Este trabalho é apoiado pelo programa Rowland Júnior Fellow. Os autores gostariam de expressar gratidão aos cientistas e funcionários do Instituto Rowland em Harvard: Chris Stokes a sua ajuda para o desenvolvimento da, configuração de controle de pressão assistida por computador custom-built, Diane Schaak, Ph.D. por sua entrada para a manipulação de amostra biológica, Winfield Hill para o desenvolvimento da instalação elétrica, Alavaro Sanchez, Ph.D. para a concessão de acesso ao citômetro de fluxo, Scott Bevis, Kenny Spencer e Don Rogers para a usinagem de componentes hidráulicos mecânicos necessários para a configuração de pressão. Mestres microfluídicos foram fabricados no Centro de Sistemas em nanoescala (CNS) na Universidade de Harvard.

1. celular Preparação <ol><li> Placa 1 × 10 5 células / ml de linha celular de cancro da mama metastático MDA-MB-231 em um volume de 10 ml por frasco de cultura T75 tecido em meio L-15 de Leibovitz suplementado com 10% (v / v) de soro fetal bovino e 1 % de penicilina-estreptomicina. </li><li> Incubar MDA-MB-231 numa incubadora humidificada a 37 ° C, com 0% de CO 2 ambiente. </li><li> Células colheita para experiências 2 dias após a sementeira por tratamento de células com 0,25% de tripsina-EDTA durante 2 min e inactivar a actividade enzimática da tripsina por adição de 8 mL de meio de crescimento. </li><li> Células de pelotas por centrifugação durante 5 min a 200 x g e ressuspender em tampão fosfato salino de Dulbecco (DPBS, 1x, sem Ca 2 + e Mg 2 +) para uma concentração final de 5 x 10 5 células / ml. </li></ol> 2 Dispositivo de projeto e fabricação NOTA: A máscara, fabricações molde mestre eoprocesso de inclusão de microcanais devem ser conduzidas dentro de uma sala limpa, enquanto o polidimetilsiloxano (PDMS) processo de fundição de microcanais pode ser realizada em uma bancada de laboratório regular. <ol><li> Conceber um dispositivo de microfluidos, tal como ilustrado na Figura 1 com o AutoCAD. O dispositivo deverá ser composto por uma entrada com múltiplos orifícios de injecção, e dois filtros grossos inerciais concentrando canais rectangulares rectas paralelas (L = 7 mm, W = 40 pm, e H = 70 mm). Canal linear individual consiste de 5 secções de electroporação, os quais são colocados 800 um aparte (W C = 400 um), com dois furos através de eléctrodos de alumínio. Duas câmaras de eletroporação transversalmente adjacentes compartilhar o buraco para o eletrodo negativo. Dois canais rectos fundir a uma tomada no jusante da região de electroporação. </li><li> Converter o arquivo CAD com micro-padrões para um arquivo GDSII usando LinkCAD. Escreva os micro-padrões em um 5 &quot;x 5&quot; photomask em brancousando um gravador de revestimento de laser. Desenvolver a máscara, seguindo o protocolo do fabricante. NOTA: O processo de desenvolvimento máscara inclui o desenvolvimento photoresist, cromo corrosão e resistem à remoção. Alternativamente, as micro-padrões impressos sobre uma transparência elevada resolução (&gt; 20.000 dpi) pode ser adquirido a partir de um terceiro fabricante e utilizado como um foto-mascara. Microescala características finais de uma fotomáscara deve ser transparente para coincidir com a polaridade negativa de uma foto-resistente. </li><li> Fabricar o molde de fundição de concepção do dispositivo, utilizando técnicas de litografia suave padrão 23 com um revestimento foto-resistente negativo fiado sobre uma bolacha de silício de 4 polegadas a 2.000 rpm para ter a espessura final de 70 mM. </li><li> Prebake a bolacha com fotorresistente negativo durante 20 min a 95 ° C. </li><li> Em contato com a máscara com a bolacha e expor a uma fonte de UV (17,4 mJ / cm 2) durante 80 segundos usando um alinhador de máscara. </li><li> Desenvolver a bolacha exposta durante 4 minutos num revelador SU-8. </li><li> Medir oespessura photoresist desenvolvido utilizando um perfilômetro de superfície. </li><li> Rigorosamente misturar uma proporção de 10: 1 de elastômero para agente (kit elastômero de silicone) cura e despeje a mistura no molde de fundição para gerar réplicas de PDMS. Desgasificar o elastómero de fundição, durante 30 min e curar o molde de fundição com elastómero desgasificada num forno a 70 ° C durante 2 horas. </li><li> Delaminate curado réplica PDMS com padrões de microcanais dos orifícios do molde e perfurados para entradas, saída e eletrodos inserções utilizando um torno pinos. NOTA: O diâmetro normal de ponta da viseira pino deve ser 0,76 milímetros, adequada para segurando firmemente tubagem de PEEK (OD de 1/32 &quot;) e os eléctrodos de alumínio (OD de 0,029&quot;) no lugar. </li><li> Criar fechados canais microfluídicos por ligação PDMS réplicas para uma lâmina de vidro tratado em um limpador de plasma de oxigênio para 7 segundos a uma potência e pressão parcial de oxigênio de freqüência de rádio de 75 W e 500 mTorr, respectivamente. </li></ol> 3. experimentos em fluxo <ol><li> Inserireléctrodos de alumínio (0,029 &quot;OD) e um tubo de saída de PEEK (1/32&quot; OD) em locais designados via furos nos microcanais (ver Figura 3B). </li><li> Conecte o equipamento eléctrico 18 responsáveis ​​pela geração de alta tensão pulsos de onda quadrada curto para os eletrodos de alumínio (ver Figura 3C), que estão em contato com soluções de fluxo no molde PDMS. NOTA: O equipamento deve ser constituído por um gerador de pulso e um amplificador de alta tensão em-casa construída 18. </li><li> Preparar 50 ml de quatro tubos de centrífuga contendo individualmente DPBS, soluções com as células e biomoléculas, e atribuem cada tubo para o seu respectivo suporte de frasco ligado ao sistema de controlo de fluxo pneumático (ver Figura 3A) 18. </li><li> Conecte tubulação PEEK entrada dos detentores dos frascos nos respectivos orifícios de entrada no dispositivo micro. </li><li> Definir a magnitude dos impulsos de onda quadrada, V, 100 V, a fim de ter o fie eléctricoforça ld, E = V / L e, do outro lado da câmara de electroporação ser equivalente a 0,7 kV / cm. NOTA: Aqui, L e é a distância entre dois pontos em que os eléctrodos positivo e negativo se encontram em contacto com a solução de fluxo (ver Figura 1). </li><li> Ajuste o regulador de pressão para 40 psi. NOTA:. Uma única fonte de azoto manualmente ajustável é usado para pressurizar uniformemente todos os frascos de amostra e de um colector de alta velocidade é utilizada para activar portas oportuna solução individuais usando o software LabVIEW construído sob encomenda 18 </li><li> Para o controle de válvula, abra o software LabVIEW custom-built rotulado Válvula Runner e clique em Executar no menu suspenso o direito operar. </li><li> Ligue válvulas, clicando no ícone de cada válvula correspondente. Nota: O ícone da válvula deve ficar verde quando é ativado. Clicando no ícone ativo irá desativar e fechar a válvula. O ícone da válvula fechada deve virar cinza. </li><li> Abrir a válvula para o reservatório de DPBS (ie., solução de lavagem) para preparar a velocidade do fluxo necessário para a geração de vórtice de células-trapping estável por 1,5 min. </li><li> Alternar a porta solução activa a partir da solução de lavagem para a solução de células para células de armadilha na câmara de electroporação de 30 segundos (ou seja, o passo de captura de células). </li><li> Fluxo de ambas as soluções de lavagem e de célula através do dispositivo ao mesmo tempo durante 10 segundos, antes da etapa de captura de célula para garantir um fluxo ininterrupto durante a etapa de comutação de solução. NOTA: Este breve passo co-fluxo deve ser repetido a cada passo de mudança de solução. </li><li> Ligue o porto de lavar e limpar o aparelho durante 20 segundos, a fim de remover as células contaminantes não aprisionadas. </li><li> Injectar a solução que contém a primeira molécula de interesse (0,2 mg / ml de moléculas de dextrano 3000 Da neutro e aniónico ou 1,5 mg / ml de dextrano 70.000 Da molécula neutra) para o dispositivo. </li><li> Aplicar cinco pulsos curtos (AT = 30 ms com intervalos de 2 seg) imediatamente após a injeção dosolução molecular e monitorar a magnitude e duração dos pulsos elétricos aplicados em tempo real usando um osciloscópio. </li><li> Repetir o passo 3.10 tantas vezes quanto o número de moléculas adicionais a serem entregues. Para cada entrega molecular, as células incubar durante 100 s na solução molecular, em seguida, o dispositivo de descarga com a solução de lavagem de 100 s para remover o excesso de moléculas. </li><li> Libertar as células em uma placa de 96 poços para análise a jusante através da diminuição da pressão de operação inferior a 5 psi. NOTA: Cerca de 100 ml de solução com 100 células são coletadas de cada lançamento. </li><li> Execute o experimental passos 3.9 através de 3.16 três vezes para coletar células suficientes para citometria de fluxo. </li><li> Centrifuga-se a placa de 96 poços contendo células transformadas por 5 min a 228 x g. </li><li> Retirar o sobrenadante que contém o excesso de moléculas fluorescentes. </li><li> Ressuspender as células em DPBS para análise de citometria de fluxo. </li><li> As células de carga no citômetro de fluxo para u molecularptake análise de eficiência. </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

Com a nova plataforma eletroporação paralelizado, o aumento de 10 vezes na produtividade e eficiência da prestação de multi-molécula foi alcançado, além de todas as vantagens que o sistema de câmara única previamente desenvolvido proporciona. 18 méritos Anteriormente disponíveis incluem: (i) pré-purificação de as células alvo e com distribuição uniforme de tamanho de reforço viabilidade, (ii) o controlo de dosagem molecular preciso e individual, e (iii) a partir de corrente eléctrica opera...

Nos últimos anos, a utilização de impulsos eléctricos para facilitar a entrega de moléculas extracelulares citosólica tornou-se um meio atractivo de manipulação de células de mamífero. Uma Este processo, também conhecido como electroporação, reversivelmente, permeabiliza a membrana celular, permitindo que as moléculas de membrana inerentemente impermeáveis ​​para aceder ao meio intracelular das células. Como virtualmente qualquer molécula pode ser introduzida no citossol através de poros criados temporárias na membrana de qualquer tipo de células, utilizando a electroporação, a técnica tem sido relatada como sendo mais reprodutível, de aplicação universal, e mais eficiente do que outros métodos, incluindo mediada por vírus, química e abordagens ópticos 2-3. Esta técnica tem sido utilizada para introduzir moléculas fluorescentes, 4 drogas 5 e ácidos nucleicos de 6-7, mantendo as células viáveis ​​e intacta. Dadas essas vantagens, eletroporação foi adotado como um trabalho comumtória técnica para a transfecção de ADN, a terapia de genes in vivo e 8 estudos de vacinação celular. É, no entanto, continua a ser difícil para os sistemas convencionais de electroporação para conseguir simultaneamente a eficiência prática e viabilidade para as amostras com grande heterogeneidade no tamanho, porque a intensidade do campo eléctrico necessário para electroporação bem sucedida se correlaciona intimamente com o diâmetro da célula. Além disso, esses sistemas não permitem um controle preciso das quantidades moleculares múltiplas sendo entregues devido à dependência do processo de entrega molecular estocástico granel. 9 A fim de abordar estas questões, muitos grupos desenvolveram plataformas eletroporação microfluídicos, oferecendo a vantagem de tensões formadores de poros menores, melhor eficiência de transfecção, uma grande redução na mortalidade celular e capacidade de oferecer várias moléculas. foram possíveis devido às pequenas pegadas de sistemas de eletroporação em microescala cujo eletrodo passo 10-13 Estas vantagenscomprimentos são sub-milímetros, diminuindo drasticamente as tensões necessárias para entrega bem sucedida. Além disso, esses sistemas de eletroporação em microescala pode alcançar distribuição de campo elétrico uniforme e rapidamente dissipa o calor gerado, produzindo mortalidade celular reduzida, reforçando simultaneamente a eficiência de entrega. A utilização de materiais transparentes para estas micropastilhas permite ainda na observação in situ do processo de modificações dos parâmetros de electroporação rápidas. 2,12 Contudo, o controlo de dosagem precisa e controlo do parâmetro molecular-celular e dependente, necessária para a pesquisa e aplicações terapêuticas, 6 emergente, 14-16 continuam por resolver. Este trabalho apresenta um sistema de eletroporação microfluídica assistida por vórtice, capaz de oferecer múltiplas moléculas sequencialmente em uma população idêntica pré-selecionado de células-alvo. As células com a distribuição de tamanho uniforme são isolados antes de electroporação utilizando si previamente relatadomecanismo de ze-seletiva trapping. 17-18 Por ter uma distribuição uniforme tamanho, menor variação na eficiência eletroporação e maior viabilidade por determinado intensidade do campo elétrico foram atingidos. 19 Além disso, continuamente agitando células presos usando vórtices microescala permitido para entrega uniforme de moléculas através da citosol inteiro, de acordo com os resultados relatados anteriormente usando uma outra plataforma electroporação assistida por vórtice. 20 Para demonstrar que este sistema pode ser aplicado a uma ampla gama de moléculas comumente utilizados em aplicações biológicas, macromoléculas com uma ampla gama de pesos moleculares foram entregues aos células de câncer de mama metastático. Além disso, com a ajuda de monitoramento de processos em tempo real, este trabalho fornece mais evidências para pôr fim ao debate de longa data sobre o mecanismo de entrega molecular durante electrporation, sendo predominantemente eletroforese mediada versus 14 mediada por difusão. </sup&gt; Ao contrário de outros sistemas de electroporação, esta plataforma fornece exclusivamente as vantagens combinadas de precisão de entrega multi-molécula, de alta eficiência de entrega molecular, a mortalidade celular mínimo, um período largo de tamanho e taxas de moléculas entregues, bem como a visualização em tempo real da electroporação processo. Dadas estas capacidades, o sistema de eletroporação desenvolvido tem potencial prático como uma ferramenta versátil para estudos de reprogramação celular, aplicativos de entrega de drogas 6,14,21-22 10,19 e aplicações que requerem para a compreensão em profundidade dos mecanismos moleculares de entrega eletroporação.

<table><tbody><tr><td>MDA-MB-231 cancer cell line</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&amp;rsquo;s L-15 Medium</td><td>Cellgro, Mediatech, Inc.</td><td>10-045-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s phosphate buffered saline (DPBS)</td><td>Cellgro, Mediatech, Inc.</td><td>21-030</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Flow Cytometer easyCyte HT</td><td>Millipore</td><td>0500-4008</td><td></td></tr><tr><td>Oxygen Plasma Cleaner</td><td>Technics Micro-RIE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dektak 6M surface profiler</td><td>Veeco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KMPR 1050</td><td>Microchem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compressed Nitrogen gas</td><td>Airgas</td><td>NI 300</td><td></td></tr><tr><td>High Pressure Regulator</td><td>McMaster-Carr</td><td>6162K22</td><td></td></tr><tr><td>Downstream regulator</td><td>McMaster-Carr</td><td>4000K563</td><td></td></tr><tr><td>High-speed 3/2way-8 valve manifold</td><td>Festo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inline Check Valve</td><td>Idex Health and Science</td><td>CV3320</td><td></td></tr><tr><td>5/32&quot; OD x 3/32&quot; ID Polyurethan tubes</td><td>Pneumadyne</td><td>PU-156F-0</td><td></td></tr><tr><td>1/4&quot; OD X 0.17&quot; ID Polyurethan tubes</td><td>Pneumadyne</td><td>PU-250PB-4</td><td></td></tr><tr><td>1/16&quot; PEEK tubings</td><td>Festo</td><td>P1533</td><td></td></tr><tr><td>1/32&quot; PEEK tubings</td><td>Idex Health and Science</td><td>P1569</td><td></td></tr><tr><td>PEEK tubing unions</td><td>Idex Health and Science</td><td>P881</td><td></td></tr><tr><td>Pulse Generator</td><td>HP</td><td>8110A</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum Wire</td><td>Bob Martin Company</td><td>6061 ALUM</td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>Agilent</td><td>DSO3062A</td><td></td></tr><tr><td>50 ml centrifuge tubes</td><td>VWR</td><td>21008-178</td><td></td></tr><tr><td>15 ml centrifuge tube</td><td>VWR</td><td>21008-216</td><td></td></tr><tr><td>T75 culture flask</td><td>VWR</td><td>82050-862</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Tetramethylrhodamine, 3,000 MW, Anionic</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>D3307</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Tetramethylrhodamine, 70,000 MW, Neutral&amp;nbsp;</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>D1819</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Texas Red, 3,000 MW, Neutral</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>D3329</td><td></td></tr></tbody></table>

microscale vortex-assisted electroporator for sequential molecular delivery

A electroporação tem recebido crescente atenção nos últimos anos, porque é uma técnica muito potente para a introdução de sondas moleculares exógenas fisicamente não permeantes em células. Este trabalho apresenta uma plataforma microfluídica eletroporação capaz de realizar múltiplas entrega molécula para células de mamíferos com controle de parâmetro preciso e molecular dependente. A capacidade do sistema para isolar células com distribuição de tamanho uniforme permite menos variação na eficiência eletroporação per dada intensidade do campo elétrico; por conseguinte, melhorada a viabilidade da amostra. Além disso, o recurso de visualização do processo permite a observação do processo molecular fluorescente captação em tempo real, que permite ajustes de parâmetros entrega moleculares rápidas in situ para aumento de eficiência. Para mostrar as vastas capacidades da plataforma relatado, macromoléculas com diferentes tamanhos e cargas elétricas (por exemplo, dextrano com MW de 3.000 e 70.000 Da) foramentregues para as células do câncer de mama metastático com alta eficiência de entrega (&gt; 70%) para todas as moléculas testadas. A plataforma desenvolvida provou o seu potencial para uso na expansão de campos de pesquisa onde on-chip técnicas de eletroporação pode ser benéfico.

O electroporator microfluídica paralelo desenvolvido entregues macromoléculas com tamanhos variados e cargas elétricas em células de câncer de mama metastático vivo. Entrega bem sucedida molecular foi qualitativamente determinado monitorizando alterações na intensidade de fluorescência de células electroporadas em órbita in situ e confirmado por medidas quantitativas por meio de análise de citometria de fluxo. Figura 4A mostra que 90% das células tratadas com a absorção de 70.000...

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Microscale Vortex-assisted Electroporator for Sequential Molecular Delivery

Um vórtice microfluídico plataforma eletroporação assistida foi desenvolvido para entrega seqüencial de múltiplas moléculas em populações de células idênticas, com controle de dosagem precisa e independente. Tamanho com base etapa de purificação de células alvo eletroporação anterior do sistema auxiliado para aumentar a eficiência de entrega molecular e viabilidade celular processado.

Microescala Electroporator para entrega Sequential Molecular assistida por Vortex

Electroporation has received increasing attention in the past years, because it is a very powerful technique for physically introducing non-permeant ...

microscale-vortex-assisted-electroporator-for-sequential-molecular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.5K visualizações.  Harvard University.  Um vórtice microfluídico plataforma eletroporação assistida foi desenvolvido para entrega seqüencial de múltiplas moléculas em populações de células idênticas, com controle de dosagem precisa e independente. Tamanho com base etapa de purificação de células alvo eletroporação anterior do sistema auxiliado para aumentar a eficiência de entrega molecular e viabilidade celular processado. 

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Taking Advantage of Reduced Droplet-surface Interaction to Optimize Transport of Bioanalytes in Digital Microfluidics

Digital microfluidics (DMF), a technique for manipulation of droplets, is a promising alternative for the development of &#8220;lab-on-a-chip&#8221; platforms. Often, droplet motion relies on the wetting of a surface, directly associated with the application of an electric field; surface interactions, however, make motion dependent on droplet contents, limiting the breadth of applications of the technique.
Some alternatives have been presented to minimize this dependence. However, they rely on the addition of extra chemical species to the droplet or its surroundings, which could potentially interact with droplet moieties. Addressing this challenge, our group recently developed Field-DW devices to allow the transport of cells and proteins in DMF, without extra additives.
Here, the protocol for device fabrication and operation is provided, including the electronic interface for motion control. We also continue the studies with the devices, showing that multicellular, relatively large, model organisms can also be transported, arguably unaffected by the electric fields required for device operation.

The protocol for fabrication and operation of field dewetting devices (Field-DW) is described, as well as the preliminary studies of the effects of electric fields on droplet contents.

Aproveitando-se de Redução Interação gota-superfície para otimizar o transporte de Bioanalytes em microfluídica Digital

Digital microfluidics (DMF), a technique for manipulation of droplets, is a promising alternative for the development of &#8220;lab-on-a-chip&#8221; ...

Engenharia

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often performed at low throughput, it is moreover time-consuming and error-prone, even more so when multiplexing several plasmids. We developed an easy, fast, and accurate method to perform cell transfection in a 384-well plate layout using acoustic droplet ejection (ADE) technology. The nanodispenser device used in this study&#160;is based on this technology and allows precise nanovolume delivery at high speed from a source well plate to a destination one. It can dispense and multiplex DNA and transfection reagent according to a predesigned spreadsheet. Here we present an optimal protocol to perform ADE-based high-throughput plasmid transfection which makes it possible to reach an efficiency of up to 90% and a nearly 100% cotransfection in cotransfection experiments. We extend initial work by proposing a user-friendly spreadsheet-based macro, able to manage up to four plasmids/wells from a library containing up to 1,536 different plasmids, and a tablet-based pipetting guide application. The macro designs the necessary template(s) of the source plate(s) and generates the ready-to-use files for the nanodispenser and tablet-based application. The four-steps transfection protocol involves i) a diluent dispense with a classical liquid handler, ii) plasmid distribution and multiplexing, iii) a transfection reagent dispense by the nanodispenser, and iv) cell plating on the prefilled wells. The described software-based control of ADE plasmid multiplexing and transfection allows even nonspecialists in the field to perform a reliable cell transfection in a fast and safe way. This method enables rapid identification of optimal settings for a given cell type and can be transposed to higher-scale and manual approaches. The protocol eases applications, such as human ORFeome protein (set of open reading frames [ORFs] in a genome) expression or CRISPR-Cas9-based gene function validation, in nonpooled screening strategies.

This protocol describes high-throughput plasmid transfection of mammalian cells in a 384-well plate using acoustic droplet ejection technology. The time-consuming, error-prone DNA dispensing and multiplexing, but also the transfection reagent dispensing, are software-driven and performed by a nanodispenser device. The cells are then seeded in these prefilled wells.

Multiplexação e transfecção de plasmídeo de DNA de alta produtividade usando tecnologia de Nanodosagem acústica

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...

Genética

High Speed Droplet-based Delivery System for Passive Pumping in Microfluidic Devices

A novel microfluidic system has been developed that uses the phenomenon of passive pumping along with a user controlled droplet based fluid delivery system. Passive pumping is the phenomenon by which surface tension induced pressure differences drive fluid movement in closed channels. The automated fluid delivery system consists of a set of voltage controlled valves with micro-nozzles connected to a fluid reservoir and a control system. These voltage controlled valves offer a volumetrically precise way to deliver fluid droplets to the inlet of a microfluidic device in a high frequency manner. Based on the  dimensions demonstrated in the current study example, the system is capable of flowing 4 milliliters per minute (through a 2.2mm by 260um cross-sectional channel). Based on these same channel dimensions, fluid exchange of a point inside the channel can be achieved in as little as eight milliseconds. It is observed that there is interplay between momentum of the system (imparted by a combination of the droplets created by the valves and the fluid velocity in the channel), and the surface tension of the liquid. Where momentum provides velocity to the fluid flow (or vice-versa), equilibration of surface tension at the inlet provides a sudden stop to any flow. This sudden stop allows the user to control the flow characteristics of the channel and opens the door for a variety of biological applications, ranging anywhere from reagent delivery to drug-cell studies. It is also observed that when nozzles are aimed at the inlet at shallow angles, the droplet momentum can cause additional interesting fluid phenomena, such as mixing of multiple droplets in the inlet.

A novel microfluidic system has been developed using the phenomenon of passive pumping and a user controlled fluid delivery system. This microfluidic system has the potential to be used in a wide variety of biological applications given its low cost, ease of use, volumetric precision, high speed, repeatability and automation.

High Speed ​​Delivery System Droplet-based para Passive Bombeamento em dispositivos microfluídicos

A novel microfluidic system has been developed that uses the phenomenon of passive pumping along with a user controlled droplet based fluid delivery ...

Biologia

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

Uma plataforma Microfluidic de ultra alta taxa de transferência para o sequenciamento do genoma de célula única

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Bioengenharia

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and morphology of the obtained microsphere. A microsphere copolymerized with an acrydite-DNA probe was successfully fabricated. Different methods such as asymmetric PCR, exonuclease digestion, and isolation on streptavidin-coated magnetic beads can be used to synthesize single-stranded DNA (ssDNA). However, these methods cannot efficiently use large amounts of highly purified ssDNA. Here, we describe a microsphere-PCR protocol detailing how ssDNA can be efficiently amplified and separated from dsDNA simply by pipetting from a PCR reaction tube. The amplification of ssDNA can be applied as potential reagents for the DNA microarray and DNA-SELEX (Systematic evolution of ligands by exponential enrichment) processes.

This work provides a method for the fabrication of droplet-based microfluidic platforms and the application of polyacrylamide microspheres for microsphere-PCR amplification. The microsphere-PCR method makes it possible to obtain single-stranded DNA amplicons without separating double-stranded DNA.

Uma abordagem Microfluidic gotículas e amplificação por PCR-microesfera para Single-Stranded DNA Amplicons

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic regulatory circuits. The analysis of synthetic genetic regulatory networks in vivo is time consuming and suffers from a lack of environmental control, with exogenous synthetic components interacting with host processes resulting in undesired behavior. To overcome these issues, cell-free characterization of novel circuitry is becoming more prevalent. In vitro transcription and translation (IVTT) mixtures allow the regulation of the experimental environment and can be optimized for each unique system. The protocols presented here detail the fabrication of a multilayer microfluidic device that can be utilized to sustain IVTT reactions for prolonged durations. In contrast to batch reactions, where resources are depleted over time and (by-) products accumulate, the use of microfluidic devices allows the replenishment of resources as well as the removal of reaction products. In this manner, the cellular environment is emulated by maintaining an out-of-equilibrium environment in which the dynamic behavior of gene circuits can be investigated over extended periods of time. To fully exploit the multilayer microfluidic device, hardware and software have been integrated to automate the IVTT reactions. By combining IVTT reactions with the microfluidic platform presented here, it becomes possible to comprehensively analyze complex network behaviors, furthering our understanding of the mechanisms that regulate cellular processes.

The fabrication process of a PDMS-based, multilayer, microfluidic device that allows in vitro transcription and translation (IVTT) reactions to be performed over prolonged periods is described. Furthermore, a comprehensive overview of the hardware and software required to automate and maintain these reactions for prolonged durations is provided.

Uma plataforma Microfluídico multicamada para a condução de expressão gênica sem células prolongada

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. For example, electroporation has been used with great success to study neural and retinal development in Xenopus, chicken and mouse 1-10. However, it is important to note that in all of these studies, investigators were not targeting soft tissues. Because we are interested in craniofacial development, we adapted a method to target facial mesenchyme.
When we searched the literature, we found, to our surprise, very few reports of successful gene transfer into cartilaginous tissue. The majority of these studies were gene therapy studies, such as siRNA or protein delivery into chondrogenic cell lines, or, animal models of arthritis 11-13. In other systems, such as chicken or mouse, electroporation of facial mesenchyme has been challenging (personal communications, Dept of Craniofacial Development, KCL). We hypothesized that electroporation into procartilaginous and cartilaginous tissues in Xenopus might work better. In our studies, we show that gene transfer into the facial cartilages occurs efficiently at early stages (28), when the facial primordium is still comprised of soft tissue prior to cartilage differentiation.
Xenopus is a very accessible vertebrate system for analysis of craniofacial development. Craniofacial structures are more readily visible in Xenopus than in any other vertebrate model, primarily because Xenopus embryos are fertilized externally, allowing analyses of the earliest stages, and facilitating live imaging at single cell resolution, as well as reuse of the mothers 14. Among vertebrate models developing externally, Xenopus is more useful for craniofacial analysis than zebrafish, as Xenopus larvae are larger and easier to dissect, and the developing facial region is more accessible to imaging than the equivalent region in fish. In addition, Xenopus is evolutionarily closer to humans than zebrafish (&tilde;100 million years closer) 15. Finally, at these stages, Xenopus tadpoles are transparent, and concurrent expression of fluorescent proteins or molecules will allow easy visualization of the developing cartilages. We anticipate that this approach will allow us to rapidly and efficiently test candidate molecules in an in vivo model system.

Craniofacial cartilages develop in close contact with other tissues and are difficult to manipulate in live animals. We are using electroporation to deliver molecular tools during growth of the craniofacial skeleton while bypassing early embryonic effects. This approach will allow us to efficiently test candidate molecules in vivo.

Eletroporação de Mesênquima Craniofacial

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern for governments, industries and medical professionals worldwide. For example, EHECs, combined with Shigella, are responsible for the deaths of approximately 325,000 children each year and are particularly prevalent in the developing world where laboratory-based identification, common in the United States, is unavailable 1. The development and distribution of low cost, field-based, point-of-care tools to aid in the rapid identification and/or diagnosis of pathogens or disease markers could dramatically alter disease progression and patient prognosis. We have developed a tool to isolate nucleic acids and proteins from a sample by solid-phase extraction (SPE) without electricity or associated laboratory equipment 2. The isolated macromolecules can be used for diagnosis either in a forward lab or using field-based point-of-care platforms. Importantly, this method provides for the direct comparison of nucleic acid and protein data from an un-split sample, offering a confidence through corroboration of genomic and proteomic analysis.
Our isolation tool utilizes the industry standard for solid-phase nucleic acid isolation, the BOOM technology, which isolates nucleic acids from a chaotropic salt solution, usually guanidine isothiocyanate, through binding to silica-based particles or filters 3. CUBRC's proprietary solid-phase extraction chemistry is used to purify protein from chaotropic salt solutions, in this case, from the waste or flow-thru following nucleic acid isolation4.
By packaging well-characterized chemistries into a small, inexpensive and simple platform, we have generated a portable system for nucleic acid and protein extraction that can be performed under a variety of conditions. The isolated nucleic acids are stable and can be transported to a position where power is available for PCR amplification while the protein content can immediately be analyzed by hand held or other immunological-based assays. The rapid identification of disease markers in the field could significantly alter the patient's outcome by directing the proper course of treatment at an earlier stage of disease progression. The tool and method described are suitable for use with virtually any infectious agent and offer the user the redundancy of multi-macromolecule type analyses while simultaneously reducing their logistical burden.

A tool and chemistries are described to sequentially isolate nucleic acids followed by proteins from a sample without the need for electricity. The tool consists of a sorbent held within a transfer pipette while the isolation chemistries are based on solid-phase extraction principles. The isolated macromolecules can be analyzed by immuno-based and PCR-based assays.

Electricidade-Free, Ácido Nucleico seqüencial e isolamento de proteínas

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

The Fabrication and Operation of a Continuous Flow, Micro-Electroporation System with Permeabilization Detection

Current therapeutic innovations, such as CAR-T cell therapy, are heavily reliant on viral-mediated gene delivery. Although efficient, this technique is accompanied by high manufacturing costs, which has brought about an interest in using alternative methods for gene delivery. Electroporation is an electro-physical, non-viral approach for the intracellular delivery of genes and other exogenous materials. Upon the application of an electric field, the cell membrane temporarily allows molecular delivery into the cell. Typically, electroporation is performed on the macroscale to process large numbers of cells. However, this approach requires extensive empirical protocol development, which is costly when working with primary and difficult-to-transfect cell types. Lengthy protocol development, coupled with the requirement of large voltages to achieve sufficient electric-field strengths to permeabilize the cells, has led to the development of micro-scale electroporation devices. These micro-electroporation devices are manufactured using common microfabrication techniques and allow for greater experimental control with the potential to maintain high throughput capabilities. This work builds off a microfluidic-electroporation technology capable of detecting the level of cell membrane permeabilization at a single-cell level under continuous flow. However, this technology was limited to 4 cells processed per second, and thus a new approach for increasing the system throughput is proposed and presented here. This new technique, denoted as cell-population-based feedback control, considers the cell permeabilization response to a variety of electroporation pulsing conditions and determines the best-suited electroporation pulse conditions for the cell type under test. A higher-throughput mode is then used, where this 'optimal' pulse is applied to the cell suspension in transit. The steps for fabricating the device, setting up and running the microfluidic experiments, and analyzing the results are presented in detail. Finally, this micro-electroporation technology is demonstrated by delivering a DNA plasmid encoding for green fluorescent protein (GFP) into HEK293 cells.

This protocol describes the microfabrication techniques required to build a lab-on-a-chip, microfluidic electroporation device. The experimental setup performs controlled, single-cell-level transfections in a continuous flow and can be extended to higher throughputs with population-based control. An analysis is provided showcasing the ability to electrically monitor the degree of cell membrane permeabilization in real-time.

A Fabricação e Operação de um Sistema de Micro-Eletroporação de Fluxo Contínuo com Detecção de Permeabilização

Current therapeutic innovations, such as CAR-T cell therapy, are heavily reliant on viral-mediated gene delivery. Although efficient, this technique is ...

Dispositivo microfluídico para isolamento contínuo de vesículas extracelulares da urina humana

Single Step Isolation of Extracellular Vesicles from Large-Volume Samples with a Bifurcated A4F Microfluidic Device

Extracellular vesicles (EVs) hold immense potential for various biomedical applications, including diagnostics, drug delivery, and regenerative medicine. Nevertheless, the current methodologies for isolating EVs present significant challenges, such as complexity, time consumption, and the need for bulky equipment, which hinders their clinical translation. To address these limitations, we aimed to develop an innovative microfluidic system based on cyclic olefin copolymer-off-stoichiometry thiol-ene (COC-OSTE) for the efficient isolation of EVs from large-volume samples in a continuous manner. By utilizing size and buoyancy-based separation, the technology used in this study achieved a significantly narrower size distribution compared to existing approaches from urine and cell media samples, enabling the targeting of specific EV size fractions in future applications. Our innovative COC-OSTE microfluidic device design, utilizing bifurcated asymmetric flow field-flow fractionation technology, offers a straightforward and continuous EV isolation approach for large-volume samples. Furthermore, the potential for mass manufacturing of this microfluidic device offers scalability and consistency, making it feasible to integrate EV isolation into routine clinical diagnostics and industrial processes, where high consistency and throughput are essential requirements.

Autor em destaque: Fracionamento de fluxo de campo assimétrico para integração de biorreatores

Extracellular vesicles hold immense promise for biomedical applications, but current isolation methods are time-consuming and impractical for clinical use. In this study, we present a microfluidic device that enables the direct isolation of extracellular vesicles from large volumes of biofluids in a continuous manner with minimal steps.

Isolamento em Etapa Única de Vesículas Extracelulares de Amostras de Grande Volume com Dispositivo Microfluídico A4F Bifurcado

Extracellular vesicles (EVs) hold immense potential for various biomedical applications, including diagnostics, drug delivery, and regenerative medicine. ...

Microescala Electroporator para entrega Sequential Molecular assistida por Vortex

Resumo

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Aproveitando-se de Redução Interação gota-superfície para otimizar o transporte de Bioanalytes em microfluídica Digital

Multiplexação e transfecção de plasmídeo de DNA de alta produtividade usando tecnologia de Nanodosagem acústica

High Speed Delivery System Droplet-based para Passive Bombeamento em dispositivos microfluídicos

Uma plataforma Microfluidic de ultra alta taxa de transferência para o sequenciamento do genoma de célula única

Uma abordagem Microfluidic gotículas e amplificação por PCR-microesfera para Single-Stranded DNA Amplicons

Uma plataforma Microfluídico multicamada para a condução de expressão gênica sem células prolongada

Eletroporação de Mesênquima Craniofacial

Electricidade-Free, Ácido Nucleico seqüencial e isolamento de proteínas

A Fabricação e Operação de um Sistema de Micro-Eletroporação de Fluxo Contínuo com Detecção de Permeabilização

Isolamento em Etapa Única de Vesículas Extracelulares de Amostras de Grande Volume com Dispositivo Microfluídico A4F Bifurcado

Microescala Electroporator para entrega Sequential Molecular assistida por Vortex

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Aproveitando-se de Redução Interação gota-superfície para otimizar o transporte de Bioanalytes em microfluídica Digital

Multiplexação e transfecção de plasmídeo de DNA de alta produtividade usando tecnologia de Nanodosagem acústica

High Speed ​​Delivery System Droplet-based para Passive Bombeamento em dispositivos microfluídicos

Uma plataforma Microfluidic de ultra alta taxa de transferência para o sequenciamento do genoma de célula única

Uma abordagem Microfluidic gotículas e amplificação por PCR-microesfera para Single-Stranded DNA Amplicons

Uma plataforma Microfluídico multicamada para a condução de expressão gênica sem células prolongada

Eletroporação de Mesênquima Craniofacial

Electricidade-Free, Ácido Nucleico seqüencial e isolamento de proteínas

A Fabricação e Operação de um Sistema de Micro-Eletroporação de Fluxo Contínuo com Detecção de Permeabilização

Isolamento em Etapa Única de Vesículas Extracelulares de Amostras de Grande Volume com Dispositivo Microfluídico A4F Bifurcado

High Speed Delivery System Droplet-based para Passive Bombeamento em dispositivos microfluídicos