Este trabajo fue apoyado por becas CRUK 15.043 y 14.251 CRUK. Damos las gracias a Daniel Wetterskog y Ka Kei Ho para la asistencia técnica y la lectura crítica del manuscrito.

1. Experimental Perturbación y Etiquetado celular para marcadores de respuesta (Reversa transfección siRNA pantalla) <ol><li> En una pipeta campana de cultivo de tejido estéril 70 l de 200 nM siRNA en tampón 1x siRNA en pocillos de una placa estéril, llano de 96 pocillos. Diluir lípidos transfección en 40 volúmenes de medio DMEM libre de suero y dispensar 105 l en cada pocillo que contiene siRNA. NOTA: La dilución de 262,5 l lipídico en 10.5 ml de suero libre de DMEM produce una mezcla maestra adecuado para un plato entero de 96 pocillos de siRNA, la entrega de 2,6 l de lípidos por pocillo. El uso de 200 nM siRNA concentración de partida en este paso entregará una concentración de trabajo de 20 nM en el paso 1.3, pero los procedimientos de trabajo para las concentraciones de trabajo hasta 5 nM, con la concentración de partida ajustado en consecuencia (es decir, 50 nM). Baja concentración de trabajo puede reducir las puntuaciones positivas falsas fuera de objetivo, aunque pueden reducir la magnitud de la respuesta en el blanco, lo que lleva al aumento de la sobre-Target tasas de falsos negativos. </li><li> Mezclar la placa por la vibración suave durante diez minutos a temperatura ambiente. La división de las 175 l resultantes en tres 50 l réplicas por objetivo en una, cultivo de tejidos opacos tratada, placa de 96 pocillos con una base transparente. </li><li> Transfectar inversa mediante la supresión de 8.000 células por pocillo en 150 l DMEM que contiene 10% de suero directamente sobre los complejos lípido-siRNA 50 l. Células colorrectales humanos Uso HCT116 que expresan establemente un marcador BPA de etiquetado informar la actividad de CDK2 5,8. No es necesaria una mezcla adicional. Sellar la placa con un adhesivo membrana transpirable estéril para controlar la humedad y evitar &#39;borde efectos&#39; de placa y colocar la placa en un incubador humidificado a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 48 horas. </li><li> Aspirar los medios de comunicación de tal manera que una pequeña cantidad residual de los medios de comunicación permanece en los pocillos. Fijar las células mediante la adición de 100 l de formaldehído al 4% tamponado a cada pocillo e incubar en una campana de humos durante 10 min en la sala de temperature. </li><li> Retire la solución de fijación aspirando la placa. En este punto, bien interrumpir el experimento mediante el lavado de la placa tres veces con 100 l de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y luego Almacenar sellada, menos de 100 l de PBS en la oscuridad a 4 ° C durante un máximo de una semana, o continuar con la la permeabilización de las células. NOTA: Recomendamos placas de procesamiento tan pronto como sea posible después de la fijación, y por lo general prefieren el almacenamiento de placas totalmente elaborados. Conservantes biocidas tales como timerosal, azida de sodio, o alternativas comerciales se pueden añadir para prevenir el crecimiento micoroganismal. La adición de inhibidores de la fosfatasa ayuda a preservar fosfo-epítopos, y otros medios para preservar los estados de modificación de proteínas puede ser útil en contextos de ensayo pertinentes </li><li> Retirar PBS de la placa y permeabilizar las células mediante la adición de 100 l de solución de permeabilización. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente sin agitación. Aspirar la solución de permeabilización utilizando un Multichpipeta annel. Repita este paso tres veces. </li><li> Bloquear las células mediante la adición de solución de bloque de 100 l por pocillo durante 30 min a temperatura ambiente. Eliminar la solución de bloqueo mediante la aspiración de la placa, a continuación, la sonda con 50 l de anticuerpo contra RB1 P-S780 diluido 500 veces en la solución de bloque durante 2 horas en la oscuridad a temperatura ambiente. </li><li> Lavar la placa tres veces con solución de lavado placa de 100 l, dejando la solución en la placa durante 5 min cada vez. Sonda de la placa durante la noche en la oscuridad a 4 ° C con 50 l fluorescentemente marcada con anticuerpo secundario diluido 1000 veces en solución de bloqueo suplementado con 2 mM del colorante de ADN específico de la cromatina bisbenzimide. Lavar la placa tres veces antes y tienda de sellado, por debajo de 100 l de PBS en la oscuridad a 4 ° C. Imagen de la placa dentro de dos semanas. </li></ol> 2. Imágenes y segmentación de imágenes <ol><li> Utilice un microscopio confocal o girando el disco de fluorescencia con un objetivo 20X tomar separado 16-bit, imágenes TIFF en escala de grises en tres canales correspondientes a la tintura de ADN, las buenas prácticas agrarias y fluoróforos inmuno-tinción. Capture muchos conjuntos de imágenes que no se superponen, a que se refiere aquí como marcos, a imagen de aproximadamente 1.000-2.000 células por pocillo. </li><li> Nombre de los archivos de imagen de forma sistemática para que cada nombre de archivo es una combinación única de &#39;nombre del experimento &quot;,&quot; dirección bien&#39;, &#39;número de cuadro&#39; y &#39;identificador de canal&#39;, en este orden (Figura 3). El conjunto de datos de ejemplo utiliza (tinción cromatina ADN) o &quot;verde&quot; (GFP) o &quot;Red&quot; (fluoróforo inmuno-manchado) como identificadores de canal &quot;Blue&quot;. La dirección también, número de bastidor y el canal identificador están más adelante referido como los metadatos de la imagen. Utilice el símbolo de subrayado que no induzca bien y el marco de metadatos. </li><li> Nombre de los archivos con estos elementos de metadatos en el orden especificado. Esto es necesario para asegurar que los pasos de software posteriores Correagrupar conjuntos ctly de imágenes para el análisis. </li><li> Descargue e instale el software gratuito de la célula de perfiles, Active Perl Community Edition, entorno de programación estadística R y RStudio. Aceptar todas las opciones por defecto durante la instalación; Los usuarios de PC instalar Active Perl deberían permitir a todas las opciones relacionadas con PATH, asociación extensión de archivo y el mapeado de scripts donde se le indique. Activo Perl es opcional para los usuarios de Mac, pero de lo contrario tendrá que ejecutar el script de Perl en el paso 3.2 de la línea de comandos de terminal en lugar de utilizar el icono de clic. </li><li> Abra el software Profiler célula, haga clic en &quot;Archivo&quot;, &quot;Importar Pipeline&quot; entonces &quot;Desde archivo&quot; y seleccione el archivo 3_channels_pipeline.cppipe (Figuras S1A y S1B). El archivo contiene las instrucciones necesarias para el software de interpretar metadatos de imágenes de archivo en la convención de nombre de archivo se describe. Profiler célula ahora relaciona las imágenes, extractos de ADN nuclear y las intensidades de anticuerpos del XXESE y utiliza el canal de las buenas prácticas agrarias para calcular la relación de la energía nuclear frente a la intensidad citoplasma de cada célula detectados (Figuras 4 y 5). </li><li> Haga clic en el botón &quot;Ver los ajustes de salida&quot; en la esquina inferior izquierda de la ventana de perfiles Cell. En la parte superior de la nueva pantalla son cuadros de texto etiquetados &#39;carpeta predeterminada de entrada &quot;y&quot; Carpeta de salida por defecto&#39;. Uno a la vez, haga clic en la carpeta iconos a la derecha de estas cajas y seleccione la ubicación de los archivos de imagen para el análisis y el destino de los datos extraídos, respectivamente (Figura S1C). </li><li> Comienza el análisis de la imagen pulsando el botón &quot;Analizar las imágenes &#39;en la esquina inferior izquierda de Profiler célula. En la parte inferior de la pantalla observar el tiempo restante para la extracción de datos, el &#39;Análisis Stop&#39; y los botones de &quot;pausa&quot;. Si es necesario hacer una pausa en el análisis seleccionando el botón &#39;Pause&#39; en cualquier momento, lo cual es útilal ver las imágenes que se analiza (descrito en el paso 2.8). </li><li> Opcionalmente, abra las ventanas para cualquiera de las etapas de análisis de imagen haciendo clic en los iconos de ojo en el panel de la extrema izquierda de la ventana del programa (Figura S1D). Observe la ventana &#39;IdentifyPrimaryObjects&#39; y los de &#39;secundarias&#39; y &#39;Objetos Terciario&#39; para comprobar que la configuración actual en el Perfil de la célula para realizar la segmentación de imágenes son adecuadas (ver Figura 1 y Discusión para el asesoramiento sobre la modificación de estos parámetros). </li><li> Haga clic en &quot;Aceptar&quot; en el cuadro de mensaje que aparece cuando se completa el análisis. Ir a &#39;Default Carpeta de salida &quot;el lugar donde todos los archivos de datos con los resultados se guardan como separada por comas de valores (.csv) (Figura S2A). </li></ol> 3. Extracción de datos <ol><li> Encuentra el nuevo archivo &#39;Nuclei.csv&#39;, que se incluye entre lossalida del Profiler Cell. Este archivo contiene datos de las celdas individuales de intensidad anticuerpo nuclear fluorescente, la intensidad de ADN nuclear y valores de la relación periodista-GFP CDK2 (Figuras 6A y S2A). NOTA: Diferentes laboratorios querrán procesar este tipo de datos para adaptarse a la naturaleza de sus propios ensayos. Sugerido para el de datos actual es el gating de las células de cada condición de tratamiento de acuerdo con los datos de anticuerpos y los valores reportero GFP-CDK2 utilizando el script Perl proporcionado &#39;2_gate_classifier.pl&#39;. </li><li> Copie el archivo de script de Perl proporcionado &#39;2_gate_classifier.pl&#39; en la misma carpeta que el archivo de datos &#39;Nuclei.csv&#39; (Figura S2A). Haga doble clic en el icono para el script de Perl y, cuando se le solicite, escriba el nombre completo del archivo de datos seguido por un &#39;.csv&#39; nombre nombre para el archivo en el que las células han de ser cerrada y finalmente los valores de compuerta para el anticuerpofluorescencia y datos reportero GFP-CDK2. NOTA: Cómo determinar principalmente ajustes de la compuerta y aplicarlos para el análisis de los datos se analizan a continuación en la sección Datos Representante y la Figura 6 (para analizar los datos proporcionado uso &#39;0.004&#39; y &#39;1.5&#39;, respectivamente). Los usuarios de Mac deben ejecutar el script de Perl desde la línea de comandos de terminal escribiendo: &#39;perl 2_gate_classifier.pl&#39;. </li><li> Observe el archivo recién creado que combina los valores de ensayo de células individuales primas partir de los datos del analizador Cell originales con etiquetas sub-población que muestran cómo cada célula de cada pocillo realiza contra dos puertas (Figura 6C). </li><li> Grafica los datos para cada condición experimental usando las etiquetas de subpoblación de células individuales mediante la apertura del software RStudio. Haga clic en &quot;Archivo&quot; y &quot;Abrir archivo&quot;, a continuación, seleccione el archivo &#39;analysis.r »prevista. Observe los comandos para trazar figuras 6B, <strong&gt; 7 y 8 en la ventana superior izquierda de RStudio (Figura S2 B). En la ventana superior izquierda, entre los símbolos de comillas dobles en las líneas 5 y 6, escriba la dirección del equipo de la carpeta que contiene los datos cerrados. Incluya la letra de unidad y el nombre del archivo en sí, respectivamente (por ejemplo, &quot;C: / carpeta / análisis de los resultados del análisis&quot; y &quot;nuclei_gated.csv&quot;). NOTA: Si RStudio se utiliza por primera vez en un equipo determinado, necesitará el paquete de gráficos R &#39;ggplot2&#39; para instalarse primero. Esto es una vez único paso para una nueva instalación de RStudio, después de que este paso se vuelve redundante. Para instalar &#39;ggplot2&#39;, haga clic en la pestaña llamada &quot;paquetes&quot; por encima de la ventana en la esquina inferior derecha de RStudio, haga clic en el botón &#39;Instalar paquetes&#39; que aparece debajo de esta. Aparecerá una nueva ventana. Tipo &#39;ggplot2&#39; (citas omitiendo) en el &#39;paquetes&#39; sritmo en esta nueva ventana y, finalmente, haga clic en el botón &quot;Instalar&quot; para cerrar la ventana, instale las funciones ggplot2 necesarias y volver a la ventana principal RStudio para continuar desde el paso 3.6. </li><li> Resaltar líneas 1 a la 17 en la ventana superior izquierda de RStudio, a continuación, haga clic en el botón &quot;Ejecutar&quot;. Se ingresa los datos experimentales, los valores de umbral y detalles de la ubicación así a R (Figura S2C). R ahora mantener temporalmente los datos relevantes para el trazado. </li><li> Resaltar bloques individuales del código restante debajo de la línea 17 y crear las parcelas correspondientes haciendo clic en el botón &quot;Ejecutar&quot; como antes. Observar las parcelas en la ventana en la esquina inferior derecha de RStudio y guardar varios formatos haciendo clic en el botón &quot;Exportar&quot; (Figura S2D). </li><li> Mientras se cierra RStudio, haga clic en &#39;No guardar &quot;cuando se le solicite. Esto evita confusión en el siguiente uso del RStudio, que de otro modo celebrará datosde la sesión anterior. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar

El flujo de trabajo descrito constituye un procedimiento para la perturbación de múltiples pocillos de células utilizando siRNA, la detección de marcadores posterior y finalmente uso de una serie de pasos de software soportado para facilitar la extracción de los datos cuantitativos de las imágenes de microscopía fluorescente resultantes. El enfoque se centra en la entrega de valores de intensidad nucleares y citoplasmáticas de las células individuales, que tiene una amplia aplicación práctica en muchas aplicaciones basadas en células. Los datos de ejemplo utilizados aquí se generaron en un ajuste de la pantalla siRNA en el que dos ensayos fluorescentes para el tránsito del ciclo celular en fase G1 se prueban y se correlacionan de nuevo a una medida más directa biofísico del contenido de ADN nuclear. El uso de una mancha de ADN fluorescente de ADN nuclear imagen es un paso indispensable en el proceso de segmentación de imágenes, ya que permite la identificación de células individuales y la resultante &#39;Núcleos máscara&#39; sirve como el punto de partida para identificar correspondiente cytoplasmiregiones c. El reportero CDK2 GFP-etiquetados, que se expresa de forma estable en las células, da una variable todavía consistentemente más alta que la señal de fondo en el citoplasma por la cual este compartimiento se puede delinear. El mismo análisis de tuberías debe ser aplicable al análisis de los eventos de translocación de proteínas utilizando otros reporteros de fluorescencia ligada adecuados y su respuesta a la perturbación. Además, sustituyendo el reportero GFP-CDK2 con tintes fluorescentes-citoplasma específica permitiría el uso alternativo de este algoritmo para medir las dimensiones del citoplasma y los tamaños relativos de las células en las imágenes. Otra consideración de diseño en la estrategia de segmentación de imagen descrito aquí es el uso de la célula de perfiles para ofrecer valores de intensidad integrados para la cuantificación de ADN. Integración de la intensidad de valores para los datos de tinción de ADN nuclear permiten posibles variaciones en el tamaño núcleo, y representa una coincidencia cercana para los perfiles de cuantificación vistopara yoduro de propidio manchado FACS datos. Sin embargo, la intensidad integrada no puede proporcionar un medio adecuado para evaluar la función de la proteína donde la concentración media, ejemplificada por la intensidad media de fluorescencia antígeno, es biológicamente más relevante que la cantidad total integrado de proteína (y fluorescencia asociada) dentro de un compartimento celular. Por lo tanto significan valores de intensidad se utilizaron para la P-S780 RB1 y los datos GFP. La opción para alterar entre los dos modos (media o integrado) de la evaluación de los datos se encuentran en el panel &#39;ExportToSpreadsheet&#39; del software Profiler célula. Los ajustes de análisis en el archivo 3_channels_pipeline.cppipe están optimizados para las imágenes en el conjunto de datos de ejemplo. Análisis de nuevas imágenes conjuntos con este protocolo, será necesario que los nombres de archivo adoptan la convención de nombres descrita anteriormente (Figura 3). Además, la sensibilidad valora adecuada a la luminosidad de la tinción de ADN nuclear y umbrales para el fondointensidades en los nuevos conjuntos de imágenes pueden necesitar ser ajustado dentro de la configuración del analizador Cell. Dado el papel clave de la tinción de ADN se mantiene para la construcción de las diversas máscaras de segmentación de imágenes, la aplicación de ajustes de sensibilidad correctos para este canal es clave para el análisis exitoso de nuevos datos de la imagen con el software Profiler Cell. El archivo de configuración proporcionado Profiler celular (3_channels_pipeline.cppipe) contiene notas sobre los parámetros más útiles para adaptar el análisis de nuevos datos. Estas notas están en el cuadro de texto en la parte superior de la pantalla en la ventana principal de Profiler celular e incluyen una guía sobre cómo cambiar los ajustes de sensibilidad y ajustar el número de canales a analizar. Como acusado en la sección Protocolo 2.8, para probar la configuración de los nuevos datos de la imagen puede ser necesario para observar la segmentación de imágenes durante el análisis de la imagen haciendo clic en Abrir los iconos de &quot;ojo&quot; para cada uno de los &#39;Identificar ... Objetos&#39; pasos del protocolo (Figura S1D </strong&gt;). En particular, la visualización de los datos de imagen a través de &#39;IdentifyPrimaryOjects&#39; mostrará si la máscara núcleos se identifica correctamente a partir de imágenes de la tinción de ADN. En la página de software Profiler célula para módulo de los &#39;IdentifyPrimaryOjects&#39; es el factor de corrección umbral. Ensayo y error de ajuste de este valor se solucionará la mayoría de los errores de reconocimiento nucleares. Los valores de balance del canal de ADN contra la intensidad de fondo para cada imagen. Los valores del factor de corrección Umbral giran en torno a 1, donde mayor que este es más riguroso (bueno para imágenes claras) y menos de 1 El indulgente (adecuado para imágenes con menos contraste entre las manchas y fondo). La salida de los datos en bruto de células individuales de Profiler célula puede ser analizado en diferentes maneras para adaptarse a las necesidades de los otros estudios. Aquí se muestra el uso de un script Perl para aplicar puertas a dos de los parámetros medidos por célula con el fin de ayudar a la extracción de las tendencias biológicas de la una de datosd permiso de referencias cruzadas de las subpoblaciones identificadas con medidas adicionales. Aunque también es posible incluir elementos de compuerta en el marco de Profiler célula, la ruta alternativa utilizada aquí proporciona una mayor flexibilidad y rapidez, especialmente si grandes conjuntos de datos deben ser evaluados. La etapa más lenta en las fases de adquisición posterior de las imágenes del protocolo actual es la ejecución del software Profiler célula. Perfilador Cell aquí se ejecuta sin imponer puertas para producir un conjunto de datos en bruto no-cerrada que puede ser reanalyzed con el script Perl posterior más rápida y, si es necesario, de forma iterativa con valores diferentes de puerta. No todos los estudios sabrán de antemano los valores de compuerta adecuados como esto puede variar con los reactivos en cualquier conjunto dado de datos, y potencialmente con el tiempo. Es, por tanto, se recomienda para generar histogramas que representan la distribución de los datos en bruto obtenido a partir de perfiles de la célula para los controles positivos y células maqueta perturbados con el fin de identificar Valu puerta adecuadaes para los parámetros de interés. Los scripts de Perl se escriben a aceptar una estructura de columnas definidas rígidamente de datos de perfiles de la célula y puede dejar de funcionar si un usuario modifica el número de parámetros de salida por Profiler célula usando las configuraciones del &#39;ExportToSpreadsheet&#39;. Para ayudar a implementar la modificación de la configuración de las notas se incluyen dentro de los archivos de script de Perl. Para ver estos ver la secuencia de comandos en un editor de texto, preferiblemente editor de texto para programadores de Perl establece en elementos de código de color (por ejemplo, http://www.activestate.com/komodo-edit). Estas notas indican dónde ajustar la secuencia de comandos para adaptarse a los cambios de formato de datos. De manera similar a los scripts de Perl, el archivo de código R proporcionado (analysis.r), que contiene las instrucciones para el trazado de las cifras de los datos de análisis de imagen, se puede leer en un editor de texto o software RStudio ver notas adicionales sobre el uso y la adaptación. Estas notas pueden ser complementados con información detallada sobre expresiones regulares y Perl &lt;sup&gt; 12 y el paquete ggplot2 13 para R, los cuales forman la base de cómo se leen los datos, anotado y se representa, respectivamente. Nuevos estudios utilizando microscopía de fluorescencia, así como datos brutos depositados en las publicaciones de código abierto son susceptibles a métodos de análisis tales como los descritos aquí. La propia naturaleza de los datos de alta contenido se presta para el análisis recursivo con diferentes énfasis analíticos en función de los intereses de investigación de cualquier observador dado. Aunque las preguntas que se pueden hacer de los datos están limitados por las sondas utilizadas originalmente, los datos de imagen a menudo pueden ser significativamente volvieron a analizar más allá del ámbito de los estudios que los generaron.

El trabajo presentado aquí describe el uso de la Profiler software Cell libremente disponible para realizar desglose algoritmo de guiado de imágenes de microscopía de fluorescencia de las células adherentes para identificar las células individuales y regiones subcelulares definidos. Este enfoque, conocido como segmentación de la imagen, permite el análisis multi-paramétrico posterior de las células fotografiadas mediante la cuantificación de los marcadores marcados con fluorescencia localizadas a cada célula o región subcelular (denominado como objetos segmentados). Este flujo de trabajo es la base para permitir el análisis de alto contenido y está destinado a servir como una herramienta que pueda desarrollarse y modificarse para adaptarse a multiparamétrica, célula individual analiza en laboratorios que no tienen acceso a los instrumentos de alto contenido especializado o software propietario. Los archivos suministrados con este manuscrito se compone de un conjunto de pruebas de datos de imágenes en bruto pertinentes, configuración del algoritmo y scripts de apoyo para generar el análisis descrito. La configuración del algoritmo proporcionado fo Profiler célula están optimizados para el conjunto de datos de ejemplo y los detalles de la sección Discusión qué puede ser necesario ajustar para permitir el uso de datos de imágenes de otros estudios. Una vez que los datos cuantitativos se ha extraído usando el Perfil de la célula, los diferentes laboratorios pueden tener diferentes requisitos para el uso de la información presentada por los valores de las celdas individuales en los datos en bruto; Aquí se muestra un método por el cual las puertas se aplican a los datos en bruto para cada ensayo. El uso de estas puertas, los datos se transforman en términos binarios de respuesta, permitiendo la visualización de las tendencias enlazan diferentes tratamientos con las subpoblaciones de células que experimentan respuesta definido por las puertas. Las puertas se establecen basándose en observaciones de las distribuciones de datos obtenidos para controles positivos y negativos apropiados para cada medición relevante. El uso de puertas es sólo un ejemplo de cómo manejar las mediciones primas, basadas en células. También se muestra aquí es el uso de la intensidad del ADN nuclear míasurements en su forma cruda como un rango continuo de valores, en combinación con los datos cerrados. Se deben considerar otros enfoques para la gestión de datos de análisis de imagen, dependiendo de la naturaleza del estudio; alternativas estadísticas al uso de puertas para la asignación de las células a las subpoblaciones se han reportado 2 y sistemáticas las comparaciones de estrategias para resumir los datos de alto contenido a través de un gran número de parámetros se han reportado 3. Análisis de alto contenido de datos de imagen han encontrado uso en estudios celulares de droga-respuesta, revertir la genética y el estrés ambiental señalización 4-6. El mérito de análisis de alto contenido deriva del hecho de que el análisis algorítmico de datos de microscopía de fluorescencia permite que los parámetros cuantitativos y espaciales que deben considerarse simultáneamente a través de las células individuales 7. De esta manera, los resultados celulares para múltiples ensayos pueden ser un comportamiento referencia cruzada, diferencial de ensayo-dsubpoblaciones de células efined pueden ser rastreados en condiciones experimentales y ensayos pueden incluir la consideración de las variables morfológicas. La estrategias y análisis de flujo de trabajo discutido aquí, como para otros enfoques de alto contenido, son capaces de entregar datos multiplexados que son referencias cruzadas a las células individuales. Estudios de alto contenido de métodos traje que generan imágenes de microscopio fluorescente y que son aplicables al análisis de los datos que van desde decenas de imágenes producidas en microscopía basada en fluorescencia convencional de bajo rendimiento a través de las miles de imágenes producidas utilizando plataformas de alto contenido de detección automáticos. El flujo de trabajo se ilustra aquí con datos de ejemplo de la cual ensayos separados se miden en términos de cualquiera de las intensidades de marcadores fluorescentes nucleares o translocación citoplasmática / nuclear de una proteína fluorescente reportero, respectivamente. El flujo de trabajo es flexible en que estos ensayos se pueden considerar por separado o en combinación dependiendo de EACh dada pregunta de investigación por diferentes investigadores. Los datos de ejemplo se producen como parte de un ARN de interferencia (RNAi) experimento (Figura 1). Oligonucleótidos pequeños ARN de interferencia (siRNA) se utilizan para desmontables proteínas específicas en células de carcinoma colorrectal humano HCT116 que resultan en cambios para dos reporteros fluorescentes de quinasa (CDK) la actividad dependiente de ciclina. La fosforilación CDK6 dependiente de la proteína retinoblastoma nuclear en la serina 780 (P-S780 RB1) se evaluó mediante tinción de anticuerpos. En las mismas células, un reportero de la proteína verde fluorescente marcada de la actividad CDK2 (reportero GFP-CDK2) es evaluada por su relación núcleoicitoplasma donde en ausencia de la actividad de CDK2 el periodista reside en el núcleo y en lanzaderas de activación CDK2 en el citoplasma 8. Además, el ADN nuclear de cada célula se tiñe usando un colorante intercalante de ADN, bisbenzimide, que sirve como un medio para identificar las células y definir las fronteras núcleos en las imágenes así unasa medida de la abundancia de ADN proporcionar información sobre la posición del ciclo celular de la célula (Figura 2). Las actividades de CDK2 y CDK6 son detectables como células de tránsito de G1 a la fase S del ciclo celular 5 y suceden unos a otros 9,10 y, como tal, se espera que cerca de concordancia entre los dos reporteros en células individuales. El conjunto de datos de demostración utilizado aquí como un ejemplo analiza el efecto de siRNA dirigido a CDK6, la proteína retinoblastoma (RB1) y un control negativo no dirigido (Tabla 1). Desmontables de CDK6 debe obtener tanto una disminución de la RB1 epítopo P-S780 y una acumulación de células en la fase G1 del ciclo celular. La caída RB1 sirve como control reactivo para la especificidad del anticuerpo fosfo-S780. Imágenes de microscopio de fluorescencia de formalina fijos 11, las células de cultivo de tejidos teñidos con fluorescencia HCT116 se utilizan para análisis de imagen algorítmica. Los datos numéricos resultante se utiliza entonces parareferencias cruzadas a los reporteros y medir el impacto de los diferentes estados de derribo. El tamaño potencial de los datos producidos por este tipo de análisis puede presentar un desafío para las herramientas de análisis normales. Por ejemplo, los datos de las celdas individuales pueden ser mayores que un cierto software de hoja de cálculo tendrá en cuenta. Incluido son scripts de Perl que realizan el procesamiento simple, altamente repetitivo, supervisado de los datos para facilitar el análisis de grandes conjuntos de datos. Los scripts de Perl están escritos específicamente para los archivos de salida producidos por la célula de perfiles, al procesar archivos de imagen con una denominación de archivos específico (Figura 3), y permiten un número variable de campos por pocillo para ser utilizados en el análisis. Con frecuencia es importante a los datos de ensayo de célula individual puerta para rastrear las tendencias en las subpoblaciones de células 5 y se muestra aquí es el uso de un script Perl para marcar cada célula sobre la base de una puerta conjunto predeterminado para cada tipo de ensayo. También se incluyen los scripts de Perl opcionalesque resumen los resultados de datos para los pozos individuales (o condiciones), la entrega de: porcentaje de células dentro de la puerta de conjunto y los valores medios de las puntuaciones de ensayo primas. La forma última, más homogénea de la visualización de los datos, es válido que las respuestas afectan a la totalidad o la mayoría de las células dentro de un pozo. Como se discutió anteriormente, dicha evaluación es menos útil que la proporcionada por el gating datos célula individual donde la respuesta se limita a un subconjunto de células dentro de una población. La utilidad del flujo de trabajo descrito no se limita a la perturbación por siRNA o los ensayos de marcadores descritos. Los estudios han usado este enfoque para ensayar respuestas en experimentos de cultivo de tejidos que utilizan combinaciones de siRNA, inhibidores químicos y tratamiento de radiación y para la evaluación de marcadores distintos de la actividad de CDK2 y CDK6 5. Conceptualmente, la estrategia experimental permite una variedad de regiones subcelulares biológicamente útiles que se registra automáticamenteen las células individuales presentes en las imágenes de microscopio de fluorescencia. Como tal, este enfoque puede dar datos multiplexados revelar información cuantitativa, biológicos que pueden ser ignorados a través de técnicas que se centran en las poblaciones en lugar de las células individuales. Con modificaciones menores, el enfoque y el análisis de flujo de trabajo descrito se puede producir, datos celulares individuales cuantitativos para las salidas de ensayo basado en fluorescencia y respuestas de células biológica, donde la evaluación cuantitativa del contenido de ADN, la cuantificación de la fluorescencia nuclear o citoplásmica o la shuttling de los marcadores entre estos dos compartimentos ya sea individualmente o en forma multiplexada es de interés. Como requisitos de publicación tienden cada vez más a la presentación de los datos en bruto en acceso abierto, el acceso y la familiaridad con herramientas libres para el análisis de imágenes de microscopía, como los descritos aquí también será de interés directo para los laboratorios que buscan volver a analizar los datos publicados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="604">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:103px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AllStars negative control siRNA</td>
			<td style="width:103px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1027280</td>
			<td style="width:167px;">Negative control siRNA.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">CDK6 siRNA</td>
			<td style="width:103px;">Dharmacon/ Custom synthesis</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">Antisense sequence: 5&#39; CUCUAGGCCAGUCUUCUUCUU</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">RB1 siRNA</td>
			<td style="width:103px;">Dharmacon/ Custom synthesis</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">Antisense sequence: 5&#39; GGUUCAACUACGCGUGUAATT</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">5x siRNA buffer</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Scientific</td>
			<td>B-002000-UB-100</td>
			<td style="width:167px;">To be diluted with nuclease-free, non-DEPC treated water.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nulcease-free water (non-DEPC)</td>
			<td style="width:103px;">Applied Biosystems</td>
			<td>AM9937</td>
			<td style="width:167px;">For dilution of siRNA buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hiperfect</td>
			<td style="width:103px;">Qiagen</td>
			<td align="right">301705</td>
			<td style="width:167px;">Transfection lipid.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:103px;">Life Technologies</td>
			<td align="right">41966052</td>
			<td style="width:167px;">Pyruvate and high-glucose supplemented tissue culture media.</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">96 well tissue culture plate</td>
			<td style="width:103px;">Falcon</td>
			<td align="right">3072</td>
			<td style="width:167px;">Plain, 96-well tissue culture plate for the parallel, compartmentalized mixing of transfection complexes.</td>
		</tr>
		<tr height="189">
			<td height="189" style="height:189px;width:216px;">Packard Viewplate</td>
			<td style="width:103px;">Perkin Elmer LAS</td>
			<td align="right">6005182</td>
			<td style="width:167px;">96 well TC plate with optical base on which cells are transfected, grown, fixed and eventually imaged. Supplied with opaque, adhesive plate seals, which are used during storage of used plates.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Breathable membrane</td>
			<td style="width:103px;">Alpha Labs</td>
			<td style="width:119px;">LW2783</td>
			<td style="width:167px;">Sterile, gas-permeable, adhesive membrane.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Neutral buffered formalin, 10%</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT5012-1CS</td>
			<td style="width:167px;">10% Formalin (4% formaldehyde) fixative used neat in protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100PC</td>
			<td>Non-ionic detergent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Tris</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td style="width:167px;">Trizma base (tris(hydroxymethyl)aminomethane)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween 20</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2287</td>
			<td style="width:167px;">For plate wash solution.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-P-S780 RB1 antibody</td>
			<td style="width:103px;">Abcam</td>
			<td>ab32513</td>
			<td>Rabbit monoclonal</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">AlexaFluor647 Anti-rabbit</td>
			<td style="width:103px;">Invitrogen</td>
			<td>A21245</td>
			<td style="width:167px;">Highly cross-adsorbed, fluorescently labelled secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hoechst 33342 (Bisbenzimide)</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td style="width:167px;">Fluorescent, chromatin-intercalating, DNA dye.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Permeabilization solution</td>
			<td style="width:103px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">0.1% Triton X-100 in 50 mM Tris-buffered saline, pH 8.0.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Plate wash solution</td>
			<td style="width:103px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">Tris-buffered saline containing 0.1 % Tween-20.</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Block solution</td>
			<td style="width:103px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">5% powdered milk in Tris-buffered saline and 0.1% Tween-20. For blocking plate prior to immuno-staining and dilution of antibodies.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell Profiler 2.1</td>
			<td style="width:103px;">Broad Institute</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.cellprofiler.org/download.shtml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Active Perl Community Edition</td>
			<td style="width:103px;">ActiveState</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.activestate.com/activeperl/downloads</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">R programming environment</td>
			<td style="width:103px;">The R Foundation</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.r-project.org</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rstudio</td>
			<td style="width:103px;">Rstudio</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.rstudio.com/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

workflow for high-content, individual cell quantification of fluorescent markers from universal microscope data, supported by open source software

Los avances en la comprensión de los mecanismos de control que rigen el comportamiento de las células en modelos de cultivo de tejidos de mamíferos adherentes son cada vez más dependiente de los modos de análisis de una sola célula. Métodos que entregan datos compuestos que reflejan los valores medios de los biomarcadores de las poblaciones de células se arriesgan a perder la dinámica de subpoblación que reflejan la heterogeneidad del sistema biológico estudiado. De acuerdo con esto, los enfoques tradicionales están siendo sustituidos por, o compatibles con formas más sofisticadas de ensayo celular desarrolladas para permitir la evaluación por microscopía de alto contenido. Estos ensayos potencialmente generan un gran número de imágenes de biomarcadores fluorescentes, lo que permitió al acompañar a los paquetes de software propietario, permite mediciones multi-paramétricas por célula. Sin embargo, los costos de capital relativamente altos y el exceso de especialización de muchos de estos dispositivos han impedido su acceso a muchos investigadores. Descrito aquí es unaflujo de trabajo de aplicación universal para la cuantificación de múltiples intensidades marcador fluorescente de regiones subcelulares específicos de células individuales adecuados para su uso con imágenes de la mayoría de los microscopios de fluorescencia. La clave de este flujo de trabajo es la implementación del software Profiler célula libre disposición 1 para distinguir las células individuales en estas imágenes, segmento que en regiones definidas subcelulares y entregar intensidad marcador fluorescente valores específicos a estas regiones. La extracción de valores de intensidad de células individuales a partir de los datos de imagen es el propósito central de este flujo de trabajo y se ilustrará con el análisis de los datos de control de una pantalla de siRNA para los reguladores de punto de control G1 en células humanas adherentes. Sin embargo, el flujo de trabajo que aquí se presenta se puede aplicar al análisis de datos procedentes de otros medios de perturbación celular (por ejemplo, pantallas de compuestos) y otras formas de fluorescencia basada en marcadores celulares y por lo tanto deben ser útiles para una amplia gama de laboratorios.

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Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Se presenta una informática flujo de trabajo flexible que permite un análisis basado en imágenes multiplexado de las células marcadas con fluorescencia. El flujo de trabajo cuantifica marcadores nucleares y citoplasmáticos y calcula translocación marcador entre estos compartimentos. Se proporcionan procedimientos para la perturbación de las células utilizando siRNA y metodología fiable para la detección de marcadores por inmunofluorescencia indirecta en formatos de 96 pocillos.

Flujo de trabajo para de alto contenido, cuantificación de la célula individual de marcadores fluorescentes de Universal Microscopio de datos, apoyados por software de fuente abierta

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

workflow-for-high-content-individual-cell-quantification-fluorescent

Research

JoVE Journal

Biology

12.9K vistas.  UCL Cancer Institute.  Se presenta una informática flujo de trabajo flexible que permite un análisis basado en imágenes multiplexado de las células marcadas con fluorescencia. El flujo de trabajo cuantifica marcadores nucleares y citoplasmáticos y calcula translocación marcador entre estos compartimentos. Se proporcionan procedimientos para la perturbación de las células utilizando siRNA y metodología fiable para la detección de marcadores por inmunofluorescencia indirecta en formato...

Video: Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

A neuronales y astrocitos Co-cultivo de ensayo para el análisis de alto contenido de neurotoxicidad

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Investigación

Biología

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Imágenes C. elegans Los embriones utilizando un microscopio de epifluorescencia y software de código abierto

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Signal transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain proliferation and differentiation and requires tight control. Signal transduction is initiated by binding of an external ligand to a transmembrane receptor and activation of downstream signaling cascades. A key regulator of mitogenic signaling is Grb2, a modular protein composed of an internal SH2 (Src Homology 2) domain flanked by two SH3 domains that lacks enzymatic activity. Grb2 is constitutively associated with the GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) via its N-terminal SH3 domain. The SH2 domain of Grb2 binds to growth factor receptors at phosphorylated tyrosine residues thus coupling receptor activation to the SOS-Ras-MAP kinase signaling cascade. In addition, other roles for Grb2 as a positive or negative regulator of signaling and receptor endocytosis have been described. The modular composition of Grb2 suggests that it can dock to a variety of receptors and transduce signals along a multitude of different pathways1-3.
	Described here is a simple microscopy assay that monitors recruitment of Grb2 to the plasma membrane. It is adapted from an assay that measures changes in sub-cellular localization of green-fluorescent protein (GFP)-tagged Grb2 in response to a stimulus4-6. Plasma membrane receptors that bind Grb2 such as activated Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) recruit GFP-Grb2 to the plasma membrane upon cDNA expression and subsequently relocate to endosomal compartments in the cell. In order to identify in vivo protein complexes of Grb2, this technique can be used to perform a genome-wide high-content screen based on changes in Grb2 sub-cellular localization. The preparation of cDNA expression clones, transfection and image acquisition are described in detail below. Compared to other genomic methods used to identify protein interaction partners, such as yeast-two-hybrid, this technique allows the visualization of protein complexes in mammalian cells at the sub-cellular site of interaction by a simple microscopy-based assay. Hence both qualitative features, such as patterns of localization can be assessed, as well as the quantitative strength of the interaction.

A high-content screening method for the identification of novel signaling competent transmembrane receptors is described. This method is amenable to large-scale automation and allows predictions about in vivo protein binding and the sub-cellular localization of protein complexes in mammalian cells.

Un alto contenido de imágenes de flujo de trabajo para estudiar Grb2 complejos de señalización por clonación de expresión

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Perfiles de Células Madre Embrionarias Humanas individual por RT-PCR cuantitativa

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

El seguimiento y cuantificación de los procesos de desarrollo en<em&gt; C. elegans</em&gt; Uso de las herramientas de código abierto

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

Open Source de análisis de contenidos de alta Utilizando microscopía de fluorescencia automatizado de imágenes por vida

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, excessive ROS levels induce a state of oxidative stress, which is accompanied by irreversible oxidative damage to DNA, lipids and proteins. Thus, quantification of ROS provides a direct proxy for cellular health condition. Since mitochondria are among the major cellular sources and targets of ROS, joint analysis of mitochondrial function and ROS production in the same cells is crucial for better understanding the interconnection in pathophysiological conditions. Therefore, a high-content microscopy-based strategy was developed for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, mitochondrial membrane potential (&#916;&#936;m) and mitochondrial morphology. It is based on automated widefield fluorescence microscopy and image analysis of living adherent cells, grown in multi-well plates, and stained with the cell-permeable fluorescent reporter molecules CM-H2DCFDA (ROS) and TMRM (&#916;&#936;m and mitochondrial morphology). In contrast with fluorimetry or flow-cytometry, this strategy allows quantification of subcellular parameters at the level of the individual cell with high spatiotemporal resolution, both before and after experimental stimulation. Importantly, the image-based nature of the method allows extracting morphological parameters in addition to signal intensities. The combined feature set is used for explorative and statistical multivariate data analysis to detect differences between subpopulations, cell types and/or treatments. Here, a detailed description of the assay is provided, along with an example experiment that proves its potential for unambiguous discrimination between cellular states after chemical perturbation.

This paper presents a high-content microscopy workflow for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, as well as mitochondrial membrane potential and morphology &#8211; jointly referred to as mitochondrial morphofunction &#8211; in living adherent cells using the cell-permeant fluorescent reporter molecules 5-(and-6)-chloromethyl-2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester (CM-H2DCFDA) and tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

Perfilado Redox Celular Utilizando Microscopía de Alto Contenido

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Análisis de una sola partícula de código abierto para el Super-resolución Microscopía con VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx is an application written in Shiny (an R package) that allows exploration of the expression of (as well as assigning functions to) transcripts whose expression is associated with insecticide resistance phenotypes in Anopheles gambiae mosquitoes. The application can be used online or downloaded and used locally by anyone. The local application can be modified to add new insecticide resistance datasets generated from multiple -omics platforms. This guide demonstrates how to add new datasets and handle missing data. Furthermore, IR-TEx can be completely and easily recoded to use-omics datasets from any experimental data, making it a valuable resource to many researchers. The protocol illustrates the utility of IR-TEx in identifying new insecticide resistance candidates using the the microsomal glutathione transferase, GSTMS1, as an example. This transcript is upregulated in multiple pyrethroid resistant populations from C&#244;te D&#39;Ivoire and Burkina Faso. The identification of co-correlated transcripts provides further insight into the putative roles of this gene.

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx explores insecticide resistance-related transcriptional profiles in the species Anopheles gambiae. Provided here are full instructions for using the application, modifications for exploring multiple transcriptomic datasets, and using the framework to build an interactive database for collections of transcriptomic data from any organism, generated in any platform.

IR-TEx: Una herramienta de integración de datos de código abierto para transcriptomica de Big Data diseñada para las anopheles gambiae de vectores de malaria

IR-TEx is an application written in Shiny (an R package) that allows exploration of the expression of (as well as assigning functions to) transcripts ...

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

An issue often encountered when acquiring image data from fixed or anesthetized C. elegans is that worms cross and cluster with their neighbors. This problem is aggravated with increasing density of worms and creates challenges for imaging and quantification. We developed a FIJI-based workflow, Worm-align, that can be used to generate single- or multi-channel montages of user-selected, straightened and aligned worms from raw image data of C. elegans. Worm-align is a simple and user-friendly workflow that does not require prior training of either the user or the analysis algorithm. Montages generated with Worm-align can aid the visual inspection of worms, their classification and representation. In addition, the output of Worm-align can be used for subsequent quantification of fluorescence intensity in single worms, either in FIJI directly, or in other image analysis software platforms. We demonstrate this by importing the Worm-align output into Worm_CP, a pipeline that uses the open-source CellProfiler software. CellProfiler&#8217;s flexibility enables the incorporation of additional modules for high-content screening.&#160;As a practical example, we have used the pipeline on two datasets: the first dataset are images of heat shock reporter worms that express green fluorescent protein (GFP) under the control of the promoter of a heat shock inducible gene hsp-70, and the second dataset are images obtained from fixed worms, stained for fat-stores with a fluorescent dye.

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

Worm-align/Worm_CP is a simple FIJI/CellProfiler workflow that can be used to straighten and align Caenorhabditis elegans samples and to score whole-worm image-based assays without the need for prior training steps. We have applied Worm-align/Worm_CP to the quantification of&#160;heat-shock induced expression in live animals or lipid droplets&#160;in fixed samples.

Alinee y Worm_CP, dos tuberías de código abierto para el enderezamiento y cuantificación de datos de imagen de fluorescencia obtenidos de Caenorhabditis elegans

An issue often encountered when acquiring image data from fixed or anesthetized C. elegans is that worms cross and cluster with their neighbors. This ...