti-CD4. </li></ol></li><li> Examine de 10 a 15 focos inflamatórios por seção no cérebro, e em cada foco, adquirir um conjunto de 15 a 25 imagens de série sequencial. <ol><li> Examine um total de 20 focos inflamatórios de todas as oito seções do coração e de cada foco adquirir de 10 a 15 imagens de série sequencial. Pegue as imagens de série &#39;Z&#39;, digitalizando os slides em um &quot;up-horizontal-vertical no horizontal-vertical&quot; movimento de modo que a repetição da série &#39;Z&#39; dentro do mesmo foco é evitado. </li><li> Uma vez que as imagens de série &quot;Z&quot; são capturados, nomear os arquivos, identificando os números de slides, nome das seções, eo número das imagens em série &#39;Z&#39; tomadas. <ol><li> Use o software &quot;ImageJ&quot; para contagem de células CD4 + T + DEXT em relação ao número total de células T CD4 +. Selecione o &quot;tipo de balcão &#39;em&#39; ImageJ, verifique e# 8216; mostrar todos &quot;e começará a contar clicando no centro de cada célula e continuar contando em diferentes &#39;&#39; Z imagens de série usando as setas laterais. Após a contagem de todas as células T CD4, escolha outro tipo de balcão e contagem de CD4 + DEXT + células T. Clique na guia resultados para obter o número total de células contadas com os dois contadores diferentes. </li><li> Para se obter o número total, adicionar o número de células em todas as imagens seriais &#39;Z&#39; representando todas as três secções cerebrais ou todas as secções de coração oito. </li></ol></li></ol></li></ol>

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	<li>Cecconi, V., Moro, M., Del Mare, ., Dellabona, S., P, G., Casorati, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+MHC+class+II+tetramers+to+investigate+CD4++T+cell+responses:+problems+and+solutions.">Use of MHC class II tetramers to investigate CD4+ T cell responses: problems and solutions.</a> Cytometry A. 73 (11), 1010-1018 (2008).</li><li>Ferlin, W., Glaichenhaus, N., Mougneau, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Present+difficulties+and+future+promise+of+MHC+multimers+in+autoimmune+exploration.">Present difficulties and future promise of MHC multimers in autoimmune exploration.</a> Curr Opin Immunol. 12, 670-675 (2000).</li><li>Kwok, W. W., Ptacek, N. A., Liu, A. W., Buckner, J. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+In+situ+tetramer+staining+of+antigen-specific+T+cells+in+tissues.">Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues.</a> J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).</li><li>Skinner, P. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+tetramer+staining.">In situ tetramer staining.</a> J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).</li><li>Skinner, P. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+staining+using+MHC+class+I+tetramers.">In situ staining using MHC class I tetramers.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 17, Unit 17.14.11 (2004).</li></ol>

Não há conflitos de interesses foram declaradas.

Ao contrário I tetrâmeros de MHC de classe, o uso de tetrâmeros de MHC de classe II para aplicações de rotina continua a ser um desafio, especialmente para enumerar as freqüências precursoras de células CD4 T auto-reativas de baixa afinidade, em parte devido à sua dependência de ativação 6,15-17. Recentemente, este problema foi contornado pela criação da nova geração de tetrâmeros, chamado &quot;dextramers&quot;, permitindo-nos para as células específicas para o antigénio T CD4 para um con...

O uso do complexo principal de histocompatibilidade tetrâmeros (MHC) de classe II, para a detecção de células específicas para o antigénio T CD4 tem sido um desafio 1-7. Para aumentar a sensibilidade de detecção de tetrâmeros de MHC de classe II, a equipe de pesquisa criou tetrâmeros de próxima geração, designadas &quot;dextramers&quot; 8. Dextramers conter esqueletos de dextrano na qual várias unidades químicas da estreptavidina-fluoróforo são conjugados, de tal modo que vários monómeros, de péptidos biotinilados de MHC-tethered pode ser ligado a uma molécula de dextrano 9. Assim, grandes agregados de dextramers MHC que contêm vários complexos MHC-péptido podem interagir com múltiplos receptores de células T (TCRs). Este grupo recentemente gerado dextramers para vários auto-antigénios e demonstrado que a sensibilidade de detecção de dextramers foi aproximadamente cinco vezes mais do que 8 tetrâmeros. Os sistemas experimentais incluem encefalomielite auto-imune experimental (EAE) induzida com proteína proteolipidica (PLP) em murganhos SJL 139-151; EAE induzida com glicoproteína de mielina oligodendrócitos (MOG) 35-55 em camundongos C57BL / 6; e miocardite auto-imune experimental (EAM) induzida com miosina cardíaca pesada cadeia-α (MyHC) 334-352 em camundongos A / J. Este estudo demonstra a utilização de PLP 139-151 - e MyHC 334-352 dextramers para detectar células específicas para o antigénio T CD4 in situ com especificidade pelo desenvolvimento de um protocolo de coloração directa, eliminando assim a necessidade de amplificar os sinais de utilizar anticorpos fluoróforo, uma aproximar comumente empregado com o uso de tetrâmeros. Além disso, um método global de avaliar tecidos também foi concebida de forma fiável para enumerar as frequências de células T CD4 + específicas para o antigénio in situ 10. Detecção de células T específicas para o antigénio in situ permite a delineação dos eventos causados ​​por estímulos antigénicos específicos de as causadas pela activação do espectador. De igual modo, a técnica em si tu também provides oportunidades de acompanhar a cinética de infiltração de células T específicas de antigénios nos órgãos-alvo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:619px;">CFA</td>
			<td style="width:364px;">Sigma Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td style="width:219px;">5881</td>
			<td style="width:167px;">Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MTB&#160; H37Rv extract&#160;</td>
			<td>Difco Laboratories, Detroit, MI</td>
			<td>231141</td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">PT</td>
			<td>List Biologicals Laboratories, Campbell, CA</td>
			<td>181</td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">1x PBS&#160;</td>
			<td>Corning, Manassas, VA</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Female A/J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME</td>
			<td>646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Female SJL/J mice</td>
			<td>Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME</td>
			<td>686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leur-lok sterile 1 ml syrringe</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leur-lok sterile 3 ml syrringe</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile needle, 18 G</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile needle, 27 1/2 G</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-way stopcock&#160;</td>
			<td>Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH</td>
			<td>MX5311L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kerlix gauze bandage rolls&#160;</td>
			<td>Covidien, Mansfield, MA</td>
			<td>6720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade</td>
			<td>Promega corporation, Madison, WI</td>
			<td style="width:219px;">V2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Immunopure normal goat serum</td>
			<td>Thermo Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:219px;">31873</td>
			<td>Store at -20 &#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Anti-mouse CD4 conjugated with PE dye</td>
			<td style="width:364px;">eBioscience, San Diego, CA&#160;</td>
			<td style="width:219px;">12004185</td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA</td>
			<td style="width:219px;">19202</td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Faramount Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Dako, Carpinteria, CA</td>
			<td style="width:219px;">10073021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Conical tube (15ml)</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td style="width:219px;">352099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Conical tube (50 ml)</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td style="width:219px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well flat bottomed tissue culture plates</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td>356775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water color #2 brushes</td>
			<td>Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY</td>
			<td style="width:219px;">73502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plain Microscope slides, size: 3&#34; x 1&#34; x 1.2 mm</td>
			<td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:219px;">1255010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Premium Cover glass, 22 x 22-1</td>
			<td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:219px;">12548B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable deep base mold histology cassettes</td>
			<td>Laboratory prodcust, Rochester, NY</td>
			<td style="width:219px;">M-475-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Loctite Super glue</td>
			<td>Henkel Corporation, Westlake, OH</td>
			<td style="width:219px;">1471879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Razor blades</td>
			<td>Gillette SuperSilver</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK)</td>
			<td style="width:364px;">Neopeptide, Cambridge, MA</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF)</td>
			<td style="width:364px;">Neopeptide, Cambridge, MA</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MHC class II/IAs PLP 139-151 or TMEV 70-86 dextramers conjugated with APC dye</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MHC class II/IAk Myhc 334-352 or&#160; or RNase 40-56 dextramers conjugated with APC dye</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Dextran conjugated SA-APC</td>
			<td>&#160;Immundex, Copenhagen, Demark</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile surgical scissors and forceps</td>
			<td style="width:364px;">INOX tool Corporation</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro oven</td>
			<td style="width:364px;">GE Healthcare, Pittsuburgh, PA</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leica VT 1200 Vibratome</td>
			<td>Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus BX 60&#160; Laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Olympus America, Inc. Center Valley, PA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon A1-Eclipse 90i confocal microscope</td>
			<td>Nikon Inc. Melville, NY</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ detection of autoreactive cd4 t cells in brain and heart using major histocompatibility complex class ii dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-&#945; (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler&#8217;s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the &#8216;Z&#8217; serial images.

Neste relatório, a detecção in situ de antígeno-específicas, autoreactive células T CD4 por coloração direta com dextramers MHC classe II é descrito. Seções cerebrais Corte recentemente foram derivadas de camundongos EAE e corados com cocktails contendo PLP 139-151 (específico) ou TMEV 70-86 (controle) dextramers e anti-CD4. Os painéis de topo da Figura 1 mostra a análise de secções cerebrais LSCM costained com PLP 139-151 dextramers (vermelho) e anticorpo CD4 (verde), onde as c...

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In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

O protocolo para detectar células auto-reactivas T CD4 no cérebro e no coração por coloração direta com complexo de histocompatibilidade principal dextramers classe II foi descrito neste relatório. Para análise detalhada, um método confiável para enumerar as freqüências de células T CD4 + antígeno-específicas in situ também é concebido.

A detecção in situ de células T CD4 autoreactive em Cérebro e Coração Usando principal de histocompatibilidade Dextramers classe II

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

in-situ-detection-autoreactive-cd4-t-cells-brain-heart-using-major

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

11.6K visualizações.  University of Nebraska, Lincoln.  O protocolo para detectar células auto-reactivas T CD4 no cérebro e no coração por coloração direta com complexo de histocompatibilidade principal dextramers classe II foi descrito neste relatório. Para análise detalhada, um método confiável para enumerar as freqüências de células T CD4 + antígeno-específicas in situ também é concebido. 