Este proyecto fue financiado por el Estado federado de Baden-Württemberg, así como por la Unión Europea, Europäischer Fonds für die Regionale Entwicklung. Los autores agradecen a Rainer Wittig (ILM Ulm) para proporcionar la línea celular U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 y Claudia Hintze para la asistencia técnica en un crack.

1. célula que crece esferoide e Incubación <ol><li> Experimento 1: esferoides de células incubadas con un fármaco quimioterapéutico <ol><li> Preparar agarosa al 1,5% en medio de cultivo mediante la adición de 0,45 g de agarosa a 30 ml de medio de cultivo (suficiente para 6 platos). </li><li> Calentar la mezcla de la etapa 1.1.1 a al menos 80 ° C mientras se agita de vez en cuando. </li><li> Llenar 50 l de la mezcla calentada desde el paso 1.1.2 en cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se deja solidificar dentro de 1-2 horas. Guarde las placas cerradas y cubiertas en el refrigerador a 5 º C hasta su uso. </li><li> Semilla sobre 150 células MCF-7 de cáncer de mama en cada pocillo de la placa preparada 96 pocillos en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con medio F-12 de cultivo de Ham suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS) y 1% de penicilina / estreptomicina . </li><li> Grow esferoides durante 5-7 días hasta un diámetro de aproximadamente 200-300 micras en un incubador a 5% de CO2 y 3776; C. </li><li> Incubar los esferoides celulares con el clorhidrato de doxorrubicina antibiótico de antraciclina durante 6 horas a una concentración que oscila entre 2 M y 8 M (en medio de cultivo) en una incubadora a 5% de CO2 y 37 ° C. </li><li> Lave los esferoides celulares con medio de cultivo o solución salina equilibrada de Earle (EBSS) antes de la microscopía. </li></ol></li><li> Experimento 2: Proceso de oxidación en esferoides que expresan un sensor redox <ol><li> Semilla sobre 400 células de glioblastoma U251-MG-L106 permanentemente transfectadas con el sensor de glutatión redox verde fluorescente sensible Grx1-roGFP2 en los pozos recubiertos con gel de agarosa (procedimiento descrito en los pasos 1.1.1-1.1.3) de una placa de 96 pocillos en DMEM medio de cultivo suplementado con 10% de FCS, 1% de penicilina / estreptomicina e higromicina B (150 mg / ml). </li><li> Crecer esferoides durante 5-7 días hasta un diámetro de alrededor de 200 a 300 micras en una incubadora a 5% de CO2 y 37 ° C. </li><li> Añadir 10 &amp; #181; l de solución de peróxido de hidrógeno (pa purum, ≥ 30%) a 990 agua bidestilada l para crear una solución madre 100 mM para ser utilizado dentro de 12 horas. </li><li> Diluir la solución madre de la etapa 1.2.3 a 50 M en EBSS justo antes del experimento. </li><li> Incubar los esferoides de células a través del sistema de microfluidos durante la medición con peróxido de hidrógeno 50 mM en EBSS para la oxidación del sensor redox. </li></ol></li><li> Experimento 3: Iniciación y etiquetado de necrosis celular dentro de esferoides <ol><li> Semilla alrededor de 400 células (por ejemplo, células de glioblastoma U251-MG-L106-Grx1-roGFP2) en pozos recubiertos con gel de agarosa (procedimiento descrito en los pasos 1.1.1-1.1.3) de una placa de 96 pocillos en medio de cultivo DMEM suplementado con 10% de FCS, 1% de penicilina / estreptomicina e higromicina B (150 mg / ml). </li><li> Crecer esferoides durante 5-7 días hasta un diámetro de alrededor de 200 a 300 micras en una incubadora a 5% de CO2 y 37 ° C. </li><li> Incubar la célulaesferoides con el transporte de electrones mitocondrial rotenona inhibidor durante 3 horas a una concentración de 1 mM en medio de cultivo para inducir la necrosis celular. Además, co-incubar con un tinte verde citotoxicidad durante 3 horas a una concentración de 1 l en 1 ml de medio de cultivo para etiquetar células necróticas. </li><li> Lave los esferoides celulares con medio de cultivo o EBSS antes de la microscopía. </li></ol></li></ol> 2. Hoja Luz de ajuste NOTA: Para lograr los mejores resultados, se debe garantizar que la cintura del haz de la hoja de luz está en el plano de enfoque de la lente objetivo. La posición de la cintura del haz sólo se puede alinear mediante la observación de la hoja de luz en posición vertical con respecto al capilar (consulte los pasos 2.5 a 2.8). <ol><li> Utilice un microscopio invertido y montar el módulo de excitación SPIM, como se describe en la Ref. 16, a la placa base de la mesa de posicionamiento (véase la Figura 1A). </li><li> Equipar el microscopio con un 10X / o 20X 0,3 / 0,5 microscopio de lente de objetivo y un filtro apropiado de paso largo (por ejemplo, λ ≥ 515 nm) en la trayectoria de detección del microscopio. </li><li> Montar la integración de una cámara al puerto de detección del microscopio. </li><li> Utilice un haz colimado paralela de un láser o un diodo láser con una longitud de onda de excitación de 470 nm y preferentemente aplicar al módulo SPIM. </li><li> Girar la lente cilíndrica 90 grados, que transfiere la hoja de la luz en una posición vertical para un ajuste axial de la cintura del haz de la hoja de luz. </li><li> Coloque un capilar que contiene un líquido con un tinte fluorescente en el portamuestras. </li><li> Una el soporte de la muestra con el capilar a la mesa de posicionamiento del microscopio y alinear la posición del capilar de manera que se centra y la cintura del haz de la hoja de la luz está en el foco. </li><li> Ajuste la cintura del haz por la variación de la posición axial de la lente cilíndrica sí mismo. A continuación, girar la lente después de adglaje. </li></ol> 3. Cell Aplicación esferoide y Microscopio RSS Sincronización <ol><li> Coloque los esferoides de células por separado o en grupos dentro de capilares de vidrio de borosilicato 16 rectangular con una sección transversal interior de 600 micras x 600 micras y un espesor de pared de 120 micras. Dos técnicas para la aplicación de un esferoide de células han demostrado ser exitoso. <ol><li> Tome el capilar vacío en posición vertical con el dedo pulgar y el dedo medio y sellar la abertura superior con el dedo índice. Traiga la abertura inferior cerca del esferoide de células en su líquido circundante (EBSS o medio de cultivo). Soltar el dedo índice desde la abertura superior. Líquido con el esferoide de células en ella se empapó en forma inmediata por las fuerzas capilares. Ajustar la posición del esferoide dentro del capilar llenado por gravedad en posición vertical respectivo del capilar. </li><li> Alternativamente, aplicar el esferoide de células para el capilar a través de pipeteado. Tome el cuidado del that la abertura de la punta de la pipeta es, por un lado, lo suficientemente grande para el tamaño del esferoide y, por otra parte, menos o igual en tamaño al diámetro interior del capilar. </li></ol></li><li> Coloque el capilar con el esferoide en ella en un soporte especial de la muestra para microscopía. </li><li> Una el soporte de la muestra con el capilar a la mesa de posicionamiento del microscopio y alinear la posición del esferoide de células de tal manera que se centra y se concentró. </li><li> Establecer la correspondencia entre la lámina de luz y el plano focal de la lente objetivo del microscopio en la trayectoria de detección mediante el ajuste de la posición del espejo de reflexión y la lente cilíndrica (véase tornillo de ajuste en la Figura 1B). </li><li> Ajuste el tornillo micrométrico (véase la Figura 1B) de acuerdo con los índices de refracción y la apertura numérica de la lente objetivo para compensar el efecto pecera. NOTA: Los diferentes índices de refracción de la muestra y el medio circundante tél plomo lente objetivo a una diferencia entre el desplazamiento de la lente objetivo y el cambio del plano focal. Puesto que la lámina de luz se mueve por la torreta objetivo, el desfase entre el desplazamiento de la lámina de luz (correspondiente al desplazamiento de la lente objetivo) y el desplazamiento del plano focal es compensada por un brazo de palanca (véase la Figura 1B). El tornillo micrométrico se utiliza para adaptar la distancia entre la parte superior y el pasador inferior para ajustar el desplazamiento de la hoja de luz de acuerdo con la apertura numérica de la lente objetivo y los índices de refracción. </li></ol><img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51993/51993fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. (A) Imagen del módulo de iluminación plano único montado en la placa de base de la tabla de posicionamiento de un microscopio invertido, (B) de configuración del plano de iluminación únicomódulo y la sincronización de alimentación microscopio para compensar la elevación-desajuste (efecto pecera) entre el plano focal y el plano de iluminación. O Delta z indica el desplazamiento de la lente objetivo y Delta z f el desplazamiento del plano focal y la hoja de luz. La incrustación muestra secciones transversales de esferoide que contiene capilares. Izquierda: capilar rectangular con diámetro interior de 600 micras (de pared de 120 micras). Derecha: el programa de instalación utilizado para la rotación. Un capilar interior redonda (diámetro interior de 400 m, diámetro exterior de 550 micras) se gira dentro del capilar rectangular exterior. El espacio entre los dos tubos capilares se llena con un fluido de inmersión. 4. medición en líquido dinámico para el Medio Ambiente NOTA: El protocolo anterior se utiliza para la incubación estática antes de una medición en el que el esferoide de células ha sido previamente incuba y luego se mantiene en su lugar en el capilar mediante la simple gravitación. No hay necesidad de nuevas FIJACIÓNsucesivamente. Sin embargo, para mediciones en donde los medios de comunicación que fluye de una incubación de dinámica y, por lo tanto, un entorno dinámico es deseable medir la cinética de absorción, se puede lograr este sub-protocolo. Los pasos 4.5 hasta 4.9 son fundamentales para evitar las burbujas de aire que llegan a la muestra. <ol><li> Llenar el capilar con FCS durante 30 min para apoyar la adhesión celular después de un esferoide de células a la superficie de vidrio interior. </li><li> Deje que el recubrimiento FCS restante en el capilar empobrecido se seque por lo menos durante 12 horas. </li><li> Introducir el esferoide de células al capilar recubierto FCS como se describe en el paso 3.2. </li><li> Deje el capilar en el incubador a 5% de CO2 y 37 ° C durante 2-4 horas adicionales para causar la adhesión celular del esferoide. </li><li> Configure la parte aflujo del sistema de microfluidos (ver Figura 2). Utilice una bomba peristáltica para llenar el aflujo de la tubería (diámetro interior: 0,89 mm) con medio de cultivo que contiene el colorante fluorescente, fármaco o agente. </li><li> Connect la parte aflujo del sistema microfluídico a una trampa de burbujas (véase la Figura 2). </li><li> En primer lugar sujetar el capilar sin burbujas a la tubería de aflujo y luego sujetar el otro lado del capilar a la tubería de drenaje. </li><li> Sintonice la temperatura del líquido del baño de agua hasta el valor deseado (por ejemplo, 37 ° C). </li><li> Ajustar la bomba peristáltica a la velocidad de la bomba deseada (por ejemplo, velocidad de flujo: 9 l / min; la velocidad de la bomba en el capilar: 25 mm / min). </li><li> Recoger el líquido bombeado sea en un (configuración de bucle abierto) destinatario, alimentar de nuevo a su fuente (configuración de circuito cerrado) o alimentarlo directamente en el tubo de la bomba peristáltica (configuración de circuito cerrado apretado). </li></ol><img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51993/51993fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. configuración de microfluidos (lazo abierto y apretado de circuito cerrado); incrustaciones de: Iluminación de un spheroid dentro de un micro-capilar mediante hoja de luz de microscopía de fluorescencia basada acoplado a un microscopio invertido. 5. Adquisición de datos y análisis <ol><li> Ajuste la potencia del láser y el tiempo de integración para la adquisición de imágenes. </li><li> Tenga cuidado de que los parámetros definidos en el paso 5.1 no exceden los valores de dosis de luz sobre 50-100 J / cm 2 para las células nativas o 10-20 J / cm 2 para las células incubadas con un colorante fluorescente o transfectadas con un plásmido que codifica la proteína fluorescente a evitar la fototoxicidad (para detalles ver. Ref 12). </li><li> Ajuste el incremento para el z-stack a Delta z = 5-10 micras que es preferible para el análisis de datos en 3 dimensiones como el grosor de lámina de luz es de aproximadamente 10 micras. </li><li> Realizar mediciones de imágenes individuales o z-pilas por la variación del plano focal dentro del esferoide de células. </li></ol>

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Biophotonics. 4 (3), 143-149 (2011).</li><li>Schneckenburger, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+exposure+and+cell+viability+in+fluorescence+microscopy.">Light exposure and cell viability in fluorescence microscopy.</a> J. Microsc. 245 (3), 311-318 (2012).</li><li>Ritter, J. G., Veith, R., Veenendaal, A., Siebrasse, J. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids+as+an+in+vivo-like+tumor+model+for+three-dimensional+imaging+of+chemotherapeutic+and+nano+material+cellular+penetration.">Multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model for three-dimensional imaging of chemotherapeutic and nano material cellular penetration.</a> Mol. Imaging. 11 (6), 487-498 (2012).</li><li>Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+dependent+uptake+and+interaction+of+doxorubicin+in+MCF-7+breast+cancer+cells.">Cholesterol dependent uptake and interaction of doxorubicin in MCF-7 breast cancer cells.</a> Int. J. Mol. Sci. 14 (4), 8358-8366 (2013).</li><li>Hovorka, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+analysis+of+doxorubicin+accumulation+and+the+indirect+quantification+of+its+DNA+intercalation.">Spectral analysis of doxorubicin accumulation and the indirect quantification of its DNA intercalation.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 76 (3), 514-524 (2010).</li><li>Schickinger, S., Bruns, T., Wittig, R., Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanosecond+ratio+imaging+of+redox+states+in+tumor+cell+spheroids+using+light+sheet-based+fluorescence+microscopy.">Nanosecond ratio imaging of redox states in tumor cell spheroids using light sheet-based fluorescence microscopy.</a> J. Biomed. Opt. 18 (12), 126007 (2013).</li><li>Lippert, H., Wald, M., Radt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+arrangement+for+the+production+of+a+light+sheet.">Optical arrangement for the production of a light sheet.</a> U.S. Patent. , (2010).</li><li>Lorenzo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+division+dynamics+monitoring+in+3D+large+spheroid+tumor+models+using+light+sheet+microscopy.">Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy.</a> Cell Division. 6 (22), 1-8 (2011).</li><li>Bruns, T., Schneckenburger, H., Schickinger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+holder+for+rotation+of+three-dimensional+specimens+in+microscopy.">Sample holder for rotation of three-dimensional specimens in microscopy.</a> European Patent Application. , (2013).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El presente manuscrito describe una hoja de luz o microscopía de iluminación plano único (SPIM) del dispositivo que está optimizado para sistemas de células de 3 dimensiones, por ejemplo, esferoides tumorales multicelulares (MCT). Tres aplicaciones ejemplares incluyen (1) la absorción de un fármaco citostático y su conversión parcial a un producto de degradación (cuya contribución a la eficacia de la quimioterapia sigue siendo ser evaluado), (2) mediciones del estado redox mediante el uso de un senso...

Además de los métodos bien establecidos (confocal o de múltiples fotones microscopía de escaneo láser 1-4, iluminación estructurada de microscopía 5,6) de lámina de luz o microscopía de iluminación plano único (SPIM) ha demostrado ser un valioso método de formación de imágenes 3D 7,8, 9. De particular interés es su aplicación a cultivos de células de 3 dimensiones, por ejemplo, esferoides tumorales multicelulares (MCT), que se utilizan cada vez más para la investigación de descubrimiento de fármacos 10,11. Además, SPIM es un método preferencial cuando incluso después de la exposición a largo plazo o mediciones repetitivas se requieren dosis bajas de luz para mantener la viabilidad de la muestra, ya que para la medición de cada plano de la muestra sólo este plano se expone a la luz. Esto está en contraste con otras técnicas de microscopía, donde para la detección de cada plano focal se ilumina toda la muestra, de modo que tras la grabación de numerosos planos las sumas dosis de luz y puede dañar la muestra 12. </p&gt; Microscopía de lámina de luz o SPIM se basa en la iluminación de la muestra en dirección perpendicular a la trayectoria de observación ya sea mediante el uso de una lente cilíndrica o escaneando el haz de láser excitante (para una revisión ver ref. 8). Esto a menudo requiere cámaras de muestras especiales 13,14 o matrices, por ejemplo, agarosa 7,15, implementado en los microscopios especiales de alto costo. Como una alternativa a los sistemas de un dispositivo de iluminación sencilla comparable para SPIM se ha desarrollado y adaptado a un microscopio invertido convencional 16 (véase la Figura 1). Se compone de un haz de láser expandido a un diámetro de 8 mm y enfocada por una lente cilíndrica (longitud focal: 50 mm, apertura numérica: 0,08) a una hoja de luz de 6-10 micras de espesor sobre una profundidad de campo de aproximadamente 100 micras . Las muestras se encuentran en un capilar rectangular de 600-900 m de diámetro interior colocado delante del microscopio len objetivos para la detección de fluorescencia. Estas características principales están actualmente completado y optimizado por el uso de enfoques micro-capilares avanzadas para sujetar y para la rotación de las muestras, el ajuste sincrónico de la hoja de luz de iluminación (en dirección axial) y la lente del objetivo utilizados para la detección de fluorescencia (camino óptico idéntico longitudes de desplazamiento requieren una corrección de la alimentación mecánica), y la adaptación de un sistema de microfluidos para la aplicación de tintes fluorescentes, agentes farmacéuticos o medicamentos, minimizando de este modo las cantidades y los gastos necesarios.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="944">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:243px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:201px;">Company</td>
			<td style="width:124px;">&#160;Catalog Number</td>
			<td style="width:376px;">Comments/Description(optional)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">microtiter plate</td>
			<td>Orange Scientific</td>
			<td>4430100</td>
			<td>for cell spheroid growing</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">agarose&#160;</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3810.1</td>
			<td>for cell spheroid growing</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">MCF-7 cell line</td>
			<td>CLS Cell Lines Service GmbH</td>
			<td>300273</td>
			<td>cell line</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">U251-MG-L106 cell line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>cell line</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">DMEM</td>
			<td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td>
			<td>FG0435</td>
			<td>culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">DMEM/Ham&#39;s F-12</td>
			<td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td>
			<td>FG4815</td>
			<td>culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">FCS</td>
			<td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td>
			<td>S0615</td>
			<td>cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td>
			<td>A 2213</td>
			<td>antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">hygromycin B</td>
			<td style="width:201px;">PAA Laboratories&#160;&#160;</td>
			<td>P02-015</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">EBSS</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc.</td>
			<td>E3024</td>
			<td>cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">doxorubicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc.</td>
			<td>D1515</td>
			<td>fluorescent dye (CAUTION: acute toxicity)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">green cytotoxicity dye</td>
			<td>Promega GmbH</td>
			<td>G8742</td>
			<td>CellTox - fluorescent cytotoxicity dye</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc.</td>
			<td>R8875</td>
			<td>cellular inhibitor (CAUTION: acute toxicity)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">hydrogen peroxide (H2O2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc.</td>
			<td>95302</td>
			<td>reagent for oxidation (CAUTION: acute toxicity)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">capillary</td>
			<td>VitroCom&#160;</td>
			<td>8260-050</td>
			<td>sample preparation</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Jena</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">AxioCam MRc CCD-camera</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td>
			<td>426508-9901-000</td>
			<td>CCD-camera</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">AxioVision data aquisition software</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td>
			<td>version 4.8.2.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">laser diode</td>
			<td>Pico Quant GmbH</td>
			<td>LDH-P-C-470</td>
			<td>used with driver PDL800-B</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">perestaltic pump</td>
			<td>Ismatec Labortechnik</td>
			<td>MS-1 Reglo</td>
			<td>re-callibrated to reduce the minimum pump speed by 1/10&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">silicone tubes</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science GmbH</td>
			<td>TYGON R3607</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single plane illumination module and micro-capillary approach for a wide-field microscope

Un módulo para la hoja de luz o iluminación microscopía de plano único (SPIM) se describe que se adapta fácilmente a un microscopio de campo amplio invertida y optimizado para cultivos de células de 3 dimensiones, por ejemplo, esferoides tumorales multicelulares (MCT). Las formas del módulo de excitación SPIM y desvía la luz de tal manera que la muestra es iluminada por una lámina de luz perpendicular a la trayectoria de detección del microscopio. El sistema se caracteriza por el uso de un capilar rectangular para sostener (y en una versión avanzada también por un enfoque de micro capilar para hacer girar) las muestras, mediante el ajuste sincrónico de la hoja de luz de iluminación y la lente del objetivo utilizada para la detección de fluorescencia, así como por la adaptación de un sistema de microfluidos para la aplicación de tintes fluorescentes, agentes farmacéuticos o medicamentos en pequeñas cantidades. Se da un protocolo para trabajar con este sistema, y ​​algunos detalles técnicos son reportados. Los resultados representativos incluyen (1) mediciones de la UPtomar de un fármaco citostático (doxorrubicina) y su conversión parcial a un producto de degradación, (2) mediciones redox mediante el uso de un sensor de glutatión codificado genéticamente después de la adición de un agente oxidante, y (3) la iniciación y el etiquetado de necrosis celular de la inhibición de la cadena respiratoria mitocondrial. Se discuten las diferencias y ventajas de la presente módulo SPIM en comparación con los sistemas existentes.

Experimento 1: esferoides de células incubadas con un fármaco quimioterapéutico Una tomografía z-stack de un esferoide de células previamente incubadas MCF-7 (8 M doxorrubicina, 6 horas) se representa en la figura 3. Proporciona información detallada acerca de la captación celular y la distribución de doxorrubicina 17 y su producto de degradación 18,19. Dentro de la capa celular externa de la doxorubicina fluorescente de color ...

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Single Plane Illumination Module and Micro-capillary Approach for a Wide-field Microscope

Un módulo para la iluminación microscopía de plano único (SPIM) se describe que se adapta fácilmente a un microscopio de campo amplio invertida y optimizado para cultivos celulares 3-dimensionales. La muestra se encuentra dentro de un capilar rectangular, y a través de un sistema de microfluidos colorantes fluorescentes, agentes farmacéuticos o medicamentos puede ser aplicado en pequeñas cantidades.

Módulo de iluminación solo plano y Aproximación Micro-capilar para un microscopio de campo amplio

A module for light sheet or single plane illumination microscopy (SPIM) is described which is easily adapted to an inverted wide-field microscope and ...

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Research

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Engineering

9.6K vistas.  Aalen University.  Un módulo para la iluminación microscopía de plano único (SPIM) se describe que se adapta fácilmente a un microscopio de campo amplio invertida y optimizado para cultivos celulares 3-dimensionales. La muestra se encuentra dentro de un capilar rectangular, y a través de un sistema de microfluidos colorantes fluorescentes, agentes farmacéuticos o medicamentos puede ser aplicado en pequeñas cantidades. 

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Construction of a High Resolution Microscope with Conventional and Holographic Optical Trapping Capabilities

High resolution microscope systems with optical traps allow for precise manipulation of various refractive objects, such as dielectric beads 1 or cellular organelles 2,3, as well as for high spatial and temporal resolution readout of their position relative to the center of the trap. The system described herein has one such "traditional" trap operating at 980 nm. It additionally provides a second optical trapping system that uses a commercially available holographic package to simultaneously create and manipulate complex trapping patterns in the field of view of the microscope 4,5 at a wavelength of 1,064 nm. The combination of the two systems allows for the manipulation of multiple refractive objects at the same time while simultaneously conducting high speed and high resolution measurements of motion and force production at nanometer and piconewton scale.

The system described herein employs a traditional optical trap as well as an independent holographic optical trapping line, capable of creating and manipulating multiple traps. This allows for the creation of complex geometric arrangements of refractive particles while also permitting simultaneous high-speed, high-resolution measurements of the activity of biological enzymes.

Construcción de un microscopio de alta resolución con capacidades de captura óptica convencional y holográfica

High resolution microscope systems with optical traps allow for precise manipulation of various refractive objects, such as dielectric beads 1 or cellular ...

Investigación

Ingeniería

Analysis of Contact Interfaces for Single GaN Nanowire Devices

Single GaN nanowire (NW) devices fabricated on SiO2 can exhibit a strong degradation after annealing due to the occurrence of void formation at the contact/SiO2 interface. This void formation can cause cracking and delamination of the metal film, which can increase the resistance or lead to a complete failure of the NW device. In order to address issues associated with void formation, a technique was developed that removes Ni/Au contact metal films from the substrates to allow for the examination and characterization of the contact/substrate and contact/NW interfaces of single GaN NW devices. This procedure determines the degree of adhesion of the contact films to the substrate and NWs and allows for the characterization of the morphology and composition of the contact interface with the substrate and nanowires. This technique is also useful for assessing the amount of residual contamination that remains from the NW suspension and from photolithographic processes on the NW-SiO2 surface prior to metal deposition. The detailed steps of this procedure are presented for the removal of annealed Ni/Au contacts to Mg-doped GaN NWs on a SiO2 substrate.

A technique was developed that removes Ni/Au contact metal films from their substrate to allow for the examination and characterization of the contact/substrate and contact/NW interfaces of single GaN nanowire devices.

Análisis de Contacto Interfaces para individuales GaN nanocables Dispositivos

Single GaN nanowire (NW) devices fabricated on SiO2 can exhibit  a strong degradation after annealing due to the  occurrence of void formation at the ...

Measuring Material Microstructure Under Flow Using 1-2 Plane Flow-Small Angle Neutron Scattering

A new small-angle neutron scattering (SANS) sample environment optimized for studying the microstructure of complex fluids under simple shear flow is presented. The SANS shear cell consists of a concentric cylinder Couette geometry that is sealed and rotating about a horizontal axis so that the vorticity direction of the flow field is aligned with the neutron beam enabling scattering from the 1-2 plane of shear (velocity-velocity gradient, respectively). This approach is an advance over previous shear cell sample environments as there is a strong coupling between the bulk rheology and microstructural features in the 1-2 plane of shear. Flow-instabilities, such as shear banding, can also be studied by spatially resolved measurements. This is accomplished in this sample environment by using a narrow aperture for the neutron beam and scanning along the velocity gradient direction. Time resolved experiments, such as flow start-ups and large amplitude oscillatory shear flow are also possible by synchronization of the shear motion and time-resolved detection of scattered neutrons. Representative results using the methods outlined here demonstrate the useful nature of spatial resolution for measuring the microstructure of a wormlike micelle solution that exhibits shear banding, a phenomenon that can only be investigated by resolving the structure along the velocity gradient direction. Finally, potential improvements to the current design are discussed along with suggestions for supplementary experiments as motivation for future experiments on a broad range of complex fluids in a variety of shear motions.

A shear cell is developed for small-angle neutron scattering measurements in the velocity-velocity gradient plane of shear and is used to characterize complex fluids. Spatially resolved measurements in the velocity gradient direction are possible for studying shear-banding materials. Applications include investigations of colloidal dispersions, polymer solutions, and self-assembled structures.

Medición material Microestructura Bajo Flujo de 1-2 Plano de Flujo de ángulo pequeño dispersión de neutrones

A new small-angle neutron scattering (SANS) sample environment optimized for studying the microstructure of complex fluids under simple shear flow is ...

Laser-induced Breakdown Spectroscopy: A New Approach for Nanoparticle's Mapping and Quantification in Organ Tissue

Emission spectroscopy of laser-induced plasma was applied to elemental analysis of biological samples. Laser-induced breakdown spectroscopy (LIBS) performed on thin sections of rodent tissues: kidneys and tumor, allows the detection of inorganic elements such as (i) Na, Ca, Cu, Mg, P, and Fe, naturally present in the body and (ii) Si and Gd, detected after the injection of gadolinium-based nanoparticles. The animals were euthanized 1&#160;to 24 hr&#160;after intravenous injection of particles. A two-dimensional scan of the sample, performed using a motorized micrometric 3D-stage, allowed the infrared laser beam exploring the surface with a lateral resolution less than 100 &#956;m. Quantitative chemical images of Gd element inside the organ were obtained with sub-mM sensitivity. LIBS offers a simple and robust method to study the distribution of inorganic materials without any specific labeling. Moreover, the compatibility of the setup with standard optical microscopy emphasizes its potential to provide multiple images of the same biological tissue with different types of response:&#160;elemental, molecular, or cellular.

Laser-induced Breakdown Spectroscopy: A New Approach for Nanoparticle&#039;s Mapping and Quantification in Organ Tissue

Laser-induced breakdown spectroscopy performed on thin organ and tumor tissue successfully detected natural elements and artificially injected gadolinium (Gd), issued from Gd-based nanoparticles. Images of chemical elements reached a resolution of 100 &#956;m and quantitative sub-mM sensitivity. The compatibility of the setup with standard optical microscopy emphasizes its potential to provide multiple images of a same biological tissue.

Inducida por láser Breakdown Spectroscopy: un nuevo enfoque para el mapeo y cuantificación de nanopartículas en tejidos de órganos

Emission spectroscopy of laser-induced plasma was applied to elemental analysis of biological samples. Laser-induced breakdown spectroscopy (LIBS) ...

In Situ Time-dependent Dielectric Breakdown in the Transmission Electron Microscope: A Possibility to Understand the Failure Mechanism in Microelectronic Devices

The time-dependent dielectric breakdown (TDDB) in on-chip interconnect stacks is one of the most critical failure mechanisms for microelectronic devices. The aggressive scaling of feature sizes, both on devices and interconnects, leads to serious challenges to ensure the required product reliability. Standard reliability tests and post-mortem failure analysis provide only limited information about the physics of failure mechanisms and degradation kinetics. Therefore it is necessary to develop new experimental approaches and procedures to study the TDDB failure mechanisms and degradation kinetics in particular. In this paper, an in situ experimental methodology in the transmission electron microscope (TEM) is demonstrated to investigate the TDDB degradation and failure mechanisms in Cu/ULK interconnect stacks. High quality imaging and chemical analysis are used to study the kinetic process. The in situ electrical test is integrated into the TEM to provide an elevated electrical field to the dielectrics. Electron tomography is utilized to characterize the directed Cu diffusion in the insulating dielectrics. This experimental procedure opens a possibility to study the failure mechanism in interconnect stacks of microelectronic products, and it could also be extended to other structures in active devices.

In Situ Time-dependent Dielectric Breakdown in the Transmission Electron Microscope: A Possibility to Understand the Failure Mechanism in Microelectronic Devices

The time-dependent dielectric breakdown (TDDB) in on-chip interconnect stacks is one of the most critical failure mechanisms for microelectronic devices. This paper demonstrates the procedure of an in situ TDDB experiment in the transmission electron microscope, which opens a possibility to study the failure mechanism in microelectronic products.

En Desglose dieléctrica Situ dependiente del tiempo en el microscopio electrónico de transmisión: una posibilidad de comprender el mecanismo de falla en los dispositivos microelectrónicos

The time-dependent dielectric breakdown (TDDB) in on-chip interconnect stacks is one of the most critical failure mechanisms for microelectronic devices. ...

Compact Lens-less Digital Holographic Microscope for MEMS Inspection and Characterization

A micro-electro-mechanical-system (MEMS) is a widely used component in many industries, including energy, biotechnology, medical, communications, and automotive. However, effective inspection and characterization metrology systems are needed to ensure the functional reliability of MEMS. This study presents a system based on digital holography as a tool for MEMS metrology. Digital holography has gained increasing attention in the past 20 years. With the fast development and decreasing cost of sensor arrays, resolution of such systems has increased broadening potential applications. Thus, it has attracted attention from both research and industry sides as a potential reliable tool for industrial metrology. Indeed, by recording the interference pattern between an object beam (which contains sample height information) and a reference beam on a CCD camera, one can retrieve the quantitative phase information of an object. However, most of digital holographic systems are bulky and thus not easy to implement on industry production lines. The novelty of the system presented is that it is lens-less and thus very compact. In this study, it is shown that the Compact Digital Holographic Microscope (CDHM) can be used to evaluate several characteristics typically consider as criteria in MEMS inspections. The surface profiles of MEMS in both static and dynamic conditions are presented. Comparison with AFM is investigated to validate the accuracy of the CDHM.

We present a compact reflection digital holographic system (CDHM) for inspection and characterization of MEMS devices. A lens-less design using a diverging input wave providing natural geometrical magnification is demonstrated. Both static and dynamic studies are presented.

Compacto holográfica microscopio digital Lente menos por MEMS Inspección y Caracterización

A micro-electro-mechanical-system (MEMS) is a widely used component in many industries, including energy, biotechnology, medical, communications, and ...

Hand Controlled Manipulation of Single Molecules via a Scanning Probe Microscope with a 3D Virtual Reality Interface

Considering organic molecules as the functional building blocks of future nanoscale technology, the question of how to arrange and assemble such building blocks in a bottom-up approach is still open. The scanning probe microscope (SPM) could be a tool of choice; however, SPM-based manipulation was until recently limited to two dimensions (2D). Binding the SPM tip to a molecule at a well-defined position opens an opportunity of controlled manipulation in 3D space. Unfortunately, 3D manipulation is largely incompatible with the typical 2D-paradigm of viewing and generating SPM data on a computer. For intuitive and efficient manipulation we therefore couple a low-temperature non-contact atomic force/scanning tunneling microscope (LT NC-AFM/STM) to a motion capture system and fully immersive virtual reality goggles. This setup permits &#34;hand controlled manipulation&#34; (HCM), in which the SPM tip is moved according to the motion of the experimenter&#39;s hand, while the tip trajectories as well as the response of the SPM junction are visualized in 3D. HCM paves the way to the development of complex manipulation protocols, potentially leading to a better fundamental understanding of nanoscale interactions acting between molecules on surfaces. Here we describe the setup and the steps needed to achieve successful hand-controlled molecular manipulation within the virtual reality environment.

We demonstrate the precise manipulation of individual organic molecules on a metal surface with the tip of a scanning probe microscope driven in 3D by the experimenter's hand using a motion capture system and fully immersive virtual reality goggles.

Mano manipulación controlada de Moléculas Individuales a través de un microscopio de sonda de barrido con una interfaz de realidad virtual 3D

Considering organic molecules as the functional building blocks of future nanoscale technology, the question of how to arrange and assemble such building ...

Demonstration of a Hyperlens-integrated Microscope and Super-resolution Imaging

The use of super-resolution imaging to overcome the diffraction limit of conventional microscopy has attracted the interest of researchers in biology and nanotechnology. Although near-field scanning microscopy and superlenses have improved the resolution in the near-field region, far-field imaging in real-time remains a significant challenge. Recently, the hyperlens, which magnifies and converts evanescent waves into propagating waves, has emerged as a novel approach to far-field imaging. Here, we report the fabrication of a spherical hyperlens composed of alternating silver (Ag) and titanium oxide (TiO2) thin layers. Unlike a conventional cylindrical hyperlens, the spherical hyperlens allows for two-dimensional magnification. Thus, incorporation into conventional microscopy is straightforward. A new optical system integrated with the hyperlens is proposed, allowing for a sub-wavelength image to be obtained in the far-field region in real time. In this study, the fabrication and imaging setup methods are explained in detail. This work also describes the accessibility and possibility of the hyperlens, as well as practical applications of real-time imaging in living cells, which can lead to a revolution in biology and nanotechnology.

The use of a hyperlens has been regarded as a novel super-resolution imaging technique due to its advantages in real-time imaging and its simple implementation with conventional optics. Here, we present a protocol describing the fabrication and imaging applications of a spherical hyperlens.

Demostración de un microscopio integrado de Hyperlens y proyección de imagen de súper resolución

The use of super-resolution imaging to overcome the diffraction limit of conventional microscopy has attracted the interest of researchers in biology and ...

All-electronic Nanosecond-resolved Scanning Tunneling Microscopy: Facilitating the Investigation of Single Dopant Charge Dynamics

The miniaturization of semiconductor devices to scales where small numbers of dopants can control device properties requires the development of new techniques capable of characterizing their dynamics. Investigating single dopants requires sub-nanometer spatial resolution, which motivates the use of scanning tunneling microscopy (STM). However, conventional STM is limited to millisecond temporal resolution. Several methods have been developed to overcome this shortcoming, including all-electronic time-resolved STM, which is used in this study to examine dopant dynamics in silicon with nanosecond resolution. The methods presented here are widely accessible and allow for local measurement of a wide variety of dynamics at the atomic scale. A novel time-resolved scanning tunneling spectroscopy technique is presented and used to efficiently search for dynamics.

We demonstrate an all-electronic method to observe nanosecond-resolved charge dynamics of dopant atoms in silicon with a scanning tunneling microscope.

Totalmente electrónico resuelto nanosegundo túnel microscopía: Facilitar la investigación de Dopant solo carga dinámica

The miniaturization of semiconductor devices to scales where small numbers of dopants can control device properties requires the development of new ...

Single-Digit Nanometer Electron-Beam Lithography with an Aberration-Corrected Scanning Transmission Electron Microscope

We demonstrate extension of electron-beam lithography using conventional resists and pattern transfer processes to single-digit nanometer dimensions by employing an aberration-corrected scanning transmission electron microscope as the exposure tool. Here, we present results of single-digit nanometer patterning of two widely used electron-beam resists: poly (methyl methacrylate) and hydrogen silsesquioxane. The method achieves sub-5 nanometer features in poly (methyl methacrylate) and sub-10 nanometer resolution in hydrogen silsesquioxane. High-fidelity transfer of these patterns into target materials of choice can be performed using metal lift-off, plasma etch, and resist infiltration with organometallics.

We use an aberration-corrected scanning transmission electron microscope to define single-digit nanometer patterns in two widely-used electron-beam resists: poly (methyl methacrylate) and hydrogen silsesquioxane. Resist patterns can be replicated in target materials of choice with single-digit nanometer fidelity using liftoff, plasma etching, and resist infiltration by organometallics.

Solo dígito nanómetros litografía de haz de electrones con una aberración-corregido exploración microscopio electrónico de transmisión

We demonstrate extension of electron-beam lithography using conventional resists and pattern transfer processes to single-digit nanometer dimensions by ...