Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni CRUK 15043 e 14251 CRUK. Ringraziamo Daniel Wetterskog e Ka Ho Kei per l&#39;assistenza tecnica e la lettura critica del manoscritto.

1. sperimentale Perturbazione e etichettatura delle cellule per la risposta Markers (Schermo Reverse Transfection siRNA) <ol><li> In una sterile cultura del tessuto cappa pipetta 70 ml di 200 Nm siRNA in 1x tampone siRNA in pozzetti di una pianura 96 ​​piastra sterile, bene. Diluire transfezione lipidi in 40 volumi di supporti privi di siero DMEM ed erogare 105 ml in ciascun pozzetto contenente siRNA. NOTA: La diluizione 262,5 ml di lipidi in 10,5 ml di DMEM senza siero produce un master mix adatto per un intero 96 pozzetti di siRNA, offrendo 2,6 ml di lipidi per pozzetto. L&#39;utilizzo di 200 Nm a partire siRNA concentrazione in questa fase fornirà una soluzione di lavoro di 20 Nm nella fase 1.3, ma le procedure di lavoro per le concentrazioni di lavorare fino a 5 Nm, con la concentrazione di partenza adeguato di conseguenza (cioè 50 Nm). Concentrazione di lavoro inferiore può ridurre punteggi positivi falsi fuori bersaglio, anche se possono ridurre l&#39;entità della risposta on-target, che porta ad aumentare di on-target percentuali di falsi negativi. </li><li> Mescolare la piastra dolce vibrazione per dieci minuti a temperatura ambiente. Suddividere i risultanti 175 ml in tre 50 microlitri repliche per bersaglio su un, colture di tessuti opachi trattati, piastra a 96 pozzetti con una base trasparente. </li><li> Transfect Reverse erogando 8.000 cellule per pozzetto in 150 microlitri DMEM contenente 10% di siero direttamente sui complessi lipidi-siRNA 50 microlitri. Cellule colorettali umani Usa HCT116 esprimono stabilmente un marcatore GFP-tagged segnalazione dell&#39;attività CDK2 5,8. Nessun ulteriore miscelazione è necessario. Sigillare la piastra con una sterile, colla membrana traspirante per controllare l&#39;umidità e prevenire &#39;edge-effetti&#39; piatto e posizionare la piastra in un incubatore umidificato a 37 ° C, 5% di CO 2 per 48 ore. </li><li> Aspirare il supporto in modo che una piccola quantità residua di supporto rimane nei pozzetti. Fissare le cellule aggiungendo 100 ml di formaldeide al 4% tamponata ad ogni pozzetto ed incubare in una cappa aspirante per 10 min a camera temperature. </li><li> Rimuovere la soluzione di fissaggio aspirando la piastra. A questo punto o interrompere l&#39;esperimento lavando piastra tre volte con 100 ml di soluzione salina tampone fosfato (PBS) e quindi memorizzare sigillato, sotto 100 ml di PBS al buio a 4 ° C per un massimo di una settimana, o procedere con il permeabilizzazione delle cellule. NOTA: Si consiglia di lastre di lavorazione il più presto possibile dopo la fissazione, e in generale preferiscono lo stoccaggio delle lastre completamente trasformati. Conservanti biocidi, quali il thimerosal, azoturo di sodio, o alternative commerciali possono essere aggiunti per prevenire la crescita micoroganismal. L&#39;aggiunta di inibitori di fosfatasi aiuta a preservare fosfo-epitopi, e altri mezzi per conservare gli stati di modificazione delle proteine ​​può essere utile in importanti contesti di analisi </li><li> Rimuovere PBS dalla piastra e permeabilize le cellule aggiungendo 100 ml di soluzione di permeabilizzazione. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente senza agitare. Aspirare la soluzione permeabilizzazione utilizzando un MulticanaleAnnel pipetta. Ripetere questa operazione tre volte. </li><li> Bloccare le cellule aggiungendo 100 microlitri soluzione blocco per pozzetto per 30 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione blocco aspirando la piastra, poi sondare con 50 ml di anticorpo anti RB1 P-S780 diluito 500 volte nella soluzione di blocco per 2 ore al buio a temperatura ambiente. </li><li> Lavare la piastra tre volte con 100 microlitri di soluzione di lavaggio piastra, lasciando la soluzione sulla piastra per 5 minuti ogni volta. Sonda la piastra una notte al buio a 4 ° C con 50 microlitri fluorescenza-tagged anticorpo secondario diluito 1.000 volte in soluzione blocco integrato con 2 mM del colorante DNA specifico-cromatina Bisbenzimide. Lavare la piastra tre volte prima e deposito chiuso, in 100 microlitri di PBS al buio a 4 ° C. Immagine la piastra entro due settimane. </li></ol> 2. Imaging e segmentazione di immagini <ol><li> Utilizzare un microscopio confocale o spinning-disk di fluorescenza con un obiettivo 20X per prendere parte 16-bit, immagini TIFF in scala di grigi a tre canali corrispondenti al colorante DNA, GFP e fluorofori immuno-colorazione. Cattura molti set di immagini non sovrapposte, di cui qui come cornici, per l&#39;immagine di circa 1.000-2.000 cellule per bene. </li><li> Nome i file di immagine in modo sistematico in modo che ogni nome di file è una combinazione unica di &#39;nome dell&#39;esperimento&#39;, &#39;beh indirizzo&#39;, &#39;numero di telaio&#39; e &#39;identificatore di canale&#39;, in questo ordine (Figura 3). Il set di dati di esempio utilizza &quot;Blue&quot; (cromatina colorazione DNA) o &quot;Green&quot; (GFP) o &quot;Red&quot; (il fluoroforo immuno-tinto) come identificatori di canale. L&#39;indirizzo ben, numero di fotogramma e il canale identificatore sono ulteriormente denominato metadati dell&#39;immagine. Utilizzare il simbolo di sottolineatura per evitare confusione bene e telaio metadati. </li><li> Nome i file con questi elementi di metadati nell&#39;ordine specificato. Ciò è necessario per garantire che i passi successivi software Correset di gruppo ctly di immagini per l&#39;analisi. </li><li> Scaricare e installare il Profiler cella freeware, attivo Perl Community Edition, R ambiente di programmazione statistica e rstudio. Accettare tutte le opzioni di default durante l&#39;installazione; Gli utenti PC che installano attivo Perl dovrebbero consentire a tutti possibilità per PATH, associazione di file di estensione e la mappatura script in cui viene richiesto. Attivo Perl è facoltativo per gli utenti Mac, ma saranno di necessità di eseguire lo script Perl in fase 3.2 dalla riga di comando del terminale piuttosto che utilizzare l&#39;icona clic. </li><li> Aprire il software Profiler cellulare, fare clic su &#39;File&#39;, &#39;Import Pipeline&#39; poi &#39;Da file&#39; e selezionare il file 3_channels_pipeline.cppipe (Figure S1A e S1B). Il file contiene le istruzioni necessarie per il software di interpretare l&#39;immagine metadati del file dalla convenzione nome del file descritto. Profiler cellulare riguarda ora le immagini, estrae il DNA nucleare e intensità di anticorpi da these e utilizza il canale GFP per calcolare il rapporto di intensità rispetto nucleare citoplasma per ogni cella rilevati (figure 4 e 5). </li><li> Fare clic sul &#39;impostazioni di uscita View&#39; pulsante nell&#39;angolo in basso a sinistra della finestra Profiler cella. Nella parte superiore del nuovo schermo sono caselle di testo etichettati &#39;cartella predefinita Input&#39; e &#39;cartella di destinazione predefinita&#39;. Uno alla volta, fare clic sulla cartella-icone a destra di queste caselle e selezionare il percorso dei file di immagine per l&#39;analisi e la destinazione dei dati estratti, rispettivamente (Figura S1C). </li><li> Iniziare l&#39;analisi delle immagini, premendo il pulsante &#39;analizzare le immagini &quot;nell&#39;angolo in basso a sinistra del Profiler Cell. Nella parte inferiore dello schermo osservare il tempo rimanente per l&#39;estrazione dei dati, &#39;Stop Analysis&#39; e pulsanti &quot;Pausa&quot;. Se necessario sospendere l&#39;analisi selezionando il tasto &#39;Pause&#39; in qualsiasi momento, il che è utilequando si guardano le immagini in fase di analisi (descritto al punto 2.8). </li><li> Facoltativamente, aprire le finestre per una qualsiasi delle fasi di analisi dell&#39;immagine facendo clic oculari icone nel pannello all&#39;estrema sinistra della finestra del programma (Figura S1D). Osservare la finestra &#39;IdentifyPrimaryObjects&#39; e quelli per &#39;secondari&#39; e &#39;Oggetti Terziario&#39; per verificare che le impostazioni attuali Profiler cellulare per effettuare la segmentazione di immagini adatte (vedi Figura 1 e discussione per consigli sulla modifica di queste impostazioni). </li><li> Fare clic su &#39;Ok&#39; nella finestra di messaggio che appare quando l&#39;analisi è completa. Vai alla posizione &#39;Default Output Folder&#39;, dove tutti i file di dati con i risultati vengono salvati come valori separati da virgole-(.csv) i file (Figura S2A). </li></ol> 3. Estrazione dei dati <ol><li> Trovare il nuovo file &#39;Nuclei.csv&#39;, che è inclusa tra iUscita dal Profiler cellulare. Questo file contiene i dati delle singole celle per fluorescenti intensità anticorpo nucleare, intensità DNA nucleare e valori del rapporto giornalista GFP-CDK2 (Figure 6A e S2A). NOTA: Numerosi laboratori vorranno elaborare questo tipo di dati in base alla natura dei loro saggi. Suggerito per i dati attuali è il gating delle cellule di ogni condizione di trattamento in base ai dati di anticorpi ei valori giornalista GFP-CDK2 utilizzando lo script Perl fornito &#39;2_gate_classifier.pl&#39;. </li><li> Copiare il file script Perl fornito &#39;2_gate_classifier.pl&#39; nella stessa cartella del file di dati del &#39;Nuclei.csv&#39; (Figura S2A). Fare doppio clic sull&#39;icona per lo script Perl e, quando richiesto, digitare il nome completo del file di dati seguito da un &#39;.csv&#39; nome nome del file in cui le cellule devono essere recintato e infine i valori di gate per l&#39;anticorpofluorescenza e dati giornalista GFP-CDK2. NOTA: Come determinare principalmente impostazioni del gate e applicare questi per l&#39;analisi dei dati sono discussi di seguito nella sezione Dati rappresentativi e figura 6 (per analizzare i dati forniti utilizzo &#39;0.004&#39; e &#39;1.5&#39;, rispettivamente). Gli utenti Mac devono eseguire lo script Perl dalla riga di comando del terminale digitando: &#39;perl 2_gate_classifier.pl&#39;. </li><li> Osservare il file appena creato, che unisce i valori grezzi singoli test cellule dai dati originali Profiler cellulare con etichette sub-popolazione che mostrano come ogni cellula da ogni pozzetto esegue contro entrambe le porte (Figura 6c). </li><li> Tracciare i dati per ogni condizione sperimentale utilizzando le singole etichette sottopopolazione di cellule aprendo il software rstudio. Fare clic su &#39;File&#39; e &#39;Apri File&#39;, quindi selezionare il file fornito &#39;analysis.r&#39;. Osservare i comandi per tracciare figure 6B, <strong&gt; 7 e 8 nella finestra superiore sinistra rstudio (Figura S2B). Nella finestra in alto a sinistra, tra i simboli doppi apici sulle linee 5 e 6, digitare l&#39;indirizzo del computer della cartella contenente i dati gated. Includere la lettera di unità e il nome del file stesso, rispettivamente, (ad esempio, &quot;C: / cartella di Analisi / output di analisi&quot; e &quot;nuclei_gated.csv&quot;). NOTA: Se rstudio viene utilizzato per la prima volta su un determinato computer, il pacchetto grafico R &#39;ggplot2&#39; dovrà essere installato prima. Questa è una volta solo passo per una nuova installazione di rstudio, dopo che questo passo diventa ridondante. Per installare &#39;ggplot2&#39;, fare clic sulla scheda denominata &quot;pacchetti&quot; sopra la finestra nell&#39;angolo in basso a destra della rstudio, fare clic sul pulsante &#39;Install Packages &quot;che appare sotto questo. Apparirà una nuova finestra. Tipo &#39;ggplot2&#39; (omettendo quotazioni) in &#39;pacchetti&#39; sritmo in questa nuova finestra e, infine, cliccare sul pulsante &#39;Install&#39; per chiudere la finestra, installare le funzioni ggplot2 necessarie e tornare alla finestra rstudio principale per continuare dal passaggio 3.6. </li><li> Evidenziare le linee da 1 a 17 nella finestra in alto a sinistra di rstudio, quindi fare clic sul pulsante &#39;Run&#39;. Ciò inserire i dati sperimentali, valori soglia e dettagli della posizione e in R (Figura S2C). R ora memorizzare temporaneamente i dati rilevanti per la stampa. </li><li> Evidenziare singoli blocchi di codice rimanente sotto la linea 17 e creare le trame corrispondenti facendo clic sul pulsante &#39;Run&#39; come prima. Osservare le trame nella finestra in basso a destra della rstudio e salvare il numero di formati facendo clic sul pulsante &#39;Export&#39; (Figura S2D). </li><li> Mentre la chiusura rstudio, fare clic su &#39;Non salvare&#39; quando richiesto. Questo impedisce la confusione sul prossimo utilizzo di rstudio, che altrimenti contenere datidalla sessione precedente. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare

Il flusso di lavoro descritto costituisce una procedura di perturbazione multipozzetto di cellule utilizzando siRNA, successiva rivelazione marcatore e infine uso di una serie di procedure del software supportato per facilitare l&#39;estrazione dei dati quantitativi risultanti dalle immagini al microscopio a fluorescenza. L&#39;approccio è focalizzato sulla consegna di valori di intensità nucleari e citoplasmatici per singole celle, che ha ampia applicazione pratica in molte applicazioni basati su celle. I dati di esempio utilizzati qui è stato generato in un ambiente schermo siRNA in cui due saggi fluorescenti per il transito ciclo cellulare fase G1 sono testati e correlati tornare a una misura più diretta biofisica del contenuto di DNA nucleare. L&#39;uso di un colorante fluorescente per DNA immagine DNA nucleare è un passo indispensabile nel processo di segmentazione dell&#39;immagine in quanto consente l&#39;identificazione delle singole cellule e la conseguente &#39;maschera Nuclei&#39; serve come punto di partenza per identificare corrispondente cytoplasmiregioni c. Il CDK2 giornalista GFP-tag, che è stabilmente espressa nelle cellule, dà una variabile ancora costantemente superiore segnale di fondo nel citoplasma con cui questo vano può essere delineata. La stessa analisi condotta dovrebbe essere applicabile all&#39;analisi degli eventi proteine ​​traslocazione con altri reporter fluorescenza legati adatti e la loro risposta alla perturbazione. Inoltre, sostituendo il reporter GFP-CDK2 con coloranti fluorescenti specifici citoplasma consentirebbe l&#39;uso alternativo di questo algoritmo per misurare le dimensioni del citoplasma e le dimensioni relative delle cellule nelle immagini. Un&#39;altra considerazione di progetto nella strategia di segmentazione dell&#39;immagine qui descritto è l&#39;uso di Profiler cellulare per fornire valori di intensità integrati per la quantificazione del DNA. Integrazione dell&#39;intensità valori per il DNA nucleare dati colorazione permettono di possibili variazioni nelle dimensioni nucleo, e rappresenta un fiammifero vicino per i profili di quantificazione vistoper propidio ioduro macchiato FACS dati. Tuttavia, l&#39;intensità integrata non può fornire uno strumento adeguato per valutare la funzione della proteina dove la concentrazione media, esemplificato da intensità media di antigene di fluorescenza, è biologicamente più rilevante rispetto alla quantità totale integrata di proteine ​​(e fluorescenza associata) all&#39;interno di un compartimento cellulare. Quindi significa valori di intensità sono stati utilizzati per la P-S780 RB1 e dati GFP. L&#39;opzione per alterare tra le due modalità (media o integrato) di valutazione dei dati si trova sul pannello &#39;ExportToSpreadsheet&#39; del software Profiler cella. Le impostazioni di analisi nel file 3_channels_pipeline.cppipe sono ottimizzati per le immagini del set di dati di esempio. Analisi di nuove immagini set con questo protocollo sarà necessario che i nomi dei file adottano la convenzione di denominazione sopra descritto (Figura 3). Inoltre, la sensibilità valori in base alla luminosità della colorazione del DNA nucleare e le soglie per lo sfondointensità dei nuovi set di immagini potrebbe essere necessario regolare all&#39;interno delle impostazioni Profiler cellulare. Dato il ruolo chiave della colorazione DNA contiene per costruire le varie maschere di segmentazione dell&#39;immagine, l&#39;applicazione di impostazioni di sensibilità corrette per questo canale è essenziale all&#39;analisi successo di nuovi dati di immagine con il software Profiler cellulare. Il file di impostazioni Profiler cellulare fornito (3_channels_pipeline.cppipe) contiene note su dei parametri più utili per adattare l&#39;analisi di nuovi dati. Queste note sono nella casella di testo nella parte superiore dello schermo nella finestra principale Profiler cellulare e includono una guida su come modificare le impostazioni di sensibilità e regolazione del numero di canali da analizzare. Come incriminato nella sezione protocollo 2.8, per testare le impostazioni per i nuovi dati di immagine può essere necessario per osservare la segmentazione delle immagini durante l&#39;analisi delle immagini cliccando aprire le icone &#39;occhio&#39; per ciascuno dei &#39;Identificare ... Objects fasi di protocollo (Figura S1D </strong&gt;). In particolare, la visualizzazione dei dati di immagine attraverso &#39;IdentifyPrimaryOjects&#39; mostrerà se la maschera Nuclei è identificato correttamente dalle immagini della colorazione DNA. Nella pagina software Profiler cellulare per il modulo &quot;IdentifyPrimaryOjects &#39;è il fattore di correzione soglia. Tentativi ed errori regolazione di questo valore sarà risolvere la maggior parte degli errori di riconoscimento nucleari. I valori di equilibrio del canale DNA contro l&#39;intensità di sfondo per ogni immagine. Valori del fattore di correzione Soglia cerniera circa 1, dove più grande di questo è più spinto (buono per le immagini chiare) e meno di 1 è indulgente (adatti per le immagini con meno contrasto tra la colorazione e lo sfondo). L&#39;uscita dei dati grezzi singola cella da Profiler cellulare può essere analizzata in vari modi per soddisfare le esigenze di altri studi. Qui è illustrato l&#39;uso di uno script Perl per applicare porte a due dei parametri misurati per cella al fine di assistere l&#39;estrazione tendenze biologiche dalla un datod permesso incrociato delle sottopopolazioni individuate con ulteriori misurazioni. Anche se è ugualmente possibile includere elementi di gating nell&#39;ambito della Profiler Cell, il percorso alternativo usato qui fornisce una maggiore flessibilità e velocità, in particolare se grandi insiemi di dati devono essere valutate. La fase più lenta nelle fasi di acquisizione post-immagine del protocollo attuale è la gestione del software Profiler cella. Profiler cellulare qui viene eseguito senza imporre porte per produrre un insieme di dati grezzi non-gated che può essere rianalizzato con conseguente script Perl più rapidamente e, se necessario, iterativamente con diversi valori di gate. Non tutti gli studi conoscere in anticipo i valori di gate adatti come questo può variare con reagenti in un dato insieme di dati, e potenzialmente nel tempo. E &#39;, quindi, consigliabile per generare istogrammi raffiguranti la distribuzione dei dati grezzi ottenuti da Profiler cellulare per i controlli positivi e le cellule mock-perturbate al fine di individuare idonei valu cancelloes per i parametri di interesse. Sono scritti Gli script Perl ad accettare una struttura della colonna rigidamente definito di dati da Profiler cellulare e può smettere di funzionare se un utente modifica il numero di uscita parametri Profiler cellulare utilizzando le impostazioni della &#39;ExportToSpreadsheet&#39;. Per contribuire ad attuare la modifica delle impostazioni note sono inclusi all&#39;interno dei file di script Perl. Per vedere questi visualizzare lo script in un editor di testo, preferibilmente editor di testo per programmatori impostata codice colore elementi Perl (ad esempio, http://www.activestate.com/komodo-edit). Queste note indicano dove per regolare lo script di adattarsi ai cambiamenti nel formato dei dati. Simile agli script Perl, il file R-codice fornito (analysis.r), che contiene le istruzioni per tracciare i dati dai dati di analisi di immagine, può essere letto in un editor di testo o software rstudio vedere note aggiuntive sull&#39;uso e l&#39;adattamento. Queste note possono essere completato con i dettagli sulle espressioni regolari e Perl &lt;sup&gt; 12 e il pacchetto ggplot2 13 per R, entrambi i quali formano la base per come i dati vengono letti, annotato e tracciati rispettivamente. Nuovi studi usando la microscopia a fluorescenza, nonché dati grezzi depositati con le pubblicazioni open source sono suscettibili di metodi di analisi, come quelle qui descritte. La natura stessa dei dati ad alta contenuto si presta ad analisi ricorsiva con accentuazioni diverse analitiche a seconda degli interessi di ricerca di ogni osservatore. Anche se le domande che possono essere poste dei dati sono limitati dalle sonde utilizzate originariamente, i dati delle immagini possono essere spesso significato rianalizzati oltre l&#39;ambito degli studi che le hanno generate.

Il lavoro qui presentato descrive l&#39;uso del software Profiler cella liberamente disponibili per eseguire ripartizione algoritmo guidata di immagini di microscopia a fluorescenza di cellule aderenti per identificare le singole cellule e regioni subcellulari definite. Questo approccio, denominato segmentazione di immagini, consente la successiva analisi multi-parametrica delle cellule immaginati quantificando marcatori fluorescente localizzate ad ogni cella o regione subcellulare (denominato oggetti segmentate). Questo flusso di lavoro costituisce la base per consentire l&#39;analisi ad alta contenuto e lo scopo di servire come uno strumento che può essere ulteriormente sviluppato e modificato per soddisfare multi-parametrica, analisi singola cellula in laboratorio senza accesso agli strumenti ad alto contenuto specializzati o software proprietario. I file forniti con questo manoscritto includono una serie di test di importanti dati di immagine grezzi, le impostazioni di algoritmo e script di supporto per generare l&#39;analisi descritto. La condizione impostazioni algoritmo fo Profiler cellulare sono ottimizzati per i set di dati di esempio ei dettagli sezione Discussioni quanto possono essere necessari aggiustamenti per consentire l&#39;uso dei dati di immagine provenienti da altri studi. Una volta dati quantitativi è stato estratto utilizzando Profiler cellulare, laboratori diversi possono avere esigenze diverse per come utilizzare le informazioni presentate dai valori delle celle individuali nei dati grezzi; mostrato qui è un approccio con cui porte vengono applicati ai dati grezzi per ogni test. Usando questi cancelli, i dati sono trasformati in termini binarie di risposta, consentendo la visualizzazione delle tendenze collegano diversi trattamenti con le sottopopolazioni di cellule in risposta definito dalle porte. Le porte sono impostati sulla base di osservazioni delle distribuzioni di dati ottenuti appropriati controlli negativi e positivi per ogni misura rilevante. L&#39;uso dei cancelli è solo un esempio di come gestire le misure, basati su celle prime. Anche qui mostrato è l&#39;uso di intensità DNA nucleare measurements nella loro forma grezza come un intervallo continuo di valori in combinazione con i dati gated. Altri approcci per la gestione dei dati di analisi di immagine devono essere considerati, a seconda della natura dello studio; alternative statistici all&#39;utilizzo cancelli per l&#39;assegnazione di celle a sottopopolazioni sono stati segnalati 2 e sistematiche confronto tra le strategie per riassumere i dati ad alta contenuto attraverso un gran numero di parametri sono stati segnalati 3. Analisi-alto contenuto di dati immagine hanno trovato impiego in studi cellulari di droga-risposta, invertire la genetica e stress ambientale segnalazione 4-6. Il merito di analisi ad alto contenuto di deriva dal fatto che l&#39;analisi algoritmica dei dati microscopia a fluorescenza permette parametri quantitativi e spaziali da considerare simultaneamente in singole celle 7. In questo modo, esiti cellulari per analisi multiple possono essere, comportamento differenziale incrociato dei test-dsottopopolazioni cellulari efined possono essere monitorati all&#39;interno di condizioni sperimentali e test possono includere la considerazione di variabili morfologiche. Il flusso di lavoro strategie e analisi discusso qui, come per altri approcci ad alto contenuto, sono in grado di fornire dati multiplex che sono riferimenti incrociati alle singole celle. Studi ad alto contenuto di metodi tuta che generano immagini al microscopio a fluorescenza e sono applicabili all&#39;analisi dei dati che vanno da decine di immagini prodotte in basso erogato microscopia convenzionale basato sulla fluorescenza attraverso le migliaia di immagini prodotte utilizzando piattaforme ad alto contenuto di screening automatizzati. Il flusso di lavoro è illustrata qui con i dati di esempio da cui test separati sono misurate in termini di intensità sia marcatori fluorescenti nucleari o traslocazione citoplasmatica / nucleare di una proteina reporter fluorescente, rispettivamente. Il flusso di lavoro è flessibile in quanto questi saggi possono essere considerati separatamente o in combinazione seconda each dato domanda di ricerca da diversi ricercatori. I dati di esempio sono prodotti come parte di una interferenza dell&#39;RNA (RNAi) esperimento (Figura 1). Piccoli oligonucleotidi RNA interferenti (siRNA) vengono utilizzati per atterramento specifiche proteine ​​in cellule di carcinoma colorettale umano HCT116 che danno luogo a cambiamenti per due reporter fluorescenti di chinasi (CDK) attività di ciclina-dipendente. La fosforilazione CDK6-dipendente della proteina retinoblastoma nucleare di serina 780 (P-S780 RB1) è valutata con anticorpi colorazione. Nelle stesse cellule, una proteina fluorescente-tag giornalista verde di attività CDK2 (GFP-CDK2 giornalista) è valutata dal nucleare rapporto citoplasmatica dove in assenza di attività CDK2 reporter risiede nel nucleo e su navette attivazione CDK2 nel citoplasma 8. Inoltre, il DNA nucleare di ciascuna cella viene tinto con un colorante-DNA intercalanti, Bisbenzimide, che serve come mezzo per identificare le cellule e definire i confini nuclei nelle immagini così unmisura sa dell&#39;abbondanza DNA fornire informazioni sulla posizione del ciclo di cella della cella (Figura 2). Le attività di CDK2 e CDK6 sono rilevabili come cellule transito da G1 alla fase S del ciclo cellulare 5 e succedono 9,10 e, come tale, stretta concordanza tra i due reporter in cellule singole è previsto. L&#39;insieme di dati di dimostrazione qui utilizzato analizza come esempio l&#39;effetto di siRNA obiettivi CDK6, proteina retinoblastoma (RB1) e un controllo negativo non-targeting (Tabella 1). Knockdown di CDK6 deve provocare sia una diminuzione della RB1 epitopo P-S780 e un accumulo di cellule in fase G1 del ciclo cellulare. Il knockdown RB1 serve da controllo reattivo per la specificità dell&#39;anticorpo fosfo-S780. Immagini al microscopio a fluorescenza da formalina fisso 11, colture cellulari HCT116 fluorescenti colorate vengono utilizzati per l&#39;analisi delle immagini algoritmica. I dati numerici risultante viene quindi utilizzato perriferimento incrociato i giornalisti e misurare l&#39;impatto dei diversi stati atterramento. La dimensione potenziale dei dati prodotti da questo tipo di analisi può presentare una sfida per normali strumenti di analisi. Ad esempio, i dati delle celle individuali possono essere più grandi di alcuni software foglio ospiterà. Incluso sono script Perl che eseguono semplici, altamente ripetitivo, lavorazione sotto la supervisione dei dati per aiutare l&#39;analisi di grandi set di dati. Gli script Perl sono scritti appositamente per i file di output prodotti da cellule Profiler, durante l&#39;elaborazione di file di immagini con una specifica convenzione di denominazione dei file (Figura 3), e consentono un numero variabile di campi per bene da utilizzare nell&#39;analisi. Spesso è importante dati del saggio cancello singola cella per monitorare tendenze sottopopolazioni di cellule 5 e qui illustrato è l&#39;uso di uno script Perl per contrassegnare ogni cella basata su un cancello insieme predeterminato per ogni tipo di saggio. Sono inclusi anche gli script opzionali Perlche riassumono l&#39;esito dei dati per i singoli pozzi (o condizioni), offrendo: percentuale di cellule all&#39;interno del cancello set ed i valori medi dei punteggi del test grezzi. Quest&#39;ultimo modo più omogenea visualizzazione dati, vale dove risposte influenzano tutti o la maggior parte delle cellule all&#39;interno di un pozzo. Come discusso sopra, tale valutazione è meno utile di quello previsto dalla persona gating dati cella in cui la risposta si limita a un sottogruppo di cellule all&#39;interno di una popolazione. L&#39;utilità del flusso di lavoro descritto non è limitato alle perturbazioni da siRNA o saggi marcatori descritti. Gli studi hanno utilizzato questo approccio per saggiare le risposte in tessuto esperimenti di coltura utilizzando combinazioni di siRNA, inibitori chimici e trattamento con radiazioni e per la valutazione dei marcatori diversi CDK6 e l&#39;attività CDK2 5. Concettualmente, la strategia sperimentale permette una varietà di regioni subcellulari biologicamente utili da registrare automaticamentein singole cellule presenti nelle immagini al microscopio a fluorescenza. Come tale, questo approccio può produrre, dati multiplex rivelare informazioni biologiche quantitative che possono perdere attraverso tecniche che si concentrano sulle popolazioni piuttosto che singole celle. Con piccole modifiche, il flusso di lavoro di avvicinamento e di analisi descritto può produrre, i dati delle singole celle quantitativi per le uscite di analisi basate sulla fluorescenza e le risposte delle cellule-biologica, in cui la valutazione quantitativa del contenuto di DNA, la quantificazione della fluorescenza nucleare o citoplasmatica o la spola di marcatori tra queste due scomparti singolarmente o in modo multiplex è di interesse. Come requisiti editrici tendono sempre più verso la presentazione dei dati grezzi apertamente accessibili, l&#39;accesso e la familiarità con strumenti gratuiti per l&#39;analisi di immagini di microscopia, come quelle descritte qui sarà anche di diretto interesse per i laboratori in cerca di rianalizzare i dati pubblicati.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="604">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:103px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AllStars negative control siRNA</td>
			<td style="width:103px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1027280</td>
			<td style="width:167px;">Negative control siRNA.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">CDK6 siRNA</td>
			<td style="width:103px;">Dharmacon/ Custom synthesis</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">Antisense sequence: 5&#39; CUCUAGGCCAGUCUUCUUCUU</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">RB1 siRNA</td>
			<td style="width:103px;">Dharmacon/ Custom synthesis</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">Antisense sequence: 5&#39; GGUUCAACUACGCGUGUAATT</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">5x siRNA buffer</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Scientific</td>
			<td>B-002000-UB-100</td>
			<td style="width:167px;">To be diluted with nuclease-free, non-DEPC treated water.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nulcease-free water (non-DEPC)</td>
			<td style="width:103px;">Applied Biosystems</td>
			<td>AM9937</td>
			<td style="width:167px;">For dilution of siRNA buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hiperfect</td>
			<td style="width:103px;">Qiagen</td>
			<td align="right">301705</td>
			<td style="width:167px;">Transfection lipid.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:103px;">Life Technologies</td>
			<td align="right">41966052</td>
			<td style="width:167px;">Pyruvate and high-glucose supplemented tissue culture media.</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">96 well tissue culture plate</td>
			<td style="width:103px;">Falcon</td>
			<td align="right">3072</td>
			<td style="width:167px;">Plain, 96-well tissue culture plate for the parallel, compartmentalized mixing of transfection complexes.</td>
		</tr>
		<tr height="189">
			<td height="189" style="height:189px;width:216px;">Packard Viewplate</td>
			<td style="width:103px;">Perkin Elmer LAS</td>
			<td align="right">6005182</td>
			<td style="width:167px;">96 well TC plate with optical base on which cells are transfected, grown, fixed and eventually imaged. Supplied with opaque, adhesive plate seals, which are used during storage of used plates.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Breathable membrane</td>
			<td style="width:103px;">Alpha Labs</td>
			<td style="width:119px;">LW2783</td>
			<td style="width:167px;">Sterile, gas-permeable, adhesive membrane.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Neutral buffered formalin, 10%</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT5012-1CS</td>
			<td style="width:167px;">10% Formalin (4% formaldehyde) fixative used neat in protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100PC</td>
			<td>Non-ionic detergent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Tris</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td style="width:167px;">Trizma base (tris(hydroxymethyl)aminomethane)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween 20</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2287</td>
			<td style="width:167px;">For plate wash solution.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-P-S780 RB1 antibody</td>
			<td style="width:103px;">Abcam</td>
			<td>ab32513</td>
			<td>Rabbit monoclonal</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">AlexaFluor647 Anti-rabbit</td>
			<td style="width:103px;">Invitrogen</td>
			<td>A21245</td>
			<td style="width:167px;">Highly cross-adsorbed, fluorescently labelled secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hoechst 33342 (Bisbenzimide)</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td style="width:167px;">Fluorescent, chromatin-intercalating, DNA dye.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Permeabilization solution</td>
			<td style="width:103px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">0.1% Triton X-100 in 50 mM Tris-buffered saline, pH 8.0.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Plate wash solution</td>
			<td style="width:103px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">Tris-buffered saline containing 0.1 % Tween-20.</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Block solution</td>
			<td style="width:103px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">5% powdered milk in Tris-buffered saline and 0.1% Tween-20. For blocking plate prior to immuno-staining and dilution of antibodies.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell Profiler 2.1</td>
			<td style="width:103px;">Broad Institute</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.cellprofiler.org/download.shtml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Active Perl Community Edition</td>
			<td style="width:103px;">ActiveState</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.activestate.com/activeperl/downloads</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">R programming environment</td>
			<td style="width:103px;">The R Foundation</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.r-project.org</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rstudio</td>
			<td style="width:103px;">Rstudio</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.rstudio.com/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

workflow for high-content, individual cell quantification of fluorescent markers from universal microscope data, supported by open source software

I progressi nella comprensione dei meccanismi di controllo che disciplinano il comportamento delle cellule in coltura di tessuti aderenti modelli mammiferi stanno diventando sempre più dipendenti dalle modalità di analisi singola cellula. Metodi che forniscono i dati compositi che riflettono i valori medi dei biomarcatori di popolazioni cellulari rischiano di perdere dinamiche sottopopolazione che riflettono l&#39;eterogeneità del sistema biologico studiato. In linea con questo, gli approcci tradizionali vengono sostituiti da, o supportati con forme più sofisticate di test cellulari sviluppati per consentire la valutazione al microscopio ad alto contenuto. Questi test potenzialmente generare un gran numero di immagini di biomarcatori fluorescenti, che hanno permesso accompagnando pacchetti di software proprietario, consente per le misure multi-parametriche per cella. Tuttavia, i costi relativamente elevati di capitale e superspecializzazione di molti di questi dispositivi hanno impedito la loro accessibilità a molti ricercatori. Descritto qui è unworkflow universalmente applicabili per la quantificazione di più intensità marcatori fluorescenti da specifiche regioni subcellulare di cellule singole adatti per l&#39;uso con le immagini dalla maggior parte microscopi a fluorescenza. La chiave di questo flusso di lavoro è l&#39;implementazione del software Profiler cellulare liberamente disponibile da 1 a distinguere le cellule individuali in queste immagini, li segmento in regioni subcellulari definite e fornire intensità marcatore di fluorescenza valori specifici di queste regioni. L&#39;estrazione dei singoli valori di intensità di cellule dai dati immagine è lo scopo centrale di questo flusso di lavoro e verrà illustrato con l&#39;analisi dei dati di controllo da una schermata di siRNA per G1 regolatori checkpoint in cellule umane aderenti. Tuttavia, il flusso di lavoro qui presentata può essere applicato all&#39;analisi dei dati da altri mezzi perturbatori cellulare (per esempio, schermi composti) e altre forme di marcatori cellulari fluorescenza base e quindi dovrebbe essere utile per una vasta gamma di laboratori.

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Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Presentato è un flusso di lavoro flessibile, l&#39;informatica che consente l&#39;analisi di immagini basata multiplex di cellule fluorescente. Il flusso di lavoro quantifica marcatori nucleari e citoplasmatici e calcola marcatore traslocazione tra questi compartimenti. Le procedure sono previste per la perturbazione di cellule utilizzando siRNA e metodologia affidabile per il rilevamento marcatore mediante immunofluorescenza indiretta in formati da 96 pozzetti.

Flusso di lavoro per High-contenuti, Quantificazione singola cella di fluorescenti Marcatori da Universal Microscopio dati, supportati da Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

workflow-for-high-content-individual-cell-quantification-fluorescent

Research

JoVE Journal

Biology

12.9K Views.  UCL Cancer Institute.  Presentato è un flusso di lavoro flessibile, l'informatica che consente l'analisi di immagini basata multiplex di cellule fluorescente. Il flusso di lavoro quantifica marcatori nucleari e citoplasmatici e calcola marcatore traslocazione tra questi compartimenti. Le procedure sono previste per la perturbazione di cellule utilizzando siRNA e metodologia affidabile per il rilevamento marcatore mediante immunofluorescenza indiretta in formati da 96 pozzetti. 

Video: Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Un neuronale e astrociti Co-Cultura Assay per l&#39;analisi dei contenuti elevati di neurotossicità

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Ricerca

Biologia

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Imaging C. elegans Gli embrioni utilizzando un microscopio epifluorescente e Software Open Source

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. QFA can be applied to focused observations of single cultures but is most useful for genome-wide genetic interaction or drug screens investigating up to thousands of independent cultures. The central experimental method is the inoculation of independent, dilute liquid microbial cultures onto solid agar plates which are incubated and regularly photographed. Photographs from each time-point are analyzed, producing quantitative cell density estimates, which are used to construct growth curves, allowing quantitative fitness measures to be derived. Culture fitnesses can be compared to quantify and rank genetic interaction strengths or drug sensitivities. The effect on culture fitness of any treatments added into substrate agar (e.g. small molecules, antibiotics or nutrients) or applied to plates externally (e.g. UV irradiation, temperature) can be quantified by QFA.
The QFA workflow produces growth rate estimates analogous to those obtained by spectrophotometric measurement of parallel liquid cultures in 96-well or 200-well plate readers. Importantly, QFA has significantly higher throughput compared with such methods. QFA cultures grow on a solid agar surface and are therefore well aerated during growth without the need for stirring or shaking.
QFA throughput is not as high as that of some Synthetic Genetic Array (SGA) screening methods5,6. However, since QFA cultures are heavily diluted before being inoculated onto agar, QFA can capture more complete growth curves, including exponential and saturation phases3. For example, growth curve observations allow culture doubling times to be estimated directly with high precision, as discussed previously1.
Here we present a specific QFA protocol applied to thousands of S. cerevisiae cultures which are automatically handled by robots during inoculation, incubation and imaging. Any of these automated steps can be replaced by an equivalent, manual procedure, with an associated reduction in throughput, and we also present a lower throughput manual protocol. The same QFA software tools can be applied to images captured in either workflow.
We have extensive experience applying QFA to cultures of the budding yeast S. cerevisiae but we expect that QFA will prove equally useful for examining cultures of the fission yeast S. pombe and bacterial cultures.

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is a complementary series of experimental and computational methods for estimating microbial culture fitnesses. QFA estimates the effect of genetic mutations, drugs or other applied treatments on microbe growth. Experiments scaling from focussed analysis of single cultures to thousands of parallel cultures can be designed.

A Quantitative Analysis Fitness Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Signal transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain proliferation and differentiation and requires tight control. Signal transduction is initiated by binding of an external ligand to a transmembrane receptor and activation of downstream signaling cascades. A key regulator of mitogenic signaling is Grb2, a modular protein composed of an internal SH2 (Src Homology 2) domain flanked by two SH3 domains that lacks enzymatic activity. Grb2 is constitutively associated with the GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) via its N-terminal SH3 domain. The SH2 domain of Grb2 binds to growth factor receptors at phosphorylated tyrosine residues thus coupling receptor activation to the SOS-Ras-MAP kinase signaling cascade. In addition, other roles for Grb2 as a positive or negative regulator of signaling and receptor endocytosis have been described. The modular composition of Grb2 suggests that it can dock to a variety of receptors and transduce signals along a multitude of different pathways1-3.
	Described here is a simple microscopy assay that monitors recruitment of Grb2 to the plasma membrane. It is adapted from an assay that measures changes in sub-cellular localization of green-fluorescent protein (GFP)-tagged Grb2 in response to a stimulus4-6. Plasma membrane receptors that bind Grb2 such as activated Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) recruit GFP-Grb2 to the plasma membrane upon cDNA expression and subsequently relocate to endosomal compartments in the cell. In order to identify in vivo protein complexes of Grb2, this technique can be used to perform a genome-wide high-content screen based on changes in Grb2 sub-cellular localization. The preparation of cDNA expression clones, transfection and image acquisition are described in detail below. Compared to other genomic methods used to identify protein interaction partners, such as yeast-two-hybrid, this technique allows the visualization of protein complexes in mammalian cells at the sub-cellular site of interaction by a simple microscopy-based assay. Hence both qualitative features, such as patterns of localization can be assessed, as well as the quantitative strength of the interaction.

A high-content screening method for the identification of novel signaling competent transmembrane receptors is described. This method is amenable to large-scale automation and allows predictions about in vivo protein binding and the sub-cellular localization of protein complexes in mammalian cells.

Un alto contenuto di flusso di lavoro di imaging per studiare GRB2 Centri di segnalazione di espressione clonazione

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Profiling cellule staminali embrionali umane individuale mediante RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

Monitoraggio e quantificazione processi di sviluppo in<em&gt; C. elegans</em&gt; Utilizzo strumenti open-source

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

Open Source alto contenuto di analisi Utilizzando Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, excessive ROS levels induce a state of oxidative stress, which is accompanied by irreversible oxidative damage to DNA, lipids and proteins. Thus, quantification of ROS provides a direct proxy for cellular health condition. Since mitochondria are among the major cellular sources and targets of ROS, joint analysis of mitochondrial function and ROS production in the same cells is crucial for better understanding the interconnection in pathophysiological conditions. Therefore, a high-content microscopy-based strategy was developed for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, mitochondrial membrane potential (&#916;&#936;m) and mitochondrial morphology. It is based on automated widefield fluorescence microscopy and image analysis of living adherent cells, grown in multi-well plates, and stained with the cell-permeable fluorescent reporter molecules CM-H2DCFDA (ROS) and TMRM (&#916;&#936;m and mitochondrial morphology). In contrast with fluorimetry or flow-cytometry, this strategy allows quantification of subcellular parameters at the level of the individual cell with high spatiotemporal resolution, both before and after experimental stimulation. Importantly, the image-based nature of the method allows extracting morphological parameters in addition to signal intensities. The combined feature set is used for explorative and statistical multivariate data analysis to detect differences between subpopulations, cell types and/or treatments. Here, a detailed description of the assay is provided, along with an example experiment that proves its potential for unambiguous discrimination between cellular states after chemical perturbation.

This paper presents a high-content microscopy workflow for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, as well as mitochondrial membrane potential and morphology &#8211; jointly referred to as mitochondrial morphofunction &#8211; in living adherent cells using the cell-permeant fluorescent reporter molecules 5-(and-6)-chloromethyl-2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester (CM-H2DCFDA) and tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

Profilatura cellulare Redox usando la microscopia ad alto contenuto

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Analisi singola particella open-source per Super-risoluzione Microscopia con VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx is an application written in Shiny (an R package) that allows exploration of the expression of (as well as assigning functions to) transcripts whose expression is associated with insecticide resistance phenotypes in Anopheles gambiae mosquitoes. The application can be used online or downloaded and used locally by anyone. The local application can be modified to add new insecticide resistance datasets generated from multiple -omics platforms. This guide demonstrates how to add new datasets and handle missing data. Furthermore, IR-TEx can be completely and easily recoded to use-omics datasets from any experimental data, making it a valuable resource to many researchers. The protocol illustrates the utility of IR-TEx in identifying new insecticide resistance candidates using the the microsomal glutathione transferase, GSTMS1, as an example. This transcript is upregulated in multiple pyrethroid resistant populations from C&#244;te D&#39;Ivoire and Burkina Faso. The identification of co-correlated transcripts provides further insight into the putative roles of this gene.

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx explores insecticide resistance-related transcriptional profiles in the species Anopheles gambiae. Provided here are full instructions for using the application, modifications for exploring multiple transcriptomic datasets, and using the framework to build an interactive database for collections of transcriptomic data from any organism, generated in any platform.

IR-TEx: uno strumento open source per l'integrazione dei dati per la trascrittomica dei Big Data progettato per il raggio del malaria Anopheles gambiae

IR-TEx is an application written in Shiny (an R package) that allows exploration of the expression of (as well as assigning functions to) transcripts ...