Ce travail a été soutenu par l&#39;American Heart Association et de la Fondation cardiomyopathie des enfants (SDG2462390204001) et les Instituts nationaux de santé (de HL114669). CM est un bénéficiaire d&#39;une subvention de bourse de recherche postdoctorale décerné par la Fondation myocardite, NJ.

Déclaration d&#39;éthique: Toutes les procédures d&#39;animaux ont été effectuées en conformité avec les lignes directrices pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire et approuvés par l&#39;Université de Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE. Une. Induction de l&#39;EAE <ol><li> Pour induire l&#39;EAE, préparer l&#39;émulsion de peptide / de l&#39;adjuvant complet de Freund (CFA), comme décrit dans 11 avec les modifications suivantes: Etape 1.1:. Préparer PLP 139-151, à une concentration de 1 mg / ml dans 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) Étape 1.4:. utiliser 200 ul de FCA émulsion contenant 100 ug de PLP 139-151 par animal étape 1.4.1: pour immuniser des dix animaux, préparer 2 ml d&#39;émulsion en mélangeant 1 ml de PLP 139-151 (1 mg / ml dans 1 x . PBS) et un volume égal de CFA étape 1.5: injecter 200 pi d&#39;émulsion en doses fractionnées voie sous-cutanée dans les deux régions inguinales (~ 75 pi de chacun) et région sternale (~ 50 pi) de cinq à six semaines d&#39;âge FEMAsouris le SJL / J. Les étapes 1.7 et 1.8 ne sont pas applicables pour l&#39;induction de l&#39;EAE. </li></ol> 2. Notation clinique des souris EAE et récolte de cerebrums <ol><li> Surveiller les animaux pour apparition des signes cliniques, et marquer la maladie gravité tous les jours de 9 jours après immunisation comme suit: 0 - sain; 1 - mou queue ou des membres postérieurs faiblesse, mais pas les deux; 2 - mou queue et des pattes postérieures faiblesse; 3 - paralysie partielle des membres postérieurs; 4 - la paralysie complète des membres postérieurs; 5 - morts ou moribonds 12. </li><li> Euthanize la souris quand ils atteignent un score neurologique de 3 ou 4 à l&#39;aide de CO 2. Pour euthanasier les souris, pré-remplir la chambre d&#39;euthanasie d&#39;abord avec le CO 2 en tournant le régulateur du réservoir de CO 2 ne dépassant pas 6 psi et permettre aux animaux de rester dans la chambre pendant environ 5 min pour atteindre l&#39;asphyxie complète. Faire tremper les animaux euthanasiés dans 70% d&#39;alcool. Immédiatement, placer les animaux sur un coussin absorbant et à l&#39;aide d&#39;une paire de stérile pourcèpes et ciseaux exposent les cœurs en coupant à travers la cavité thoracique. Piquer les bonnes oreillettes et perfuser en injectant 10 ml de PBS froid 1x dans les ventricules gauches des coeurs. </li><li> Creuser le crâne en coupant le crâne de façon circulaire à l&#39;aide d&#39;une paire de ciseaux courbes, et soigneusement, retourner les os du crâne avec une pince. Récolter le cerveau par émousser la dissection et l&#39;aide d&#39;un scalpel propre, cerveau séparé du cervelet. Placez le cerveau dans un tube contenant froid 1x PBS et laisser le tube sur la glace jusqu&#39;à ce que le traitement. </li></ol> 3. In Situ coloration des sections cérébrales avec CMH de classe II (IA s) / PLP 139-151 Dextramers <ol><li> Préparer 4% PBS tamponnée d&#39;agarose bas point de fusion, fondu par chauffage à 50 ° C et laisser dans un bain-marie à 40 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Placez le cerveau dans un moule de base profonde cassette histologie disponible conservés sur de la glace, et versez fondu (40 ° C) agarose. Immédiatement, appuyez doucement sur le cerveauavec une pince pour s&#39;immerger le tissu. Laisser la cassette sur la glace pendant 15-20 min jusqu&#39;à ce que la solidification est terminée. </li><li> Remplir la baignoire vibratome avec réfrigéré 1x PBS. Remplir l&#39;espace autour vibratome bain de glaçons pour maintenir la température de PBS entre 0 et 2 ° C. Fixer une lame de rasoir propre dans le vibratome et régler l&#39;angle de la lame à 15 °. </li><li> Placement de tissu dans vibratome. Coupez l&#39;excédent agarose de tous les côtés du tissu intégré et légèrement exposer la surface ventrale du cerveau. <ol><li> Étaler vibratome bloc de tissu avec de la colle super et transférer le tissu d&#39;agarose-intégré sur la surface collée en plaçant la face ventrale du cerveau exposé sur la colle pour le sectionnement transversal. Ne déplacez pas le tissu, une fois que le tissu est placé sur le bloc. </li><li> Placez le bloc de vibratome contenant le tissu agarose embarqué sur la glace, et laisser la colle sécher pendant 15 min. </li></ol></li><li> Dans le même temps, placez le cham de tissuBers un par puits d&#39;une plaque de 24 puits. Remplir les puits contenant les chambres de tissu avec 1 ml de PBS froid 1x, et laisser la plaque sur la glace. <ol><li> Préparer les chambres de tissu en attachant un nylon mince filet à la coupe en bout d&#39;une pipette 25 ml de polypropylène en utilisant de la colle super; après la coupe du treillis en excès autour de la pipette, la pipette à couper une longueur de 1 cm à partir de la maille. </li></ol></li><li> Abaisser la lame vibratome au niveau de la surface supérieure du tissu; régler la vitesse de vibratome à 0,22 mm / s et commencer la coupe avec un mouvement vers l&#39;avant pour faire 200 um sections épaisses. Transférer une partie cérébrale par puits en utilisant une brosse douce d&#39;aquarelle dans les chambres de tissus placés dans les puits d&#39;une plaque de 24 puits. Conservez la plaque sur la glace jusqu&#39;à ce que le sectionnement est complet pour prévenir la dégradation des tissus. Remarque: Suivez ces étapes pour obtenir un total, trois sections paires de trois régions différentes du cerveau dorsale à la face ventrale (figure 2). Une section dechaque paire (sur un total de trois sections) placés dans trois chambres de tissu individuels sont désignés pour la coloration avec dextramers spécifiques (s IA / PLP 139-151) et anti-CD4. De même, un autre ensemble de trois sections qui sont placés dans trois chambres de tissu individuels sont désignés pour la coloration avec dextramers de commande (IA s / TMEV 70-86) et anti-CD4. </li><li> Transférer les trois chambres de tissu contenant les sections désignées pour la coloration avec dextramers spécifiques en trois puits dans une plaque à 24 puits avec une chambre par puits dans lequel, à 300 pl de cocktail contenant une allophycocyanine (APC) conjugués PLP 139-151 dextramers (2,5 ug / ml) et anti-CD4-phycoérythrine (PE; 5 pg / ml) dans une solution de blocage (PBS 1x avec 2% de sérum normal de chèvre) a été précédemment ajouté. Couvrir les puits avec un couvercle. </li><li> De même, le transfert des trois chambres de tissu contenant les sections désignées pour la coloration avec dextramers de contrôle dans trois puits dans une plaque de 24 puits avec une chambre pour nousll dans laquelle, à 300 pl d&#39;un cocktail contenant TMEV APC conjugué 70-86 dextramers (2,5 pg / ml) et anti-CD4-PE (5 ug / ml) dans une solution de blocage a été précédemment ajouté. Couvrir les puits avec un couvercle. Remarque: Reportez-vous à Massilamany et al, 8 pour la préparation de dextramers, et les molécules de dextran pour préparer dextramers ont été aimablement fournies par Immudex, Copenhague, Danemark.. </li><li> Étiqueter les puits, et envelopper la plaque avec une feuille d&#39;aluminium et placer la plaque sur une plate-forme à bascule fixé à des rotations douces pendant 1,5 heure dans l&#39;obscurité à la température ambiante. </li><li> Après la période d&#39;incubation, laver les coupes de tissus sur la plate-forme à bascule, en transférant les chambres de tissu pour un nouveau puits contenant 1 ml de PBS froid 1x, et éviter le dribble le contenu d&#39;un bien dans l&#39;autre. Répéter le lavage trois fois, ce qui permet au moins 10 min par lavage. Veiller à ce que les coupes de tissus ne sont pas séchés car ils peuvent coller aux parois de la chambre. </li><li> Fixer les sections en transférant le cham de tissubres dans un nouveau puits en plaque de 24 puits contenant 1 ml de filtre 4% de paraformaldéhyde tampon PBS (pH 7,4) sur une plate-forme à bascule pendant 2 heures avec des rotations douces. </li><li> Répétez trois fois le lavage comme décrit à l&#39;étape 3.10. </li><li> Placez les coupes colorées et fixes sur une lame de microscope propre à l&#39;aide d&#39;une brosse douce de l&#39;aquarelle. Essuyez l&#39;excès d&#39;eau sans toucher la partie, et monter la section en utilisant un milieu de montage. Couvrir avec une lamelle microscopique et laisser les lames sécher à température ambiante O / N dans la chambre noire. </li><li> Stocker les lames dans une boîte de rangement à glissière étanche à la lumière à 4 ° C. </li></ol> 4. L&#39;induction de l&#39;EAM et Collection de coeurs <ol><li> Induire EAM comme décrit dans la référence 11. </li><li> Euthanasier les souris au jour 21 après immunisation utilisant chambre propre équipé CO 2 bouteille de gaz, et tremper les animaux dans 70% d&#39;alcool. Immédiatement, placer les animaux sur un coussin absorbant et à l&#39;aide d&#39;une paire de pinces et des ciseaux exposer le cœurs en coupant à travers la cavité thoracique. Piquer les bonnes oreillettes et perfuser en injectant 10 ml de PBS froid 1x dans les ventricules gauches des coeurs. Recueillir les coeurs et les placer dans des tubes contenant de froid 1x PBS. </li></ol> 5. In Situ coloration de coeur sections avec CMH de classe II (IA k) / MyHC 334-352 Dextramers <ol><li> Préparer 4% tampon PBS bas point de fusion d&#39;agarose, faire fondre par chauffage à 50 ° C et le laisser dans un 40 &#160; ° C bain d&#39;eau jusqu&#39;à son utilisation. </li><li> Placez le coeur dans une profonde cassette histologie de moule de base jetable conservé dans la glace, et versez fondu à 40 ° C jusqu&#39;à ce que les tissus agarose sont complètement submergés, comme décrit dans l&#39;étape 3.2. </li><li> Suivez l&#39;étape 3.3. </li><li> Enlever l&#39;excès d&#39;agarose à partir de tous les côtés du tissu enrobé et légèrement exposer la base du cœur. Enduire vibratome bloc de tissu avec de la colle super et transférer le tissu d&#39;agarose-intégré collé sur la surface en plaçant la surface exposée de l&#39;coeur sur la colle. Ne déplacez pas le tissu, une fois que le tissu est placé sur le bloc. <ol><li> Placez le bloc de vibratome contenant le tissu agarose embarqué sur la glace, et laisser la colle sécher pendant 15 min. </li></ol></li><li> Suivez les étapes 3.5 et 3.6. </li><li> Transférer les sections de coeur avec une brosse douce d&#39;aquarelle dans les chambres de tissus placés dans les puits d&#39;une plaque de 24 puits. Conservez la plaque sur la glace jusqu&#39;à ce que le sectionnement est complet pour prévenir la dégradation du tissu. Remarque: Suivez ces étapes pour obtenir au total, huit sections paires du sommet à la base du cœur (Figure 2). Placez toutes les sections de chambres de tissu, affecter jusqu&#39;à 3 sections par chambre. Une section de chaque paire (sur un total de huit sections) est désignée pour la coloration avec dextramers spécifiques (IA k / MyHC 334-352) et anti-CD4. De même, un autre ensemble de huit sections est désigné pour la coloration avec dextramers de commande (IA k / RNase 43-56) et des anti-CD4. </li><li> Transférer letrois chambres de tissu contenant les sections désignées pour la coloration avec dextramers spécifiques en trois puits dans une plaque à 24 puits avec une chambre par puits dans lequel, à 300 pi d&#39;un cocktail contenant des conjugués APC-MyHC 334-352 dextramers (2,5 pg / ml) et anti-CD4-PE (5 ug / ml) dans une solution de blocage a été précédemment ajouté. Couvrir les puits avec un couvercle. <ol><li> De même, le transfert des trois chambres de tissu contenant les sections désignées pour la coloration avec dextramers de commande dans trois puits dans une plaque à 24 puits avec une chambre par puits dans lequel, à 300 pi d&#39;un cocktail contenant RNase APC conjugué 43-56 dextramers (2,5 pg / ml) et anti-CD4-PE (5 ug / ml) dans une solution de blocage a été précédemment ajouté. Couvrir les puits avec un couvercle. </li></ol></li><li> Étiqueter les puits, et envelopper la plaque avec une feuille d&#39;aluminium et placer la plaque sur une plate-forme à bascule fixé à des rotations douces pendant 1,5 heure dans l&#39;obscurité à la température ambiante. </li><li> Suivez les étapes, 3.10 à 3.11 </li><li> Répétez laver thrglace comme décrit à l&#39;étape 3.10. </li><li> Placez les coupes colorées et fixes (jusqu&#39;à trois sections / diapositives) sur une lame de microscope propre à l&#39;aide d&#39;une brosse douce de l&#39;aquarelle. Essuyez l&#39;excès d&#39;eau sans toucher les sections, et monter les sections en utilisant un milieu de montage. Couvrir avec une lamelle microscopique et laisser les lames sécher à température ambiante O / N dans la chambre noire. </li><li> Stocker les lames dans une boîte de rangement à glissière étanche à la lumière à 4 ° C. </li></ol> 6. Analyse des Dextramer + (dext +) cellules T CD4 + par microscopie confocale à balayage laser Microscope (LSCM) (communs à l&#39;cerveau et le cœur articles) <ol><li> Utilisez Nikon A1-Eclipse système de microscope confocal 90i pour la numérisation de routine et d&#39;acquisition d&#39;images. Pour commencer Cliquez ouvert, le logiciel NIS Elements AR (version 4.13). <ol><li> Choisissez &quot;TRITC&quot; et chaînes &quot;Cy5&quot; du panneau. Les excitation / émission des longueurs d&#39;onde respectivement pour les canaux TRITC et Cy5, 561,5 nm / 553-618 nm et 640,7 nm / 663-738 nm apparaissent par défaut. </li><li> Attribuer la pseudocouleurs &quot;vert&quot; et &quot;rouge&quot; pour la TRITC (CD4-PE) et Cy5 (dextramer-APC) canaux, respectivement. </li><li> Placer la lame d&#39;être examiné sur la scène microscopique et mise au point manuellement sous un grossissement de 100X. Réglez le &quot;HV&quot; à 110 et le décalage de &quot;0&quot;. Cliquez sur &quot;Focus&quot; et régler la «tension» pour optimiser les lasers. </li><li> Cliquez sur &quot;Focus&quot;; numériser la section de haut en bas, et définir le niveau «Z» pour l&#39;acquisition de l&#39;image. Cliquez sur &quot;série CH&quot; et d&#39;acquérir l&#39;image séquentielle. Identifiez dext + cellules T CD4 + apparaissant cellules ponctuées comme jaunes sur la base de la co-localisation des signaux générés à la fois du rouge (dextramers) et vert (CD4) canaux. </li></ol></li><li> Utilisez Olympus FV500-BX60 microscope confocal pour l&#39;énumération quantitative facile des cellules T CD4 + + DEXT. Pour commencercliquez ouverte, le logiciel de FluoView (version 4.3). <ol><li> Sélectionnez le colorants &quot;Cy3» et «Cy5&quot; dans le menu déroulant, puis cliquez sur &quot;Appliquer&quot; pour charger les lasers respectifs. Remarque: les longueurs d&#39;onde d&#39;excitation / émission pour Cy3 (543 nm / pseudocolored &quot;vert&quot;; CD4-PE), les canaux et Cy5 (dextramer-APC 633 nm / pseudocolored &quot;rouge&quot;). </li><li> Placer la lame d&#39;être examiné sur la lame de microscope, et de se concentrer manuellement à faible grossissement (4X ou 10X). Cliquez sur &quot;Focus&quot; tandis que le laser Cy3 est sur, et de se concentrer le foyer inflammatoire. </li><li> Modifier l&#39;objectif à grossissement de 100X. Définissez la taille du fichier à &quot;512/512&quot; dans le menu déroulant. Cliquez sur &quot;Focus&quot; et ajuster les valeurs pour &quot;PMT&quot;, &quot;gain&quot; et &quot;Offset&quot; paramètres pour optimiser les lasers séparément pour Cy3 et Cy5. </li><li> Cliquez sur &quot;étape de Z&quot; puis cliquez sur &quot;Focus&quot; alors que les deux lasers sont sur. Setl&#39;épaisseur de la &quot;scène de Z&quot; en cliquant sur le &quot;haut&quot; et &quot;bas&quot; flèches. Définissez l&#39;intervalle &quot;Z&quot; à 2 pm. </li><li> Cliquez sur &quot;Stop&quot;, et choisissez &quot;Seq123&quot;. Ensuite, cliquez sur &quot;XYZ&quot; et commencer à acquérir des images de la série &quot;Z&quot; pour la zone sélectionnée dans le foyer inflammatoire. Enregistrez les images &quot;Z&quot; de série dans un fichier AVI. Pour enregistrer des fichiers image, sélectionnez l&#39;image de l &#39;«image de série Z&quot;, puis enregistrer au format &quot;tiff&quot;. </li></ol></li><li> Examiner trois sections appariées du cerveau où un ensemble de trois sections a été colorée avec / PLP 139-151 dextramers/anti-CD4 IA et l&#39;autre ensemble de trois sections avec / TMEV 70-86 dextramers/anti-CD4 IA pour effectuer analyse quantitative. <ol><li> De même, analyser huit sections appariées pour le coeur, dans lequel, un ensemble de huit sections a été colorée avec IA k / MyHC 334-352 dextramers/anti-CD4 et un autre soit de huit sections avec RNase 43-56 dextramers/anti-CD4. </li></ol></li><li> Examiner 10 à 15 foyers inflammatoires par section cerveau, et dans chaque foyer, d&#39;acquérir un ensemble de 15 à 25 images en série séquentielle. <ol><li> Examiner un total de 20 foyers inflammatoires de toutes les huit sections de coeur et de chaque foyer acquérir 10 à 15 images en série séquentielle. Prenez les &#39;Z&#39; images série en balayant les diapositives dans un mouvement «horizontal-vertical-vous-horizontal-vertical vers le bas» de sorte que la répétition de la série «Z» dans le même foyer est évitée. </li><li> Une fois les images en série &#39;Z&#39; sont capturés, nommer les fichiers en identifiant les numéros de diapositives, le nom des sections, et le nombre de &#39;Z&#39; images prises en série. <ol><li> Utilisez le logiciel «ImageJ» pour compter les cellules T CD4 + + DEXT par rapport au nombre total de cellules T CD4 +. Sélectionnez le &#39;type de compteur »dans« ImageJ, consultez &amp;# 8216; montrer tous »et commencer à compter en cliquant sur le centre de chaque cellule et continuer à compter dans différents &#39;Z&#39; images en série à l&#39;aide de flèches latérales. Après avoir compté toutes les cellules T CD4, choisir un autre type de compteur et le nombre de CD4 + dext + cellules T. Cliquez sur l&#39;onglet des résultats pour obtenir le nombre total de cellules comptées avec les deux compteurs différents. </li><li> Obtenir le nombre total, ajouter le nombre de cellules dans l&#39;ensemble des images en série &#39;Z&#39; représentent tous les trois sections cérébraux ou toutes les sections huit cardiaques. </li></ol></li></ol></li></ol>

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocarditis-inducing+epitope+of+myosin+binds+constitutively+and+stably+to+I-Ak+on+antigen-presenting+cells+in+the+heart.">Myocarditis-inducing epitope of myosin binds constitutively and stably to I-Ak on antigen-presenting cells in the heart.</a> J Exp Med. 182 (5), 1291-1300 (1995).</li><li>Liao, L., Sindhwani, R., Leinwand, L., Diamond, B., Factor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+alpha-myosin+heavy+chains+differ+in+their+induction+of+myocarditis.+Identification+of+pathogenic+epitopes.">Cardiac alpha-myosin heavy chains differ in their induction of myocarditis. Identification of pathogenic epitopes.</a> J Clin Invest. 92 (6), 2877-2882 (1993).</li><li>Cameron, T. O., Cochran, J. R., Yassine-Diab, B., Sekaly, R. P., Stern, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+detection+of+antigen-specific+CD4++T+cells+by+HLA-DR1+oligomers+is+dependent+on+the+T+cell+activation+state.">Cutting edge: detection of antigen-specific CD4+ T cells by HLA-DR1 oligomers is dependent on the T cell activation state.</a> J Immunol. 166 (2), 741-745 (2001).</li><li>Novak, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+human+epitope-specific+T+cells+identified+by+class+II+tetramers+reside+within+a+CD4high,+proliferating+subset.">Activated human epitope-specific T cells identified by class II tetramers reside within a CD4high, proliferating subset.</a> Int Immunol. 13 (6), 799-806 (2001).</li><li>Reddy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+autoreactive+myelin+proteolipid+protein+139-151-specific+T+cells+by+using+MHC+II+(IAs)+tetramers.">Detection of autoreactive myelin proteolipid protein 139-151-specific T cells by using MHC II (IAs) tetramers.</a> J Immunol. 170 (2), 870-877 (2003).</li><li>Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+In+situ+tetramer+staining+of+antigen-specific+T+cells+in+tissues.">Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues.</a> J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).</li><li>Skinner, P. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+tetramer+staining.">In situ tetramer staining.</a> J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).</li><li>Skinner, P. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+staining+using+MHC+class+I+tetramers.">In situ staining using MHC class I tetramers.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 17, Unit 17.14.11 (2004).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêts n&#39;a été déclaré.

Contrairement tétramères CMH de classe I, l&#39;utilisation de tétramères CMH de classe II pour les applications de routine continue d&#39;être difficile, surtout pour énumérer les fréquences de précurseurs de cellules T CD4 autoréactifs de faible affinité, en partie à cause de leur dépendance à l&#39;égard d&#39;activation 6,15-17. Récemment, ce problème a été contourné par la création de la prochaine génération de tétramères, appelé &quot;dextramers,&quot; ce qui nous permet de dé...

L&#39;utilisation de complexe majeur d&#39;histocompatibilité (CMH) de classe II tétramères pour la détection de cellules spécifiques de l&#39;antigène T CD4 a été un défi 1-7. Pour améliorer la sensibilité de détection de tétramères CMH de classe II, l&#39;équipe de recherche a créé des tétramères de la prochaine génération, désignés &quot;dextramers&quot; 8. Dextramers contiennent des squelettes de dextrane dans lequel de multiples fragments de streptavidine fluorophore sont conjugués, tels que plusieurs monomères du CMH biotinylés, des peptides attachés peuvent être attachés à une molécule de dextran 9. Ainsi, de grands agrégats de dextramers CMH qui contiennent plusieurs complexes CMH-peptide peut interagir avec plusieurs récepteurs de cellules T (TCR). Ce groupe a récemment généré dextramers pour différents auto-antigènes et a démontré que la sensibilité de détection de dextramers était environ cinq fois plus que les tétramères 8. Les systèmes expérimentaux comprennent encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) induite par la protéine protéolipidique (PLP) 139-151 chez la souris SJL; EAE induite par la glycoprotéine de la myéline des oligodendrocytes (MOG) 35-55 dans C57BL / 6 souris; et la myocardite auto-immune expérimentale (EAM) induite avec la myosine cardiaque chaîne lourde α-(MyHC) 334-352 chez des souris A / J. Cette étude démontre l&#39;utilisation de PLP 139-151 - 334-352 dextramers MyHC et pour détecter les cellules spécifiques de l&#39;antigène T CD4 in situ avec une spécificité en développant un protocole de coloration directe, éliminant ainsi la nécessité pour amplifier les signaux en utilisant des anticorps à partir de fluorophores, un approcher couramment employé à l&#39;utilisation de tétramères. En outre, un procédé global de l&#39;évaluation des tissus ont également été mis au point pour énumérer de manière fiable les fréquences des cellules T CD4 spécifiques de l&#39;antigène in situ 10. La détection de cellules T spécifiques de l&#39;antigène in situ permet la délimitation des événements provoqués par des stimuli antigéniques spécifiques de ceux causés par l&#39;activation de l&#39;observateur. De même, la technique in situ également PROVIDes possibilités pour suivre la cinétique d&#39;infiltrations de cellules T spécifiques de l&#39;antigène dans les organes cibles.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:619px;">CFA</td>
			<td style="width:364px;">Sigma Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td style="width:219px;">5881</td>
			<td style="width:167px;">Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MTB&#160; H37Rv extract&#160;</td>
			<td>Difco Laboratories, Detroit, MI</td>
			<td>231141</td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">PT</td>
			<td>List Biologicals Laboratories, Campbell, CA</td>
			<td>181</td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">1x PBS&#160;</td>
			<td>Corning, Manassas, VA</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Female A/J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME</td>
			<td>646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Female SJL/J mice</td>
			<td>Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME</td>
			<td>686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leur-lok sterile 1 ml syrringe</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leur-lok sterile 3 ml syrringe</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile needle, 18 G</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile needle, 27 1/2 G</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-way stopcock&#160;</td>
			<td>Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH</td>
			<td>MX5311L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kerlix gauze bandage rolls&#160;</td>
			<td>Covidien, Mansfield, MA</td>
			<td>6720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade</td>
			<td>Promega corporation, Madison, WI</td>
			<td style="width:219px;">V2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Immunopure normal goat serum</td>
			<td>Thermo Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:219px;">31873</td>
			<td>Store at -20 &#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Anti-mouse CD4 conjugated with PE dye</td>
			<td style="width:364px;">eBioscience, San Diego, CA&#160;</td>
			<td style="width:219px;">12004185</td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA</td>
			<td style="width:219px;">19202</td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Faramount Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Dako, Carpinteria, CA</td>
			<td style="width:219px;">10073021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Conical tube (15ml)</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td style="width:219px;">352099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Conical tube (50 ml)</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td style="width:219px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well flat bottomed tissue culture plates</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td>356775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water color #2 brushes</td>
			<td>Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY</td>
			<td style="width:219px;">73502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plain Microscope slides, size: 3&#34; x 1&#34; x 1.2 mm</td>
			<td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:219px;">1255010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Premium Cover glass, 22 x 22-1</td>
			<td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:219px;">12548B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable deep base mold histology cassettes</td>
			<td>Laboratory prodcust, Rochester, NY</td>
			<td style="width:219px;">M-475-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Loctite Super glue</td>
			<td>Henkel Corporation, Westlake, OH</td>
			<td style="width:219px;">1471879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Razor blades</td>
			<td>Gillette SuperSilver</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK)</td>
			<td style="width:364px;">Neopeptide, Cambridge, MA</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF)</td>
			<td style="width:364px;">Neopeptide, Cambridge, MA</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MHC class II/IAs PLP 139-151 or TMEV 70-86 dextramers conjugated with APC dye</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MHC class II/IAk Myhc 334-352 or&#160; or RNase 40-56 dextramers conjugated with APC dye</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Dextran conjugated SA-APC</td>
			<td>&#160;Immundex, Copenhagen, Demark</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile surgical scissors and forceps</td>
			<td style="width:364px;">INOX tool Corporation</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro oven</td>
			<td style="width:364px;">GE Healthcare, Pittsuburgh, PA</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leica VT 1200 Vibratome</td>
			<td>Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus BX 60&#160; Laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Olympus America, Inc. Center Valley, PA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon A1-Eclipse 90i confocal microscope</td>
			<td>Nikon Inc. Melville, NY</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ detection of autoreactive cd4 t cells in brain and heart using major histocompatibility complex class ii dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-&#945; (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler&#8217;s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the &#8216;Z&#8217; serial images.

Dans ce rapport, la détection in situ de spécifiques de l&#39;antigène, auto-réactifs cellules T CD4 par coloration directe avec dextramers CMH de classe II en est décrite. Sections cérébrales fraîchement coupées ont été obtenues à partir de souris EAE et colorées avec des cocktails contenant PLP 139-151 (spécifique) ou TMEV 70-86 (contrôle) dextramers et anti-CD4. Les panneaux supérieurs de la figure 1 montre l&#39;analyse LSCM de sections cérébrales costained avec P...

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In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

Le protocole pour détecter les cellules autoréactives T CD4 dans le cerveau et le cœur par coloration directe avec les grands complexes dextramers d&#39;histocompatibilité de classe II a été décrite dans le présent rapport. Pour une analyse complète, une méthode fiable pour énumérer les fréquences de cellules T CD4 + spécifiques de l&#39;antigène in situ est également conçu.

Détection in situ de autoréactifs T CD4 des cellules dans le cerveau et le cœur à l&#39;aide majeur d&#39;histocompatibilité Dextramers classe II

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

in-situ-detection-autoreactive-cd4-t-cells-brain-heart-using-major

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

11.6K vues.  University of Nebraska, Lincoln.  Le protocole pour détecter les cellules autoréactives T CD4 dans le cerveau et le cœur par coloration directe avec les grands complexes dextramers d'histocompatibilité de classe II a été décrite dans le présent rapport. Pour une analyse complète, une méthode fiable pour énumérer les fréquences de cellules T CD4 + spécifiques de l'antigène in situ est également conçu. 