この作品は、ローランドジュニア·フェロー· ​​プログラムによってサポートされています。クリス·ストークス特注の、コンピュータ支援圧力制御のセットアップ博士ダイアンSchaak、の開発に彼の助けのため：著者はハーバード大学ローランド研究所の科学者やスタッフに感謝の意を表したいと思います生体試料処理のための彼女の入力、電気セットアップを開発するためのウィンフィールド·ヒル、Alavaroサンチェス博士のための圧力のセットアップに必要な機械の配管部品を機械加工するためのフローサイトメーター、スコットBevis、ケニースペンサーとドンロジャースへのアクセスを許可する。マイクロ流体のマスターは、ハーバード大学のナノスケールシステムセンター（CNS）で作製した。

1。細胞調製<ol><li>リーボビッツL-15培地中で組織培養用T75フラスコあたり10 mlの容量でプレート転移性乳癌細胞株MDA-MB-231 1×10 5細胞/ mlを、10％（v / v）のウシ胎児血清および1を補充％ペニシリン - ストレプトマイシン。 </li><li> 0％CO 2環境下で37℃の加湿インキュベーター中MDA-MB-231細胞をインキュベートします。 </li><li> 2分間0.25％トリプシン-EDTAで細胞を処理し、増殖培地を8mlを添加することによりトリプシンの酵素活性を不活性化することにより2日間播種後の実験のために細胞を回収する。 </li><li> 5×10 5細胞/ mlの最終濃度になるようにダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（のCa 2 +およびMgなしDPBS、1倍、2 +）で200×gで再懸濁し、5分間の遠心分離により細胞をペレット化。 </li></ol> 2デバイスの設計と製作注：マスク、マスタ金型捏造とプロセスを囲むマイクロチャネルは、ポリジメチルシロキサン（PDMS）マイクロ鋳造法は、通常の実験室ベンチトップ上で実行することができるが、クリーンルームの内部に行われるべきである。 <ol><li> AutoCADのと、図1に示すように、マイクロ流体デバイスを設計します。デバイスは、（L = 7ミリメートルW =40μmであり、H = 70μm）を、複数の注入ポート、粗いフィルターと2平行な長方形の慣性中心にチャンネルの入口で構成する必要があります。個別のストレートチャンネルは、アルミニウム電極用の穴を介して2つとは別に800μmで配置されている5エレクトロポレーションチャンバー（W C = 400μm）で構成されています。二つの横方向に隣接したエレクトロポレーションチャンバーは、負極用の穴を共有しています。二つのストレートチャンネルは、エレクトロポレーション領域の下流にある出口に合流する。 </li><li> LinkCADを使用してGDSIIファイルに微細パターンを持つCADファイルを変換します。 5 &quot;×5&quot;フォトマスクブランク上に微細なパターンを書くレーザーマスク描画装置を用いた。製造業者のプロトコルに従って、マスクを開発する。 NOTE：マスク開発プロセスは、フォトレジストの現像、クロムエッチングおよびレジスト除去を含む。代替的に、高解像度の透明度（&gt;2万解像度）に印刷微細パターンが第三者の製造業者から購入し、フォトマスクとして使用することができる。フォトマスク上の最終的なマイクロスケールの機能は、ネガ型フォトレジストの極性を一致させるために透明でなければならない。 </li><li> 70μmの最終的な厚さを有するように、2000rpmで4インチシリコンウェハー上にネガ型フォトレジストスピンコートを有する標準ソフトリソグラフィー技術23を用いて、デバイス設計の鋳型を製造する。 </li><li> 95℃で20分間、ネガ型フォトレジストを有するウェーハをプリベーク。 </li><li>ウェハマスクに連絡し、マスクアライナを使用して、80秒間UV源（17.4 MJ / cm 2）とにさらす。 </li><li> SU-8現像液中で4分間露光したウェハを開発する。 </li><li>測定表面形状を使用して、フォトレジストの厚さを開発しました。 </li><li>エージェント（シリコーンエラストマーキット）を硬化するエラストマーの1の割合とPDMSレプリカを生成するために、鋳型に混合物を注ぐ。徹底10をミックス。 30分間の鋳造エラストマーを脱ガスし、2時間70℃のオーブン中で、脱気したエラストマーとの鋳型を硬化させる。 </li><li>ピンバイスを使って入口、出口及び電極挿入用の金型とパンチ穴からマイクロ流路パターンを硬化したPDMSレプリカを剥離する。注：ピンバイスの通常の切刃径がしっかりと所定の位置にPEEKチューブ（1/32のOD」）とアルミニウム電極（0.029のOD」）を保持するための十分な0.76ミリメートル、である必要があります。 </li><li>それぞれ、ガラス75 Wの高周波電力および酸素分圧で7秒間の酸素プラズマクリーナーで処理スライド500ミリトールにPDMSレプリカを接合することによって囲まれたマイクロ流体チャネルを作成する。 </li></ol> 3フロー実験<ol><li>インサートアルミニウム電極マイクロチャネル内のホールを介して指定の場所へ（0.029 &quot;OD）と出口PEEKチューブ（1/32「OD）（ 図3Bを参照）。 </li><li>アルミニウム電極への高電圧短方形波パルスを生成するための18責任の電気機器を接続PDMSモールド中の溶液を流すと接触している（ 図3C参照 ）。注：装置は、パルス発生器と、社内に構築高電圧アンプで構成する必要があります18。 </li><li> （ 図3A参照 ）は、4つの50ml遠心個別DPBSを含むチューブに、細胞および生体分子の溶液、および空気式流量制御システムに接続されたそれぞれのバイアルホルダーに各チューブを取り付けるを準備する。18 </li><li>マイクロ流体デバイス内の各入口穴にバイアルホルダーから入口PEEKチューブを接続します。 </li><li>電気FIEを有するために100 Vに、方形波パルス、Vの大きさを設定するldは強度は、E = V / Lの電子 、電気室全体で0.7 kVの/ cmのと同等である。注：ここで、L eは正および負の電極が流動する溶液と接触している2点間の距離である（ 図1を参照）。 </li><li> 40 psiの圧力調整器を設定します。注：単一の手動調整可能な窒素源が均一にすべてのサンプルバイアルを加圧するために使用され、高速マニホールドが適時特注のLabVIEWソフトウェアを使用して、個別のソリューションポートを活性化するために利用される18 </li><li>バルブ制御のために、 バルブランナーラベル特注のLabVIEWソフトウェアを開き、操 ​​作する権利を有するドロップダウンメニューから実行]をクリックします。 </li><li>各対応するバルブのアイコンをクリックすることで、バルブの電源をオンにします。注：それが活性化されると、バルブのアイコンが緑色に点灯します。アクティブなアイコンをクリックすると、非アクティブにし、バルブを閉じます。閉弁アイコンがグレーに変わります。 </li><li> （DPBSリザーバー用のバルブを開けすなわち、1.5分間の安定な細胞トラップ渦発生に必要な主要な流速に洗浄液）。 </li><li> 30秒（ すなわち 、細胞捕捉ステップ）のためのエレクトロポレーションチャンバー内のトラップ細胞に対する細胞溶液を洗浄溶液から活性溶液ポートを切り替えます。 </li><li>ソリューション切り替えステップ中の破壊されていない流れを確保するために、細胞捕捉工程の前に10秒間、同時にデバイスを介して両方の洗浄および細胞のソリューションフロー。注：この簡潔な並行流ステップは、各ソリューション切り替えステップで繰り返されるべきである。 </li><li>洗浄ポートの電源を入れ、非捕捉された混入細胞を除去するために、20秒間のデバイスをフラッシュします。 </li><li>デバイスに関心のある第一の分子（3,000 Daの中性及びアニオン性デキストラン分子の0.2 mg / mlの70,000 Daのニュートラルデキストラン分子の1.5 mg / mlの）を含有する溶液を注入する。 </li><li>速やかに注入した後5短パルス（Δtは2秒間隔で30ミリ秒=）を適用分子溶液およびオシロスコープを使用してリアルタイムに印加される電気パルスの大きさおよび持続時間を監視します。 </li><li>配信される追加の分子の数な回数だけ繰り返し手順3.10。各分子送達のために、余分な分子を除去するために100秒間洗浄溶液でデバイスをフラッシュし、その後、分子溶液に100秒間細胞をインキュベート。 </li><li> 5 psiの下の運転圧力を低下させることにより、下流解析のために、96ウェルプレート内の細胞を解放します。注：100細胞を用いた溶液約100μlを各リリースから収集されます。 </li><li>実験的には、フローサイトメトリーのために十分な細胞を収集するために3.16三回を通じて3.9ステップ実行します。 </li><li> 228×gで5分間処理された細胞を含む96ウェルプレートを遠心する。 </li><li>過剰な蛍光分子を含有する上清を取り除きます。 </li><li>フローサイトメトリー分析のためにDPBSで細胞を再懸濁します。 </li><li>分子のuのためのフローサイトメーターでのロードセル効率分析をptake。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もない。

スループットおよび多分子送達の効率の新しい並列化エレクトロポレーションプラットフォーム、10倍の増強に以前に開発単室システムが提供する全ての利点に加えて、達成された。18以前は利用可能なメリットは、（i）予備精製が含まれる生存能力増強のための均一なサイズ分布、（ii）の正確かつ個別分子の投薬管理、および（iii）低い運用電流を有する細胞を標的とする。これ?...

近年では、細胞外分子のサイトゾル送達を容易にするために、電気パルスの使用は、哺乳動物細胞を操作する魅力的な手段となっている。1もエレクトロポレーションと呼ばれるこのプロセスは、可逆的にアクセスするために、本 ​​質的に膜不透過性分子を可能にする、細胞膜を透過性に細胞の細胞内環境に。実質的に任意の分子がエレクトロポレーションを用いた細胞の任意のタイプの膜に一時的に作成細孔を介してサイトゾルに導入することができ、この技術はより再現性であると報告されており、普遍的に適用、およびウイルス媒介化学を含む他の方法よりも効率的であるため細胞が生存し、そのまま保ちながら光学的ア ​​プローチ2-3この技術は、蛍光分子を導入する4医薬品5および核酸6-7利用されている。これらの利点を考えると、エレクトロポレーションは、一般的な労働力として採用されているDNAトランスフェクションのためのatory技術、 インビボ遺伝子治療8および細胞ワクチン接種の研究。成功したエレクトロポレーションに必要な電界強度が密接に細胞の直径と相関するので、従来のエレクトロポレーションシステムは、同時に、サイズが大きな不均一性を有するサンプルのための実用的な効率および生存率を達成することは依然としては困難である。さらに、これらのシステムは、複数の分子量の正確な制御は、バルク確率的分子送達プロセスへの依存に起因して配信されることはできない。9にこれらの問題に対処するために、多くのグループが、より低いポレーション電圧の利点を提供する、マイクロ流体エレクトロポレーション·プラットフォームを開発したより良いトランスフェクション効率、細胞死亡率の大幅な削減、および複数の分子を送達する能力。10〜13これらの利点は、電極ピッチマイクロエレクトロポレーションシステムの小さなフットプリントにより可能となった長さは飛躍的に成功した配信のために必要な電圧を減少させ、サブミリメートルである。さらに、これらのマイクロエレクト​​ロポレーションシステムは、均一な電界分布を得ることができ、迅速に送達効率を高めつつ、縮小細胞死を生じ、発生した熱を放散する。これらのマイクロチップのための透明な材料を利用し、さらに迅速なパラメータ変更のためのエレクトロポレーションプロセスのその場観察ができます。2,12しかし、投与量の制御とmolecular-と携帯依存のパラメータ制御の正確な新興研究および治療 ​​用途のために必要、6、 14-16は依然として未解決のまま。 この研究は、標的細胞の予め選択された同一集団に順次複数の分子を送達することができるマイクロ流体渦アシストエレクトロポレーションシステムを提示する。均一なサイズ分布を有する細胞は、以前に報告されたSiを用いたエレクトロポレーションの前に単離されるぜ選択的捕捉機構。17-18与えられた電界強度あたりのエレクトロポレーションの効率および拡張生存率の小さい変化が達成された、均一なサイズ分布を有することにより、 図19さらに、連続的に横切る分子の均一な送達のために許可されたマイクロスケールの渦を用いて捕捉された細胞を撹拌結果と一致する全体細胞質ゾルは、以前に別の渦アシストエレクトロポレーションプラットフォームを使用して報告した。20このシステムは広範囲の分子量を有する巨大分子をに配信された、一般的に生物学的用途で利用される分子の広い範囲に適用可能であることを示すために転移性乳癌細胞。また、リアルタイムのプロセス監視の助けを借りて、この作品はelectrporation中の分子配信のメカニズムについての長年の論争に終止符を打つためのより多くの証拠を提供し、主に拡散媒介対電気泳動媒介されている。14 </sup&gt;他のエレクトロポレーションシステムとは異なり、このプラットフォームは、一意的に正確なマルチ分子送達、高分子送達効率、最小の細胞死、サイズ、送達分子の電荷の広いスパン、ならびにエレクトロポレーションのリアルタイム可視化を組み合わせた利点を提供するプロセス。これらの機能を考えると、開発したエレクトロポレーションシステムは、セルラーリプログラミング研究、6,14,21-22薬物送達用途10,19およびエレクトロ分子配信メカニズムの深い理解のために必要とするアプリケーションのための汎用ツールとして実用的な可能性を秘めています。

<table><tbody><tr><td>MDA-MB-231 cancer cell line</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&amp;rsquo;s L-15 Medium</td><td>Cellgro, Mediatech, Inc.</td><td>10-045-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s phosphate buffered saline (DPBS)</td><td>Cellgro, Mediatech, Inc.</td><td>21-030</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Flow Cytometer easyCyte HT</td><td>Millipore</td><td>0500-4008</td><td></td></tr><tr><td>Oxygen Plasma Cleaner</td><td>Technics Micro-RIE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dektak 6M surface profiler</td><td>Veeco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KMPR 1050</td><td>Microchem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compressed Nitrogen gas</td><td>Airgas</td><td>NI 300</td><td></td></tr><tr><td>High Pressure Regulator</td><td>McMaster-Carr</td><td>6162K22</td><td></td></tr><tr><td>Downstream regulator</td><td>McMaster-Carr</td><td>4000K563</td><td></td></tr><tr><td>High-speed 3/2way-8 valve manifold</td><td>Festo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inline Check Valve</td><td>Idex Health and Science</td><td>CV3320</td><td></td></tr><tr><td>5/32&quot; OD x 3/32&quot; ID Polyurethan tubes</td><td>Pneumadyne</td><td>PU-156F-0</td><td></td></tr><tr><td>1/4&quot; OD X 0.17&quot; ID Polyurethan tubes</td><td>Pneumadyne</td><td>PU-250PB-4</td><td></td></tr><tr><td>1/16&quot; PEEK tubings</td><td>Festo</td><td>P1533</td><td></td></tr><tr><td>1/32&quot; PEEK tubings</td><td>Idex Health and Science</td><td>P1569</td><td></td></tr><tr><td>PEEK tubing unions</td><td>Idex Health and Science</td><td>P881</td><td></td></tr><tr><td>Pulse Generator</td><td>HP</td><td>8110A</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum Wire</td><td>Bob Martin Company</td><td>6061 ALUM</td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>Agilent</td><td>DSO3062A</td><td></td></tr><tr><td>50 ml centrifuge tubes</td><td>VWR</td><td>21008-178</td><td></td></tr><tr><td>15 ml centrifuge tube</td><td>VWR</td><td>21008-216</td><td></td></tr><tr><td>T75 culture flask</td><td>VWR</td><td>82050-862</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Tetramethylrhodamine, 3,000 MW, Anionic</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>D3307</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Tetramethylrhodamine, 70,000 MW, Neutral&amp;nbsp;</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>D1819</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Texas Red, 3,000 MW, Neutral</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>D3329</td><td></td></tr></tbody></table>

microscale vortex-assisted electroporator for sequential molecular delivery

それは物理的に細胞内に非浸透性の外因性分子プローブを導入するための非常に強力な技術であるため、エレクトロポレーションは、過去数年間でますます注目を受けている。この作品は、精密な分子に依存するパラメータ制御で、哺乳動物細胞への複数の分子送達を行うことが可能なマイクロ流体電気穿孔プラットフォームを報告します。均一なサイズ分布を有する細胞を単離するシステムの能力は、与えられた電界強度あたりのエレクトロポレーション効率のより少ない変動を可能にする;したがって、サンプルの生存率を高めた。また、そのプロセスの可視化機能は、効率向上のために、その場で迅速な分子デリバリーパラメータ調整を可能にする、リアルタイムで蛍光分子の取り込み過程を観察することができます。報告されたプラットフォームの膨大な機能を表示するには、異なるサイズおよび電荷（3,000 70,000 DaでMWを有する、例えばデキストラン）を持つ巨大分子であったすべての試験した分子に対して高い送達効率（&gt; 70％）で転移性乳癌細胞に送達する。開発プラットフォームは、オンチップエレクトロポレーション技術は有益である研究分野の拡大に使用するための可能性を証明した。

開発された並列マイクロ流体エレクトロは、転移性乳癌細胞を生きたに多様なサイズと電荷を持つ高分子を送達した。成功した分子の送達は、定性的にその場で電気穿孔周回細胞の蛍光強度の変化を監視することによって決定し、フローサイトメトリー分析によって定量的測定によって確認した。 図4Aは、処理された細胞の90％が70,000 Daの中性デキストランを取り込むこと...

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Microscale Vortex-assisted Electroporator for Sequential Molecular Delivery

マイクロ流体渦補助エレクトロポレーション·プラットフォームは、正確かつ独立した投与量制御を備え​​た同一の細胞集団への複数の分子の順次配信のために開発されました。分子の送達効率および加工細胞の生存率を向上させるために支援エレクトロポレーションの前に、システムのサイズベースの標的細胞精製工程。

マイクロスケール渦アシストシーケンシャル分子送達用エレクトロポ

Electroporation has received increasing attention in the past years, because it is a very powerful technique for physically introducing non-permeant ...

microscale-vortex-assisted-electroporator-for-sequential-molecular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.5K ビュー.  Harvard University. マイクロ流体渦補助エレクトロポレーション·プラットフォームは、正確かつ独立した投与量制御を備え​​た同一の細胞集団への複数の分子の順次配信のために開発されました。分子の送達効率および加工細胞の生存率を向上させるために支援エレクトロポレーションの前に、システムのサイズベースの標的細胞精製工程。 

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Taking Advantage of Reduced Droplet-surface Interaction to Optimize Transport of Bioanalytes in Digital Microfluidics

Digital microfluidics (DMF), a technique for manipulation of droplets, is a promising alternative for the development of &#8220;lab-on-a-chip&#8221; platforms. Often, droplet motion relies on the wetting of a surface, directly associated with the application of an electric field; surface interactions, however, make motion dependent on droplet contents, limiting the breadth of applications of the technique.
Some alternatives have been presented to minimize this dependence. However, they rely on the addition of extra chemical species to the droplet or its surroundings, which could potentially interact with droplet moieties. Addressing this challenge, our group recently developed Field-DW devices to allow the transport of cells and proteins in DMF, without extra additives.
Here, the protocol for device fabrication and operation is provided, including the electronic interface for motion control. We also continue the studies with the devices, showing that multicellular, relatively large, model organisms can also be transported, arguably unaffected by the electric fields required for device operation.

The protocol for fabrication and operation of field dewetting devices (Field-DW) is described, as well as the preliminary studies of the effects of electric fields on droplet contents.

デジタルマイクロフルイディクスにBioanalytesの輸送を最適化するための縮小液滴表面相互作用の活用

Digital microfluidics (DMF), a technique for manipulation of droplets, is a promising alternative for the development of &#8220;lab-on-a-chip&#8221; ...

工学

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often performed at low throughput, it is moreover time-consuming and error-prone, even more so when multiplexing several plasmids. We developed an easy, fast, and accurate method to perform cell transfection in a 384-well plate layout using acoustic droplet ejection (ADE) technology. The nanodispenser device used in this study&#160;is based on this technology and allows precise nanovolume delivery at high speed from a source well plate to a destination one. It can dispense and multiplex DNA and transfection reagent according to a predesigned spreadsheet. Here we present an optimal protocol to perform ADE-based high-throughput plasmid transfection which makes it possible to reach an efficiency of up to 90% and a nearly 100% cotransfection in cotransfection experiments. We extend initial work by proposing a user-friendly spreadsheet-based macro, able to manage up to four plasmids/wells from a library containing up to 1,536 different plasmids, and a tablet-based pipetting guide application. The macro designs the necessary template(s) of the source plate(s) and generates the ready-to-use files for the nanodispenser and tablet-based application. The four-steps transfection protocol involves i) a diluent dispense with a classical liquid handler, ii) plasmid distribution and multiplexing, iii) a transfection reagent dispense by the nanodispenser, and iv) cell plating on the prefilled wells. The described software-based control of ADE plasmid multiplexing and transfection allows even nonspecialists in the field to perform a reliable cell transfection in a fast and safe way. This method enables rapid identification of optimal settings for a given cell type and can be transposed to higher-scale and manual approaches. The protocol eases applications, such as human ORFeome protein (set of open reading frames [ORFs] in a genome) expression or CRISPR-Cas9-based gene function validation, in nonpooled screening strategies.

This protocol describes high-throughput plasmid transfection of mammalian cells in a 384-well plate using acoustic droplet ejection technology. The time-consuming, error-prone DNA dispensing and multiplexing, but also the transfection reagent dispensing, are software-driven and performed by a nanodispenser device. The cells are then seeded in these prefilled wells.

音響ナノディスペンス技術を用いたハイスループットDNAプラスミド多重化とトランスフェクション

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...

遺伝学

High Speed Droplet-based Delivery System for Passive Pumping in Microfluidic Devices

A novel microfluidic system has been developed that uses the phenomenon of passive pumping along with a user controlled droplet based fluid delivery system. Passive pumping is the phenomenon by which surface tension induced pressure differences drive fluid movement in closed channels. The automated fluid delivery system consists of a set of voltage controlled valves with micro-nozzles connected to a fluid reservoir and a control system. These voltage controlled valves offer a volumetrically precise way to deliver fluid droplets to the inlet of a microfluidic device in a high frequency manner. Based on the  dimensions demonstrated in the current study example, the system is capable of flowing 4 milliliters per minute (through a 2.2mm by 260um cross-sectional channel). Based on these same channel dimensions, fluid exchange of a point inside the channel can be achieved in as little as eight milliseconds. It is observed that there is interplay between momentum of the system (imparted by a combination of the droplets created by the valves and the fluid velocity in the channel), and the surface tension of the liquid. Where momentum provides velocity to the fluid flow (or vice-versa), equilibration of surface tension at the inlet provides a sudden stop to any flow. This sudden stop allows the user to control the flow characteristics of the channel and opens the door for a variety of biological applications, ranging anywhere from reagent delivery to drug-cell studies. It is also observed that when nozzles are aimed at the inlet at shallow angles, the droplet momentum can cause additional interesting fluid phenomena, such as mixing of multiple droplets in the inlet.

A novel microfluidic system has been developed using the phenomenon of passive pumping and a user controlled fluid delivery system. This microfluidic system has the potential to be used in a wide variety of biological applications given its low cost, ease of use, volumetric precision, high speed, repeatability and automation.

マイクロ流体デバイスでパッシブポンピング用高速液滴ベースのデリバリーシステム

A novel microfluidic system has been developed that uses the phenomenon of passive pumping along with a user controlled droplet based fluid delivery ...

生物学

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

単一細胞のゲノムの配列のための超高スループット マイクロ流体プラットフォーム

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

生物工学

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and morphology of the obtained microsphere. A microsphere copolymerized with an acrydite-DNA probe was successfully fabricated. Different methods such as asymmetric PCR, exonuclease digestion, and isolation on streptavidin-coated magnetic beads can be used to synthesize single-stranded DNA (ssDNA). However, these methods cannot efficiently use large amounts of highly purified ssDNA. Here, we describe a microsphere-PCR protocol detailing how ssDNA can be efficiently amplified and separated from dsDNA simply by pipetting from a PCR reaction tube. The amplification of ssDNA can be applied as potential reagents for the DNA microarray and DNA-SELEX (Systematic evolution of ligands by exponential enrichment) processes.

This work provides a method for the fabrication of droplet-based microfluidic platforms and the application of polyacrylamide microspheres for microsphere-PCR amplification. The microsphere-PCR method makes it possible to obtain single-stranded DNA amplicons without separating double-stranded DNA.

マイクロ液滴手法と一本鎖 DNA 産物の微粒子に PCR 増幅

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic regulatory circuits. The analysis of synthetic genetic regulatory networks in vivo is time consuming and suffers from a lack of environmental control, with exogenous synthetic components interacting with host processes resulting in undesired behavior. To overcome these issues, cell-free characterization of novel circuitry is becoming more prevalent. In vitro transcription and translation (IVTT) mixtures allow the regulation of the experimental environment and can be optimized for each unique system. The protocols presented here detail the fabrication of a multilayer microfluidic device that can be utilized to sustain IVTT reactions for prolonged durations. In contrast to batch reactions, where resources are depleted over time and (by-) products accumulate, the use of microfluidic devices allows the replenishment of resources as well as the removal of reaction products. In this manner, the cellular environment is emulated by maintaining an out-of-equilibrium environment in which the dynamic behavior of gene circuits can be investigated over extended periods of time. To fully exploit the multilayer microfluidic device, hardware and software have been integrated to automate the IVTT reactions. By combining IVTT reactions with the microfluidic platform presented here, it becomes possible to comprehensively analyze complex network behaviors, furthering our understanding of the mechanisms that regulate cellular processes.

The fabrication process of a PDMS-based, multilayer, microfluidic device that allows in vitro transcription and translation (IVTT) reactions to be performed over prolonged periods is described. Furthermore, a comprehensive overview of the hardware and software required to automate and maintain these reactions for prolonged durations is provided.

長期無細胞遺伝子発現の伝導のための多層マイクロ流体プラットフォーム

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. For example, electroporation has been used with great success to study neural and retinal development in Xenopus, chicken and mouse 1-10. However, it is important to note that in all of these studies, investigators were not targeting soft tissues. Because we are interested in craniofacial development, we adapted a method to target facial mesenchyme.
When we searched the literature, we found, to our surprise, very few reports of successful gene transfer into cartilaginous tissue. The majority of these studies were gene therapy studies, such as siRNA or protein delivery into chondrogenic cell lines, or, animal models of arthritis 11-13. In other systems, such as chicken or mouse, electroporation of facial mesenchyme has been challenging (personal communications, Dept of Craniofacial Development, KCL). We hypothesized that electroporation into procartilaginous and cartilaginous tissues in Xenopus might work better. In our studies, we show that gene transfer into the facial cartilages occurs efficiently at early stages (28), when the facial primordium is still comprised of soft tissue prior to cartilage differentiation.
Xenopus is a very accessible vertebrate system for analysis of craniofacial development. Craniofacial structures are more readily visible in Xenopus than in any other vertebrate model, primarily because Xenopus embryos are fertilized externally, allowing analyses of the earliest stages, and facilitating live imaging at single cell resolution, as well as reuse of the mothers 14. Among vertebrate models developing externally, Xenopus is more useful for craniofacial analysis than zebrafish, as Xenopus larvae are larger and easier to dissect, and the developing facial region is more accessible to imaging than the equivalent region in fish. In addition, Xenopus is evolutionarily closer to humans than zebrafish (&tilde;100 million years closer) 15. Finally, at these stages, Xenopus tadpoles are transparent, and concurrent expression of fluorescent proteins or molecules will allow easy visualization of the developing cartilages. We anticipate that this approach will allow us to rapidly and efficiently test candidate molecules in an in vivo model system.

Craniofacial cartilages develop in close contact with other tissues and are difficult to manipulate in live animals. We are using electroporation to deliver molecular tools during growth of the craniofacial skeleton while bypassing early embryonic effects. This approach will allow us to efficiently test candidate molecules in vivo.

顔面間葉のエレクトロポレーション

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern for governments, industries and medical professionals worldwide. For example, EHECs, combined with Shigella, are responsible for the deaths of approximately 325,000 children each year and are particularly prevalent in the developing world where laboratory-based identification, common in the United States, is unavailable 1. The development and distribution of low cost, field-based, point-of-care tools to aid in the rapid identification and/or diagnosis of pathogens or disease markers could dramatically alter disease progression and patient prognosis. We have developed a tool to isolate nucleic acids and proteins from a sample by solid-phase extraction (SPE) without electricity or associated laboratory equipment 2. The isolated macromolecules can be used for diagnosis either in a forward lab or using field-based point-of-care platforms. Importantly, this method provides for the direct comparison of nucleic acid and protein data from an un-split sample, offering a confidence through corroboration of genomic and proteomic analysis.
Our isolation tool utilizes the industry standard for solid-phase nucleic acid isolation, the BOOM technology, which isolates nucleic acids from a chaotropic salt solution, usually guanidine isothiocyanate, through binding to silica-based particles or filters 3. CUBRC's proprietary solid-phase extraction chemistry is used to purify protein from chaotropic salt solutions, in this case, from the waste or flow-thru following nucleic acid isolation4.
By packaging well-characterized chemistries into a small, inexpensive and simple platform, we have generated a portable system for nucleic acid and protein extraction that can be performed under a variety of conditions. The isolated nucleic acids are stable and can be transported to a position where power is available for PCR amplification while the protein content can immediately be analyzed by hand held or other immunological-based assays. The rapid identification of disease markers in the field could significantly alter the patient's outcome by directing the proper course of treatment at an earlier stage of disease progression. The tool and method described are suitable for use with virtually any infectious agent and offer the user the redundancy of multi-macromolecule type analyses while simultaneously reducing their logistical burden.

A tool and chemistries are described to sequentially isolate nucleic acids followed by proteins from a sample without the need for electricity. The tool consists of a sorbent held within a transfer pipette while the isolation chemistries are based on solid-phase extraction principles. The isolated macromolecules can be analyzed by immuno-based and PCR-based assays.

電気鉛フリー、シーケンシャル核酸およびタンパク質の分離

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

The Fabrication and Operation of a Continuous Flow, Micro-Electroporation System with Permeabilization Detection

Current therapeutic innovations, such as CAR-T cell therapy, are heavily reliant on viral-mediated gene delivery. Although efficient, this technique is accompanied by high manufacturing costs, which has brought about an interest in using alternative methods for gene delivery. Electroporation is an electro-physical, non-viral approach for the intracellular delivery of genes and other exogenous materials. Upon the application of an electric field, the cell membrane temporarily allows molecular delivery into the cell. Typically, electroporation is performed on the macroscale to process large numbers of cells. However, this approach requires extensive empirical protocol development, which is costly when working with primary and difficult-to-transfect cell types. Lengthy protocol development, coupled with the requirement of large voltages to achieve sufficient electric-field strengths to permeabilize the cells, has led to the development of micro-scale electroporation devices. These micro-electroporation devices are manufactured using common microfabrication techniques and allow for greater experimental control with the potential to maintain high throughput capabilities. This work builds off a microfluidic-electroporation technology capable of detecting the level of cell membrane permeabilization at a single-cell level under continuous flow. However, this technology was limited to 4 cells processed per second, and thus a new approach for increasing the system throughput is proposed and presented here. This new technique, denoted as cell-population-based feedback control, considers the cell permeabilization response to a variety of electroporation pulsing conditions and determines the best-suited electroporation pulse conditions for the cell type under test. A higher-throughput mode is then used, where this 'optimal' pulse is applied to the cell suspension in transit. The steps for fabricating the device, setting up and running the microfluidic experiments, and analyzing the results are presented in detail. Finally, this micro-electroporation technology is demonstrated by delivering a DNA plasmid encoding for green fluorescent protein (GFP) into HEK293 cells.

This protocol describes the microfabrication techniques required to build a lab-on-a-chip, microfluidic electroporation device. The experimental setup performs controlled, single-cell-level transfections in a continuous flow and can be extended to higher throughputs with population-based control. An analysis is provided showcasing the ability to electrically monitor the degree of cell membrane permeabilization in real-time.

透過処理検出機能付き連続フローマイクロエレクトロポレーションシステムの構築と運用

Current therapeutic innovations, such as CAR-T cell therapy, are heavily reliant on viral-mediated gene delivery. Although efficient, this technique is ...

ヒト尿からの連続的な細胞外小胞分離のためのマイクロ流体デバイス

Single Step Isolation of Extracellular Vesicles from Large-Volume Samples with a Bifurcated A4F Microfluidic Device

Extracellular vesicles (EVs) hold immense potential for various biomedical applications, including diagnostics, drug delivery, and regenerative medicine. Nevertheless, the current methodologies for isolating EVs present significant challenges, such as complexity, time consumption, and the need for bulky equipment, which hinders their clinical translation. To address these limitations, we aimed to develop an innovative microfluidic system based on cyclic olefin copolymer-off-stoichiometry thiol-ene (COC-OSTE) for the efficient isolation of EVs from large-volume samples in a continuous manner. By utilizing size and buoyancy-based separation, the technology used in this study achieved a significantly narrower size distribution compared to existing approaches from urine and cell media samples, enabling the targeting of specific EV size fractions in future applications. Our innovative COC-OSTE microfluidic device design, utilizing bifurcated asymmetric flow field-flow fractionation technology, offers a straightforward and continuous EV isolation approach for large-volume samples. Furthermore, the potential for mass manufacturing of this microfluidic device offers scalability and consistency, making it feasible to integrate EV isolation into routine clinical diagnostics and industrial processes, where high consistency and throughput are essential requirements.

著者スポットライト:バイオリアクター統合のための非対称フィールドフローフラクショネーション

Extracellular vesicles hold immense promise for biomedical applications, but current isolation methods are time-consuming and impractical for clinical use. In this study, we present a microfluidic device that enables the direct isolation of extracellular vesicles from large volumes of biofluids in a continuous manner with minimal steps.

二股A4Fマイクロ流体デバイスを用いた大量サンプルからの細胞外小胞のシングルステップ分離(英語)

Extracellular vesicles (EVs) hold immense potential for various biomedical applications, including diagnostics, drug delivery, and regenerative medicine. ...

マイクロスケール渦アシストシーケンシャル分子送達用エレクトロポ

要約

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デジタルマイクロフルイディクスにBioanalytesの輸送を最適化するための縮小液滴表面相互作用の活用

音響ナノディスペンス技術を用いたハイスループットDNAプラスミド多重化とトランスフェクション

マイクロ流体デバイスでパッシブポンピング用高速液滴ベースのデリバリーシステム

単一細胞のゲノムの配列のための超高スループットマイクロ流体プラットフォーム

マイクロ液滴手法と一本鎖 DNA 産物の微粒子に PCR 増幅

長期無細胞遺伝子発現の伝導のための多層マイクロ流体プラットフォーム

顔面間葉のエレクトロポレーション

電気鉛フリー、シーケンシャル核酸およびタンパク質の分離

透過処理検出機能付き連続フローマイクロエレクトロポレーションシステムの構築と運用

二股A4Fマイクロ流体デバイスを用いた大量サンプルからの細胞外小胞のシングルステップ分離(英語)

マイクロスケール渦アシストシーケンシャル分子送達用エレクトロポ

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デジタルマイクロフルイディクスにBioanalytesの輸送を最適化するための縮小液滴表面相互作用の活用

音響ナノディスペンス技術を用いたハイスループットDNAプラスミド多重化とトランスフェクション

マイクロ流体デバイスでパッシブポンピング用高速液滴ベースのデリバリーシステム

単一細胞のゲノムの配列のための超高スループット マイクロ流体プラットフォーム

マイクロ液滴手法と一本鎖 DNA 産物の微粒子に PCR 増幅

長期無細胞遺伝子発現の伝導のための多層マイクロ流体プラットフォーム

顔面間葉のエレクトロポレーション

電気鉛フリー、シーケンシャル核酸およびタンパク質の分離

透過処理検出機能付き連続フローマイクロエレクトロポレーションシステムの構築と運用

二股A4Fマイクロ流体デバイスを用いた大量サンプルからの細胞外小胞のシングルステップ分離(英語)

単一細胞のゲノムの配列のための超高スループットマイクロ流体プラットフォーム