עבודה זו נתמכת על ידי תכנית רולנד Junior העמית. המחברים מבקשים להביע את תודה למדענים ואנשי צוות במכון רולנד בהרווארד: כריס סטוקס על עזרתו בפיתוח, ההתקנה שהותקן בסיוע מחשב בקרת לחץ, דיאן Schaak, Ph.D. עבור קלטה לטיפול מדגם ביולוגי, וינפילד היל לפיתוח ההתקנה החשמלית, Alavaro סאנצ&#39;ז, Ph.D. למתן גישה לזרימת cytometer, סקוט בוויס, קני ספנסר ודון רוג&#39;רס לעיבוד רכיבי צנרת מכאניים הנדרשים להתקנת הלחץ. אדוני microfluidic היו מפוברקים במרכז למערכות ננו (CNS) באוניברסיטת הרווארד.

.1 תא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת 1 × 10 5 / מ&quot;ל תאים של שורת תאי סרטן שד גרורתי מד&quot;א-MB-231 בנפח של 10 מ&quot;ל לבקבוק T75 בתרבית רקמה בשל ליבוביץ L-15 בינוניים בתוספת 10% (v / v) בסרום שור העובר ו1 פניצילין, סטרפטומיצין%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה מד&quot;א-MB-231 תאים בחממה humidified על 37 מעלות צלזיוס עם 0% CO 2 בסביבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים לניסויים 2 ימים לאחר זריעה על ידי טיפול בתאים עם 0.25% טריפסין-EDTA למשך 2 דקות ולהשבית את הפעילות האנזימטית של טריפסין על ידי הוספת 8 מ&quot;ל של תקשורת הצמיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים גלולה על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות בגרמו 200 × וגלול בתמיסת מלח של Dulbecco פוספט (DPBS, 1x, ללא Ca 2 + וMg 2 +) לריכוז סופי של 5 × 5 10 תאים / מ&quot;ל. </li></ol> 2 עיצוב מכשיר וייצור הערה: המסכה, בדותות עובש אב ותהליך תוחם microchannel הוא להתנהל בתוך חדר נקי בזמן שניתן לבצע תהליך ליהוק microchannel polydimethylsiloxane (PDMS) על benchtop מעבדה רגיל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב מכשיר microfluidic כפי שמודגם באיור 1 עם AutoCAD. המכשיר צריך להיות מורכב של כניסה עם יציאות מרובות הזרקה, מסננים גסים ושני ערוצים מקבילים ישר מלבניים אינרציה התמקדות (L = 7 מ&quot;מ, W = 40 מיקרומטר, וH = 70 מיקרומטר). ערוץ ישר פרט מורכב 5 תאים electroporation, אשר ממוקמים 800 מיקרומטר מזה (W C = 400 מיקרומטר) עם שניים מהם דרך חורים עבור אלקטרודות אלומיניום. שני תאי electroporation transversally סמוכים חולקים את החור להאלקטרודה השלילית. שני ערוצים ישר למזג לשקע במורד הזרם של אזור electroporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמיר את קובץ CAD עם מיקרו דפוסים לקובץ GDSII באמצעות LinkCAD. לכתוב מיקרו דפוסים על 5 &quot;X 5&quot; photomask ריקבאמצעות סופר מסכת לייזר. לפתח את המסכה על ידי ביצוע הפרוטוקול של היצרן. הערה: תהליך פיתוח המסיכה כולל פיתוח photoresist, תחריט כרום ולהתנגד להסרת. לחלופין, מיקרו דפוסים מודפסים על שקיפות רזולוציה גבוהה (&gt; 20,000 dpi) ניתן לרכוש מיצרן צד שלישי ומשמש כphotomask. תכונות מיקרוסקופיות סופית על photomask צריכה להיות שקופות כדי להתאים את הקוטביות של photoresist שלילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפברק עובש הליהוק של עיצוב המכשיר תוך שימוש בטכניקות ליתוגרפיה רכה סטנדרטית 23 עם מעיל photoresist השלילי הסתובב על פרוסות סיליקון 4 אינץ ב2,000 סל&quot;ד כדי לקבל את העובי הסופי של 70 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Prebake הרקיק עם photoresist השלילי עבור 20 דקות על 95 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור את המסכה עם הרקיק ולחשוף למקור UV (17.4 mJ / 2 סנטימטר) ל80 שניות באמצעות aligner מסכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתח את הרקיק החשוף למשך 4 דקות במפתח SU-8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד אתעובי photoresist מפותח באמצעות profilometer משטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקפדנות לערבב 10: 1 יחס של אלסטומר לסוכן ריפוי (ערכת אלסטומר סיליקון) ויוצקים את התערובת על תבנית היציקה כדי ליצור העתקים PDMS. דגה אלסטומר הליהוק ל30 דקות ולרפא את תבנית היציקה עם אלסטומר degassed בתנור על 70 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Delaminate העתק PDMS נרפא עם דפוסי microchannel מחורי העובש ואגרוף להוספות פתחי הכניסה, יציאה ואלקטרודה באמצעות צבת סיכה. הערה: קוטר חוד החנית הרגיל של צבת הסיכה צריכה להיות 0.76 מ&quot;מ, מתאים לחוזקה מחזיק צינורות הצצה (OD של 1/32 &quot;) ואלקטרודות אלומיניום (OD של 0.029&quot;) במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור ערוצי microfluidic מוקפים העתקים PDMS מליטה לשקופיות זכוכית שטופלו בשואב חמצן פלזמה ל7 שניות בלחץ חלקי כוח וחמצן בתדר רדיו של 75 W ו500 mTorr, בהתאמה. </li></ol> .3 ניסויי זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנסאלקטרודות אלומיניום (0.029 &quot;OD) וצינורות הצצה לשקע (1/32&quot; OD) למקומות המיועדים באמצעות חורים בmicrochannel (ראו איור 3 ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיבור הציוד החשמלי 18 האחראי ליצירת פולסים מרובע גל קצר במתח גבוה לאלקטרודות האלומיניום (ראה איור 3 ג) שנמצאים בקשר עם זורם פתרונות בעובש PDMS. הערה: הציוד צריך להיות מורכב של גנרטור דופק ומגבר מתח גבוה שנבנה בבית 18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ארבעה 50 צינורות מ&quot;ל צנטריפוגות בנפרד מכילים DPBS, פתרונות עם תאים ומולקולות ביולוגיים, ולצרף כל צינור לבעל הבקבוקון שלו בהתאמה מחוברת למערכת בקרת זרימת פנאומטי (ראה איור 3 א). 18 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיבור צינורות הצצה כניסה ממחזיקי הבקבוקון לתוך חורי כניסה המתאימים במכשיר microfluidic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את סדר הגודל של פולסים מרובעים גל, V, ל100 V כדי שיהיה לי אוף החשמליכוח ld, דואר E = V / L, על פני תא electroporation להיות שווה ערך ל0.7 ק ו / סנטימטר. הערה: הנה, דואר L הוא המרחק בין שתי נקודות שבן אלקטרודות החיוביות ושליליות נמצאות בקשר עם הפתרון הזורם (ראה איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את וסת לחץ 40 psi. הערה:. מקור חנקן להתאמה באופן ידני אחת משמש לחצים באופן אחיד את כל בקבוקוני המדגם וסעפת במהירות גבוהה היא מנוצלת להפעלה בזמן יציאות פתרון בודדות באמצעות תוכנת LabVIEW שהותקן 18 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבקרת שסתום, לפתוח את תוכנת LabVIEW שהותקן שכותרת Valve ראנר, ולחץ לרוץ מהתפריט הנפתח הזכאי לפעול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל סתום על ידי לחיצה על כל אחד מסמלים שסתום המתאימים. הערה: סמל השסתום צריך להפוך ירוק כאשר הוא מופעל. לחיצה על הסמל הפעיל לבטל ולסגור את הברז. סמל השסתום הסגור צריכה להאפיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את השסתום למאגר DPBS (כלומר., פתרון כביסה) לראש מהירות זרימה הנדרשת לדור מערבולת תא לכידה יציב ל1.5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור את יציאת פתרון הפעילה מפתרון הכביסה לפתרון התא לתאי מלכודת בתא electroporation ל30 שניות (כלומר, צעד לכידת התאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזרום פתרונות הכביסה ותא הן באמצעות המכשיר בו זמנית עבור 10 שניות לפני צעד לכידת התאים כדי להבטיח זרימה בלא הפרעה במהלך שלב מיתוג הפתרון. הערה: שיתוף זרימת צעד קצר זה יש לחזור בכל שלב מיתוג פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את יציאת הכביסה ולשטוף את המכשיר ל20 שניות כדי להסיר שאינם לכודים תאים מזהמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק התמיסה המכילה את המולקולה הראשונה של ריבית (0.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של 3,000 מולקולות דה dextran הניטרלי ואניוני או 1.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של 70,000 מולקולת dextran הניטרלי Da) לתוך המכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל חמישה פולסים קצרים (Δt = 30 אלפיות שניים עם 2 מרווחי שניות) מייד לאחר ההזרקה שלפתרון ומולקולרי לפקח על הגודל ומשך הזמן של פולסים החשמליים המיושמים בזמן אמת באמצעות אוסצילוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיימסר חזור על שלב 3.10 כמה פעמים שמספר מולקולות נוספות. עבור כל משלוח מולקולרי, תאי דגירה ל100 של בפתרון המולקולרי אז לשטוף את המכשיר עם פתרון הכביסה ל100 של להסיר מולקולות עודפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר את התאים בצלחת 96 היטב לניתוח במורד הזרם על ידי הורדת לחץ ההפעלה מתחת ל -5 psi. הערה: כ 100 μl של פתרון עם 100 תאים שנאספו מכל מהדורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הניסוי על השלבים 3.9 דרך 3.16 שלוש פעמים כדי לאסוף מספיק תאים לcytometry זרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 96 גם הצלחת המכילה תאי מעובד במשך 5 דקות ב228 × גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant המכיל מולקולות ניאון עודפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים בDPBS לניתוח cytometry זרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי עומס בזרימה cytometer עבור U המולקולריptake ניתוח יעילות. </li></ol>

<ol>
	<li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+Past+present+and+future.">Electroporation Past present and future.</a> Dev Growth Diff. 55, 15-19 (2013).</li><li>Geng, T., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+electroporation+for+cellular+analysis+and+delivery.">Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery.</a> Lab Chip. 13, 3803-3821 (2013).</li><li>Shahini, M., van Wijngaarden, F., Yeow, J. T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+electro-microfluidic+channel+for+single+cell+electroporation.">Fabrication of electro-microfluidic channel for single cell electroporation.</a> Biomedical Microdevices. 15, 759-766 (2013).</li><li>Neumann, E., Toensing, K., Kakorin, S., Budde, P., Frey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+electroporative+dye+uptake+by+mouse+B+cells.">Mechanism of electroporative dye uptake by mouse B cells.</a> Biophysical Journal. 74, 98-108 (1998).</li><li>Jaroszeski, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+of+anticancer+agents+mediated+by+electroporation+in+vitro.">Toxicity of anticancer agents mediated by electroporation in vitro.</a> Anti-Cancer Drugs. 11, 201-208 (2000).</li><li>Buntru, M., Gartner, S., Staib, L., Kreuzaler, F., Schlaich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+multiple+transgenes+to+plant+cells+by+an+improved+version+of+MultiRound+Gateway+technology.">Delivery of multiple transgenes to plant cells by an improved version of MultiRound Gateway technology.</a> Transgenic Res. 22, 153-167 (2013).</li><li>Mir, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+gene+transfer+into+skeletal+muscle+mediated+by+electric+pulses.">High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4262-4267 (1999).</li><li>Heller, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intradermal+delivery+of+interleukin-12+plasmid+DNA+by+in+vivo+electroporation.">Intradermal delivery of interleukin-12 plasmid DNA by in vivo electroporation.</a> DNA Cell Biol. 20, 381-381 (2001).</li><li>Boukany, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanochannel+electroporation+delivers+precise+amounts+of+biomolecules+into+living+cells.">Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells.</a> Nat Nanotechnol. 6, 747-754 (2011).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+Effects+of+Nanosecond+Pulsed+Electric+Fields+Combined+with+Low+Concentration+of+Gemcitabine+on+Human+Oral+Squamous+Cell+Carcinoma.">Synergistic Effects of Nanosecond Pulsed Electric Fields Combined with Low Concentration of Gemcitabine on Human Oral Squamous Cell Carcinoma.</a> In Vitro PLoS One. 7, (2012).</li><li>Kim, M. J., Kim, T., Cho, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+electroporation+chip+using+multiple+electric+field+zones+in+a+single+channel.">Cell electroporation chip using multiple electric field zones in a single channel.</a> Appl Phys Lett. 101, (2012).</li><li>Wang, S. N., Lee, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-/nanofluidics+based+cell+electroporation.">Micro-/nanofluidics based cell electroporation.</a> Biomicrofluidics. 7, (2013).</li><li>Sharei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vector-free+microfluidic+platform+for+intracellular+delivery.">A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery.</a> Proc. Natl Acad Sci USA. 110, 2082-2087 (2013).</li><li>Kim, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+human+neural+stem+cells+by+OCT4.">Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4.</a> Nature. 461, U649-U693 (2009).</li><li>Ozbas-Turan, S., Aral, C., Kabasakal, L., Keyer-Uysal, M., Akbuga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-encapsulation+of+two+plasmids+in+chitosan+microspheres+as+a+non-viral+gene+delivery+vehicle.">Co-encapsulation of two plasmids in chitosan microspheres as a non-viral gene delivery vehicle.</a> J Pharm Pharm Sci. 6, 27-32 (2003).</li><li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, U311-U313 (2007).</li><li>Hur, S. C., Mach, A. J., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+size-based+rare+cell+enrichment+using+microscale+vortices.">High-throughput size-based rare cell enrichment using microscale vortices.</a> Biomicrofluidics. 5, (2011).</li><li>Yun, H. Y., Hur, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+multi-molecule+delivery+using+vortex-assisted+electroporation.">Sequential multi-molecule delivery using vortex-assisted electroporation.</a> Lab Chip. 13, 2764-2772 (2013).</li><li>Gehl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+theory+and+methods,+perspectives+for+drug+delivery,+gene+therapy+and+research.">Electroporation theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research.</a> Acta Physiol Scand. 177, 437-447 (2003).</li><li>Wang, J., Zhan, Y. H., Ugaz, V. M., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vortex-assisted+DNA+delivery.">Vortex-assisted DNA delivery.</a> Lab Chip. 10, 2057-2061 (2010).</li><li>Jia, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nonviral+minicircle+vector+for+deriving+human+iPS+cells.">A nonviral minicircle vector for deriving human iPS cells.</a> Nature Methods. 7, U146-U197 (2010).</li><li>Dunbar, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+to+hematopoietic+stem+cells+Implications+for+gene+therapy+of+human+disease.">Gene transfer to hematopoietic stem cells Implications for gene therapy of human disease.</a> Annual Review of Medicine. 47, 11-20 (1996).</li><li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography.">Soft lithography.</a> Angew Chem-Int Edit. 37, 551-575 (1998).</li><li>Graziadei, L., Burfeind, P., Barsagi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+Unlabeled+Proteins+into+Living+Cells+by+Electroporation+and+Isolation+of+Viable+Protein-Loaded+Cells+Using+Dextran+Fluorescein+Isothiocyanate+as+a+Marker+for+Protein-Uptake.">Introduction of Unlabeled Proteins into Living Cells by Electroporation and Isolation of Viable Protein-Loaded Cells Using Dextran Fluorescein Isothiocyanate as a Marker for Protein-Uptake.</a> Anal Biochem. 194, 198-203 (1991).</li><li>Dimitrov, D. S., Sowers, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Electroporation-Fast+Molecular-Exchange+by+Electroosmosis.">Membrane Electroporation-Fast Molecular-Exchange by Electroosmosis.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1022, 381-392 (1990).</li><li>Sukharev, S. I., Klenchin, V. A., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev Yu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+electrophoretic+DNA+transfer+into+cells.+The+effect+of+DNA+interaction+with+electropores.">Electroporation and electrophoretic DNA transfer into cells. The effect of DNA interaction with electropores.</a> Biophysical Journal. 63, 1320-1327 (1992).</li><li>Glogauer, M., McCulloch, C. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+large+molecules+into+viable+fibroblasts+by+electroporation+Optimization+of+loading+and+identification+of+labeled+cellular+compartments.">Introduction of large molecules into viable fibroblasts by electroporation Optimization of loading and identification of labeled cellular compartments.</a> Experimental Cell Research. 200, 227-234 (1992).</li><li>Verspohl, E. J., KaiserlingBuddemeier, I., Wienecke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introducing+specific+antibodies+into+electropermeabilized+cells+is+a+valuable+tool+for+eliminating+specific+cell+functions.">Introducing specific antibodies into electropermeabilized cells is a valuable tool for eliminating specific cell functions.</a> Cell Biochemistry and Function. 15, 127-134 (1997).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

עם הפלטפורמה החדשה parallelized electroporation, השיפור של פי 10 בתפוקה ויעילות של משלוח מרובה מולקולה הושגה, בנוסף לכל היתרונות שהמערכת אחת קאמרית שפותחה בעבר מספקת. 18 יתרונות זמינים בעבר כוללים (i) לפני טיהור יעד תאים עם התפלגות אחידה גודל לשיפור כדאיות, (ii) שליטת מינון מולקו...

בשנים האחרונות, השימוש בפולסים חשמליים כדי להקל על משלוח cytosolic של מולקולות תאיים הפך אמצעי אטרקטיבי של מניפולציה תאי יונקים. 1 תהליך זה, המכונה גם electroporation, הפיך permeabilizes קרום התא, המאפשר למולקולות בלתי חדירים קרום מטבע כדי לקבל גישה לסביבה תאית של התאים. כי כמעט כל מולקולה יכולה להיות מוחדר cytosol באמצעות הנקבוביות שנוצרו זמניות בקרום של כל סוג של תאים באמצעות electroporation, הטכניקה דווחה כיותר לשחזור, ישים באופן אוניוורסלי, ויעיל יותר מאשר שיטות אחרות, כוללים וירוס בתיווך, כימי וגישות אופטיות. 2-3 טכניקה זו נוצלה להציג את מולקולות ניאון, 4 תרופות 5 וחומצות גרעין 6-7, תוך שמירה על תאי קיימא ושלמים. בהתחשב ביתרונות הללו, electroporation אומצה כעבודה משותפתטכניקת atory לtransfection DNA, in vivo ריפוי גנטי 8 ומחקרי חיסון תא. היא, לעומת זאת, עדיין קשה למערכות electroporation קונבנציונליות כדי להשיג בו זמנית יעילות מעשית ויכולת קיום לדגימות עם הטרוגניות גדולה בגודלם ועוצמת השדה החשמלי הנדרשת לelectroporation המוצלח בקורלציה הדוקה עם הקוטר של התא. יתר על כן, מערכות אלה אינן מאפשרים שליטה מדויקת של הכמויות מולקולריות מרובות מועברת עקב הסתמכות על תהליך משלוח בתפזורת סטוכסטיים מולקולרי. 9 על מנת לטפל בבעיות אלה, קבוצות רבות פיתחו פלטפורמות electroporation microfluidic, המציעות את היתרון של מתחי poration נמוכים יותר, יעילות טובה יותר transfection, ירידה גדולה בתמותת תאים, והיכולת לספק מולקולות מרובות. 10-13 יתרונות אלה התאפשרו הודות לטביעות הרגליים הקטנות של מערכות electroporation microscale אלקטרודה שהמגרשאורכים הם תת מילימטרים, באופן דרמטי ירידת מתח הנדרש למשלוח מוצלח. יתר על כן, מערכות electroporation microscale אלה יכולים להשיג הפצת שדה חשמלית אחידה ובמהירות לפזר חום שנוצר, מניב תמותת תא מופחת תוך שיפור יעילות משלוח. הניצול של חומרים שקופים לשבבים אלה נוספים מאפשר בתצפית באתרו של תהליך electroporation לשינויים פרמטר הפקודה. 2,12 עם זאת, שליטה במינון מדויקת ושליטה פרמטר מולקולרית ותאית תלויה, הנדרשת למחקר חדש ויישומים טיפוליים, 6, 14-16 עדיין נותר לא פתור. עבודה זו מציגה מערכת microfluidic בסיוע מערבולת electroporation, מסוגל לספק מולקולות מרובות ברצף לאוכלוסייה זהה שנבחר מראש של תאי מטרה. תאים עם התפלגות גודל האחיד מבודדים לפני electroporation באמצעות si שדווח בעברמנגנון ze סלקטיבי השמנה. 17-18 על ידי בעל התפלגות אחידה בגודל, פחות וריאציה ביעילות electroporation וכדאיות משופרת לעוצמת שדה חשמלית נתון הושגו. 19 יתר על כן, ברציפות התססה תאים לכודים באמצעות מערבולות microscale אפשר למסירה אחידה של מולקולות על פני cytosol כל, בהסכם עם התוצאות שדווחה בעבר באמצעות פלטפורמה אחרת electroporation בסיוע מערבולת. 20 כדי להוכיח כי מערכת זו תהיה ישימה למגוון רחב של המולקולות בשימוש הנרחבים ביישומים ביולוגיים, מקרומולקולות עם מגוון רחב של משקלים מולקולריים הועברו ל תאי סרטן השד גרורתי. בנוסף, בעזרת ניטור תהליך בזמן אמת, עבודה זו מספקת ראיות נוספות כדי לשים קץ לוויכוח הארוך הימים בנוגע למנגנון של משלוח מולקולרי לבמהלך electrporation, מכיוון שרוב תושבי אלקטרופורזה בתיווך מול בתיווך דיפוזיה. 14 </sup&gt; בניגוד למערכות electroporation אחרים, פלטפורמה ייחודית זה מספקת יתרונות בשילוב של מסירה מדויקת מרובה מולקולה, יעילות אספקה ​​מולקולרית גבוהה, תמותת תאים מינימאלית, תוחלת רחבה של גודל וחיובים של מולקולות נמסרו, כמו גם להדמיה בזמן אמת של electroporation תהליך. בהתחשב ביכולות אלה, מערכת electroporation פיתחה יש פוטנציאל מעשי ככלי תכליתי ללימודי תכנות מחדש של תאים, אספקת יישומי 6,14,21-22 תרופה 10,19 ויישומים הדורשים להבנה מעמיקה של מנגנוני אספקה ​​מולקולריים electroporation.

<table><tbody><tr><td>MDA-MB-231 cancer cell line</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&amp;rsquo;s L-15 Medium</td><td>Cellgro, Mediatech, Inc.</td><td>10-045-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s phosphate buffered saline (DPBS)</td><td>Cellgro, Mediatech, Inc.</td><td>21-030</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Flow Cytometer easyCyte HT</td><td>Millipore</td><td>0500-4008</td><td></td></tr><tr><td>Oxygen Plasma Cleaner</td><td>Technics Micro-RIE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dektak 6M surface profiler</td><td>Veeco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KMPR 1050</td><td>Microchem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compressed Nitrogen gas</td><td>Airgas</td><td>NI 300</td><td></td></tr><tr><td>High Pressure Regulator</td><td>McMaster-Carr</td><td>6162K22</td><td></td></tr><tr><td>Downstream regulator</td><td>McMaster-Carr</td><td>4000K563</td><td></td></tr><tr><td>High-speed 3/2way-8 valve manifold</td><td>Festo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inline Check Valve</td><td>Idex Health and Science</td><td>CV3320</td><td></td></tr><tr><td>5/32&quot; OD x 3/32&quot; ID Polyurethan tubes</td><td>Pneumadyne</td><td>PU-156F-0</td><td></td></tr><tr><td>1/4&quot; OD X 0.17&quot; ID Polyurethan tubes</td><td>Pneumadyne</td><td>PU-250PB-4</td><td></td></tr><tr><td>1/16&quot; PEEK tubings</td><td>Festo</td><td>P1533</td><td></td></tr><tr><td>1/32&quot; PEEK tubings</td><td>Idex Health and Science</td><td>P1569</td><td></td></tr><tr><td>PEEK tubing unions</td><td>Idex Health and Science</td><td>P881</td><td></td></tr><tr><td>Pulse Generator</td><td>HP</td><td>8110A</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum Wire</td><td>Bob Martin Company</td><td>6061 ALUM</td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>Agilent</td><td>DSO3062A</td><td></td></tr><tr><td>50 ml centrifuge tubes</td><td>VWR</td><td>21008-178</td><td></td></tr><tr><td>15 ml centrifuge tube</td><td>VWR</td><td>21008-216</td><td></td></tr><tr><td>T75 culture flask</td><td>VWR</td><td>82050-862</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Tetramethylrhodamine, 3,000 MW, Anionic</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>D3307</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Tetramethylrhodamine, 70,000 MW, Neutral&amp;nbsp;</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>D1819</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Texas Red, 3,000 MW, Neutral</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>D3329</td><td></td></tr></tbody></table>

microscale vortex-assisted electroporator for sequential molecular delivery

Electroporation זכתה לתשומת לב הולכת וגובר בשנים האחרונות, כי זה הוא טכניקה חזקה מאוד להחדרה פיזית בדיקות מולקולריות אקסוגני שאינו permeant לתוך תאים. עבודה זו מדווחת פלטפורמת electroporation microfluidic מסוגל לבצע משלוח מולקולה מרובה לתאי יונקים עם שליטה מדויקת ומולקולרית תלויה פרמטר. היכולת של המערכת לבודד את התאים עם התפלגות גודל אחידה מאפשרת פחות וריאציה ביעילות electroporation לעוצמת שדה חשמלית נתון; מכאן משופר כדאיות מדגם. יתר על כן, תכונת ההדמיה תהליך שלה מאפשרת להתבוננות בתהליך הניאון המולקולרי הספיגה בזמן אמת, המאפשר התאמות פרמטר מסירה מולקולריות מהירה באתר לשיפור יעילות. כדי להראות את היכולות עצומות של הפלטפורמה דיווחה, מקרומולקולות עם גדלים שונים ומטענים חשמליים (למשל, Dextran עם MW של 3,000 ו -70,000 Da) היהנמסר לתאי סרטן השד גרורתי עם יעילות גבוהה משלוח (&gt; 70%) עבור כל המולקולות שנבדקו. הפלטפורמה שפותחה הוכיחה את הפוטנציאל שלה לשימוש בהרחבה של תחומי מחקר שבו טכניקות electroporation יכולות להיות על שבב מועילות.

Electroporator microfluidic המקביל פיתח נמסר מקרומולקולות עם גדלים מגוונים ומטענים חשמליים לתוך תאי חיים סרטן השד גרורתי. משלוח מולקולרי מוצלח נקבע איכותי על ידי מעקב אחר שינויים בעוצמת ניאון של electroporated תאים המקיפים באתר ואושר על ידי מדידות כמותיות באמצעות ניתוח cytometry זרימ...

Watch this Scientific Journal Video about Microscale Vortex-assisted Electroporator for Sequential Molecular Delivery at JoVE.com

Microscale Vortex-assisted Electroporator for Sequential Molecular Delivery

פלטפורמת electroporation סייע מערבולת microfluidic פותחה למסירה רציפה של מולקולות מרובות לתוך אוכלוסיות תאים זהות עם שליטה מדויקת ובלתי תלויה מינון. electroporation צעד טיהור תא המטרה שקדמו מבוסס גודל של המערכת סייע לשפר את יעילות אספקה ​​מולקולרית וכדאיויות תא מעובד.

Electroporator למשלוח סדרתית מולקולרי בסיוע וורטקס microscale

Electroporation has received increasing attention in the past years, because it is a very powerful technique for physically introducing non-permeant ...

microscale-vortex-assisted-electroporator-for-sequential-molecular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.6K Views.  Harvard University.  פלטפורמת electroporation סייע מערבולת microfluidic פותחה למסירה רציפה של מולקולות מרובות לתוך אוכלוסיות תאים זהות עם שליטה מדויקת ובלתי תלויה מינון. electroporation צעד טיהור תא המטרה שקדמו מבוסס גודל של המערכת סייע לשפר את יעילות אספקה ​​מולקולרית וכדאיוי?...

Video: Microscale Vortex-assisted Electroporator for Sequential Molecular Delivery

Taking Advantage of Reduced Droplet-surface Interaction to Optimize Transport of Bioanalytes in Digital Microfluidics

Digital microfluidics (DMF), a technique for manipulation of droplets, is a promising alternative for the development of &#8220;lab-on-a-chip&#8221; platforms. Often, droplet motion relies on the wetting of a surface, directly associated with the application of an electric field; surface interactions, however, make motion dependent on droplet contents, limiting the breadth of applications of the technique.
Some alternatives have been presented to minimize this dependence. However, they rely on the addition of extra chemical species to the droplet or its surroundings, which could potentially interact with droplet moieties. Addressing this challenge, our group recently developed Field-DW devices to allow the transport of cells and proteins in DMF, without extra additives.
Here, the protocol for device fabrication and operation is provided, including the electronic interface for motion control. We also continue the studies with the devices, showing that multicellular, relatively large, model organisms can also be transported, arguably unaffected by the electric fields required for device operation.

The protocol for fabrication and operation of field dewetting devices (Field-DW) is described, as well as the preliminary studies of the effects of electric fields on droplet contents.

ניצול של אינטראקציה אגל-פני השטח מופחת למטב תחבורה של Bioanalytes במיקרופלואידיקה הדיגיטלי

Digital microfluidics (DMF), a technique for manipulation of droplets, is a promising alternative for the development of &#8220;lab-on-a-chip&#8221; ...

Engineering

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often performed at low throughput, it is moreover time-consuming and error-prone, even more so when multiplexing several plasmids. We developed an easy, fast, and accurate method to perform cell transfection in a 384-well plate layout using acoustic droplet ejection (ADE) technology. The nanodispenser device used in this study&#160;is based on this technology and allows precise nanovolume delivery at high speed from a source well plate to a destination one. It can dispense and multiplex DNA and transfection reagent according to a predesigned spreadsheet. Here we present an optimal protocol to perform ADE-based high-throughput plasmid transfection which makes it possible to reach an efficiency of up to 90% and a nearly 100% cotransfection in cotransfection experiments. We extend initial work by proposing a user-friendly spreadsheet-based macro, able to manage up to four plasmids/wells from a library containing up to 1,536 different plasmids, and a tablet-based pipetting guide application. The macro designs the necessary template(s) of the source plate(s) and generates the ready-to-use files for the nanodispenser and tablet-based application. The four-steps transfection protocol involves i) a diluent dispense with a classical liquid handler, ii) plasmid distribution and multiplexing, iii) a transfection reagent dispense by the nanodispenser, and iv) cell plating on the prefilled wells. The described software-based control of ADE plasmid multiplexing and transfection allows even nonspecialists in the field to perform a reliable cell transfection in a fast and safe way. This method enables rapid identification of optimal settings for a given cell type and can be transposed to higher-scale and manual approaches. The protocol eases applications, such as human ORFeome protein (set of open reading frames [ORFs] in a genome) expression or CRISPR-Cas9-based gene function validation, in nonpooled screening strategies.

This protocol describes high-throughput plasmid transfection of mammalian cells in a 384-well plate using acoustic droplet ejection technology. The time-consuming, error-prone DNA dispensing and multiplexing, but also the transfection reagent dispensing, are software-driven and performed by a nanodispenser device. The cells are then seeded in these prefilled wells.

התפוקה הגבוהה של DNA פלאגיסינג ומעבר באמצעות טכנולוגיית ננו-לחילוק אקוסטית

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...

Genetics

High Speed Droplet-based Delivery System for Passive Pumping in Microfluidic Devices

A novel microfluidic system has been developed that uses the phenomenon of passive pumping along with a user controlled droplet based fluid delivery system. Passive pumping is the phenomenon by which surface tension induced pressure differences drive fluid movement in closed channels. The automated fluid delivery system consists of a set of voltage controlled valves with micro-nozzles connected to a fluid reservoir and a control system. These voltage controlled valves offer a volumetrically precise way to deliver fluid droplets to the inlet of a microfluidic device in a high frequency manner. Based on the  dimensions demonstrated in the current study example, the system is capable of flowing 4 milliliters per minute (through a 2.2mm by 260um cross-sectional channel). Based on these same channel dimensions, fluid exchange of a point inside the channel can be achieved in as little as eight milliseconds. It is observed that there is interplay between momentum of the system (imparted by a combination of the droplets created by the valves and the fluid velocity in the channel), and the surface tension of the liquid. Where momentum provides velocity to the fluid flow (or vice-versa), equilibration of surface tension at the inlet provides a sudden stop to any flow. This sudden stop allows the user to control the flow characteristics of the channel and opens the door for a variety of biological applications, ranging anywhere from reagent delivery to drug-cell studies. It is also observed that when nozzles are aimed at the inlet at shallow angles, the droplet momentum can cause additional interesting fluid phenomena, such as mixing of multiple droplets in the inlet.

A novel microfluidic system has been developed using the phenomenon of passive pumping and a user controlled fluid delivery system. This microfluidic system has the potential to be used in a wide variety of biological applications given its low cost, ease of use, volumetric precision, high speed, repeatability and automation.

מהירות גבוהה Droplet מבוססי משלוח מערכת פסיבי שאיבה מכשירים microfluidic

A novel microfluidic system has been developed that uses the phenomenon of passive pumping along with a user controlled droplet based fluid delivery ...

Biology

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

פלטפורמת Microfluidic על קוליים בתפוקה של רצף הגנום בתא יחיד

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and morphology of the obtained microsphere. A microsphere copolymerized with an acrydite-DNA probe was successfully fabricated. Different methods such as asymmetric PCR, exonuclease digestion, and isolation on streptavidin-coated magnetic beads can be used to synthesize single-stranded DNA (ssDNA). However, these methods cannot efficiently use large amounts of highly purified ssDNA. Here, we describe a microsphere-PCR protocol detailing how ssDNA can be efficiently amplified and separated from dsDNA simply by pipetting from a PCR reaction tube. The amplification of ssDNA can be applied as potential reagents for the DNA microarray and DNA-SELEX (Systematic evolution of ligands by exponential enrichment) processes.

This work provides a method for the fabrication of droplet-based microfluidic platforms and the application of polyacrylamide microspheres for microsphere-PCR amplification. The microsphere-PCR method makes it possible to obtain single-stranded DNA amplicons without separating double-stranded DNA.

גישה Microfluidic המבוססות על Droplet ו ננו-ספירה-PCR הגברה עבור חד גדילי DNA Amplicons

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic regulatory circuits. The analysis of synthetic genetic regulatory networks in vivo is time consuming and suffers from a lack of environmental control, with exogenous synthetic components interacting with host processes resulting in undesired behavior. To overcome these issues, cell-free characterization of novel circuitry is becoming more prevalent. In vitro transcription and translation (IVTT) mixtures allow the regulation of the experimental environment and can be optimized for each unique system. The protocols presented here detail the fabrication of a multilayer microfluidic device that can be utilized to sustain IVTT reactions for prolonged durations. In contrast to batch reactions, where resources are depleted over time and (by-) products accumulate, the use of microfluidic devices allows the replenishment of resources as well as the removal of reaction products. In this manner, the cellular environment is emulated by maintaining an out-of-equilibrium environment in which the dynamic behavior of gene circuits can be investigated over extended periods of time. To fully exploit the multilayer microfluidic device, hardware and software have been integrated to automate the IVTT reactions. By combining IVTT reactions with the microfluidic platform presented here, it becomes possible to comprehensively analyze complex network behaviors, furthering our understanding of the mechanisms that regulate cellular processes.

The fabrication process of a PDMS-based, multilayer, microfluidic device that allows in vitro transcription and translation (IVTT) reactions to be performed over prolonged periods is described. Furthermore, a comprehensive overview of the hardware and software required to automate and maintain these reactions for prolonged durations is provided.

פלטפורמת מיקרופלואידיג רב שכבתית לצורך הובלה של ביטוי גנים ממושך ללא תא

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. For example, electroporation has been used with great success to study neural and retinal development in Xenopus, chicken and mouse 1-10. However, it is important to note that in all of these studies, investigators were not targeting soft tissues. Because we are interested in craniofacial development, we adapted a method to target facial mesenchyme.
When we searched the literature, we found, to our surprise, very few reports of successful gene transfer into cartilaginous tissue. The majority of these studies were gene therapy studies, such as siRNA or protein delivery into chondrogenic cell lines, or, animal models of arthritis 11-13. In other systems, such as chicken or mouse, electroporation of facial mesenchyme has been challenging (personal communications, Dept of Craniofacial Development, KCL). We hypothesized that electroporation into procartilaginous and cartilaginous tissues in Xenopus might work better. In our studies, we show that gene transfer into the facial cartilages occurs efficiently at early stages (28), when the facial primordium is still comprised of soft tissue prior to cartilage differentiation.
Xenopus is a very accessible vertebrate system for analysis of craniofacial development. Craniofacial structures are more readily visible in Xenopus than in any other vertebrate model, primarily because Xenopus embryos are fertilized externally, allowing analyses of the earliest stages, and facilitating live imaging at single cell resolution, as well as reuse of the mothers 14. Among vertebrate models developing externally, Xenopus is more useful for craniofacial analysis than zebrafish, as Xenopus larvae are larger and easier to dissect, and the developing facial region is more accessible to imaging than the equivalent region in fish. In addition, Xenopus is evolutionarily closer to humans than zebrafish (&tilde;100 million years closer) 15. Finally, at these stages, Xenopus tadpoles are transparent, and concurrent expression of fluorescent proteins or molecules will allow easy visualization of the developing cartilages. We anticipate that this approach will allow us to rapidly and efficiently test candidate molecules in an in vivo model system.

Craniofacial cartilages develop in close contact with other tissues and are difficult to manipulate in live animals. We are using electroporation to deliver molecular tools during growth of the craniofacial skeleton while bypassing early embryonic effects. This approach will allow us to efficiently test candidate molecules in vivo.

Electroporation של Mesenchyme Craniofacial

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern for governments, industries and medical professionals worldwide. For example, EHECs, combined with Shigella, are responsible for the deaths of approximately 325,000 children each year and are particularly prevalent in the developing world where laboratory-based identification, common in the United States, is unavailable 1. The development and distribution of low cost, field-based, point-of-care tools to aid in the rapid identification and/or diagnosis of pathogens or disease markers could dramatically alter disease progression and patient prognosis. We have developed a tool to isolate nucleic acids and proteins from a sample by solid-phase extraction (SPE) without electricity or associated laboratory equipment 2. The isolated macromolecules can be used for diagnosis either in a forward lab or using field-based point-of-care platforms. Importantly, this method provides for the direct comparison of nucleic acid and protein data from an un-split sample, offering a confidence through corroboration of genomic and proteomic analysis.
Our isolation tool utilizes the industry standard for solid-phase nucleic acid isolation, the BOOM technology, which isolates nucleic acids from a chaotropic salt solution, usually guanidine isothiocyanate, through binding to silica-based particles or filters 3. CUBRC's proprietary solid-phase extraction chemistry is used to purify protein from chaotropic salt solutions, in this case, from the waste or flow-thru following nucleic acid isolation4.
By packaging well-characterized chemistries into a small, inexpensive and simple platform, we have generated a portable system for nucleic acid and protein extraction that can be performed under a variety of conditions. The isolated nucleic acids are stable and can be transported to a position where power is available for PCR amplification while the protein content can immediately be analyzed by hand held or other immunological-based assays. The rapid identification of disease markers in the field could significantly alter the patient's outcome by directing the proper course of treatment at an earlier stage of disease progression. The tool and method described are suitable for use with virtually any infectious agent and offer the user the redundancy of multi-macromolecule type analyses while simultaneously reducing their logistical burden.

A tool and chemistries are described to sequentially isolate nucleic acids followed by proteins from a sample without the need for electricity. The tool consists of a sorbent held within a transfer pipette while the isolation chemistries are based on solid-phase extraction principles. The isolated macromolecules can be analyzed by immuno-based and PCR-based assays.

חשמל חינם, חומצות גרעין רצופות ובידוד חלבון

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

The Fabrication and Operation of a Continuous Flow, Micro-Electroporation System with Permeabilization Detection

Current therapeutic innovations, such as CAR-T cell therapy, are heavily reliant on viral-mediated gene delivery. Although efficient, this technique is accompanied by high manufacturing costs, which has brought about an interest in using alternative methods for gene delivery. Electroporation is an electro-physical, non-viral approach for the intracellular delivery of genes and other exogenous materials. Upon the application of an electric field, the cell membrane temporarily allows molecular delivery into the cell. Typically, electroporation is performed on the macroscale to process large numbers of cells. However, this approach requires extensive empirical protocol development, which is costly when working with primary and difficult-to-transfect cell types. Lengthy protocol development, coupled with the requirement of large voltages to achieve sufficient electric-field strengths to permeabilize the cells, has led to the development of micro-scale electroporation devices. These micro-electroporation devices are manufactured using common microfabrication techniques and allow for greater experimental control with the potential to maintain high throughput capabilities. This work builds off a microfluidic-electroporation technology capable of detecting the level of cell membrane permeabilization at a single-cell level under continuous flow. However, this technology was limited to 4 cells processed per second, and thus a new approach for increasing the system throughput is proposed and presented here. This new technique, denoted as cell-population-based feedback control, considers the cell permeabilization response to a variety of electroporation pulsing conditions and determines the best-suited electroporation pulse conditions for the cell type under test. A higher-throughput mode is then used, where this 'optimal' pulse is applied to the cell suspension in transit. The steps for fabricating the device, setting up and running the microfluidic experiments, and analyzing the results are presented in detail. Finally, this micro-electroporation technology is demonstrated by delivering a DNA plasmid encoding for green fluorescent protein (GFP) into HEK293 cells.

This protocol describes the microfabrication techniques required to build a lab-on-a-chip, microfluidic electroporation device. The experimental setup performs controlled, single-cell-level transfections in a continuous flow and can be extended to higher throughputs with population-based control. An analysis is provided showcasing the ability to electrically monitor the degree of cell membrane permeabilization in real-time.

ייצור והפעלה של זרימה רציפה, מערכת מיקרו-אלקטרופורציה עם זיהוי חלחול

Current therapeutic innovations, such as CAR-T cell therapy, are heavily reliant on viral-mediated gene delivery. Although efficient, this technique is ...

מכשיר מיקרופלואידי לבידוד שלפוחית חוץ-תאי רציף משתן אנושי

Single Step Isolation of Extracellular Vesicles from Large-Volume Samples with a Bifurcated A4F Microfluidic Device

Extracellular vesicles (EVs) hold immense potential for various biomedical applications, including diagnostics, drug delivery, and regenerative medicine. Nevertheless, the current methodologies for isolating EVs present significant challenges, such as complexity, time consumption, and the need for bulky equipment, which hinders their clinical translation. To address these limitations, we aimed to develop an innovative microfluidic system based on cyclic olefin copolymer-off-stoichiometry thiol-ene (COC-OSTE) for the efficient isolation of EVs from large-volume samples in a continuous manner. By utilizing size and buoyancy-based separation, the technology used in this study achieved a significantly narrower size distribution compared to existing approaches from urine and cell media samples, enabling the targeting of specific EV size fractions in future applications. Our innovative COC-OSTE microfluidic device design, utilizing bifurcated asymmetric flow field-flow fractionation technology, offers a straightforward and continuous EV isolation approach for large-volume samples. Furthermore, the potential for mass manufacturing of this microfluidic device offers scalability and consistency, making it feasible to integrate EV isolation into routine clinical diagnostics and industrial processes, where high consistency and throughput are essential requirements.

מחבר זרקור: שבר זרימת שדה אסימטרי לשילוב ביוריאקטורים

Extracellular vesicles hold immense promise for biomedical applications, but current isolation methods are time-consuming and impractical for clinical use. In this study, we present a microfluidic device that enables the direct isolation of extracellular vesicles from large volumes of biofluids in a continuous manner with minimal steps.

בידוד חד-שלבי של בועיות חוץ-תאיות מדגימות בנפח גדול באמצעות התקן מיקרופלואידי A4F מפוצל

Extracellular vesicles (EVs) hold immense potential for various biomedical applications, including diagnostics, drug delivery, and regenerative medicine. ...