We thank Victor Marquez for providing DZNep.HCl and Scotty Bolling for manufacturing the bloodfeeders. The Mopti and SUA2La strains of An. gambiae were obtained from the Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4). This work was supported by the Fralin Life Science Institute and the grant from National Institutes of Health 1R21AI094289 to Igor V. Sharakhov.

NOTA: Las tres partes del protocolo de describir la exposición acuosa del fármaco DZNep a los mosquitos, larvas de una exposición a base de sangre de DZNep a hembras adultas para estudiar su efecto de fecundidad, y la inhibición de hidrolasa SAH por DZNep midieron usando una técnica colorimétrica simple. Una representación esquemática de estos ensayos se muestra en la Figura 1. 1. inmaduros Mosquito Desarrollo y Sobrevivencia ensayos NOTA: En esta sección se explica el uso de un fármaco soluble en agua que afecta el desarrollo de larvas de mosquitos y la supervivencia. <ol><li> Hatch A. gambiae huevos a 28 ° C en agua destilada (dH2O) y trasera estadio las larvas a 2º. </li><li> Tome un DNAsa seis pocillos, RNAsa placa de cultivo celular libre y verter 10 ml dH2O a cada pocillo. </li><li> Seleccione las larvas de mosquitos en 2º instar y añadir 15 larvas por pocillo. Antes de añadir larvas 2ª a la placa, put en una toalla de papel para 2-3 segundos para eliminar el exceso de agua. </li><li> Pozos de etiquetas con las cintas con códigos de colores para aleatorizar experimento. Etiquetar 2 pocillos por concentración de ensayo en cada placa (Figura 2). </li><li> Preparar un hidrocloruro de 1 mM DZNep (PM = 298,73) solución madre disolviendo 0,3 mg DZNep en 1 ml de dH 2 O. Añadir solución madre de DZNep.HCl a los pocillos marcados para alcanzar una concentración final de 0,5 mM y 5,0 mM. NOTA: La solución madre se puede almacenar a 4 ° C para el corto plazo (1 día a un mes) o -20 ° C para el largo plazo (más de un mes). NOTA: La adición de la solución madre para las concentraciones antes mencionadas no va a cambiar el volumen de agua en los pozos de manera significativa. Sin embargo, en caso de concentraciones mucho más altas, es aconsejable para disolver el compuesto en el medio larval para evitar cualquier dilución innecesaria del compuesto. </li><li> Añadir la misma cantidad de alimento para peces de escamas a cada pocillo. Cubrir la placas y los incuban a 28 ° C en una incubadora. </li><li> Registre la mortalidad de las larvas de mosquitos DZNep-tratadas y sin tratar después de un período de exposición de 24 horas. Retire y deseche cualquier larvas muertas. Repita esta grabación todos los días hasta que todo larvas mueren o pupar y emerger como adultos. Registre el tamaño de las larvas de cada segundo día, es decir, días 0, 2, 4, 6, 8, hasta que se convierten en crisálidas. </li><li> Analizar el desarrollo y la mortalidad de larvas de datos utilizando un software de análisis estadístico adecuado. NOTA: Un gráfico de barras puede ser utilizado para representar los datos de mortalidad en Microsoft Excel. Análisis multivariado de varianza (MANOVA) realiza con un software tal como JMP o SPSS revelará si diferentes dosis de la droga como resultado significativamente diferente supervivencia de larvas de mosquitos. </li></ol> 2. La fecundidad de ensayo mediante la administración de drogas a través del alimentador artificial a Femeninos mosquitos NOTA: En esta sección se detalla la adición del fármaco a la sangre unnd de dársela a los mosquitos hembras adultas utilizando un sistema de alimentación artificial. <ol><li> Configure jaulas de mosquitos adultos con igual número de mosquitos machos y hembras para el control y la caja de prueba. Proporcionar una solución de azúcar al 10% impregnado en las bolas de algodón a ambos las jaulas hasta que las hembras están listas para la alimentación (3-5 días es óptimo para Anopheles gambiae). </li><li> 2 horas antes de la alimentación de la sangre, eliminar las bolas de algodón para garantizar hembras tienen hambre. </li><li> Montar dos alimentadores sanguíneos artificiales que consisten en un embudo invertido amplia fondo de vidrio (diámetro = 50 mm, longitud = 70 mm) y un plástico que rodea sellado con pegamento industrial. Conecte los tubos de plástico (diámetro = 7 mm) para dos salidas alimentadores &#39;(diámetro = 10 mm) a través de conectores para entrada y salida de agua. Etiquetar los dos alimentadores como &quot;Control&quot; y &quot;5 mM DZNep.&quot; </li><li> El uso de un elemento de calefacción disponible en el mercado, configurar el programa para la alimentación. En &quot;Menú&quot; ir a &quot;Configuración&quot;y seleccione &quot;Consignas&quot;; aparecerán los programas precargados. Seleccione &quot;SP1&quot; y ajustar la temperatura de 37 ° C. NOTA: El elemento de calentamiento asegura que la sangre administrada se mantiene a una temperatura constante. Ajustes adicionales de programa pueden ser utilizados para diferentes especies de mosquitos o insectos. </li><li> Llene un cubo con agua y sumergir el elemento de calefacción en el agua. </li><li> Corte un pedazo cuadrado de Parafilm (50 mm x 50 mm) y se extienden para hacer una película delgada membranosa. Cubrir el fondo de los alimentadores artificiales con el Parafilm. Corte otro pedazo de Parafilm (50 mm x 10 mm), estirar y sellar los bordes de los alimentadores. </li><li> Ensamblar el sistema, la conexión de los alimentadores y elemento de calentamiento por los tubos. Una vez terminado, encienda el sistema y seleccione &quot;SP1&quot;. Pulse el botón &quot;Enter&quot; para iniciar el sistema. NOTA: El agua se calienta a conseguir 37 ° C y se mantiene a esa temperatura. </li><li> Monitorear ªtemperatura e de agua usando un termómetro en el cubo de agua. NOTA: Los conectores y tubos ayudan a mantener una circulación constante de agua a través del sistema de modo que la temperatura de la sangre se mantiene en 37 ° C. </li><li> Llene una bandeja de fondo plano con una solución de lejía al 10% que será utilizado para descontaminar cualquier derrame de sangre. </li><li> Añadir 2 ml de sangre de oveja desfibrilar a un tubo de microcentrífuga. Etiquetar esto como &quot;Control&quot;. Repita el proceso para el tubo experimental etiquetado como &quot;5 mM DZNep&quot; .Add 6 l de solución madre DZNep (véase el paso 1.5) en el tubo experimental llamado &quot;5 mM DZNep&quot; Mezclar suavemente la sangre y drogas invirtiendo varias veces. Incubar el tubo 10 min a TA. </li><li> Con una pipeta, añadir 2 ml de control y análisis de sangre a la parte superior de los alimentadores correspondientemente etiquetados. Deseche la pipeta en la solución de cloro. Cubra la jaula con una bolsa oscura y respirar aire en jaula periódicamente para fomentar females para la alimentación. </li><li> Deje que los mosquitos se alimentan durante aproximadamente 30 min. Una vez que se haya completado la alimentación, apague el elemento calefactor, tomar los alimentadores y pelar el Parafilm. Remoje el alimentador en la solución de lejía durante unos 5 minutos y enjuagar bien con agua desionizada. </li><li> Quite los alimentadores y poner las bolas de algodón con agua de azúcar en las jaulas durante 48 horas. Publicar un plato de huevos que contiene agua y papel de filtro en las jaulas durante la noche para facilitar la puesta de huevos. Etiqueta de cada plato de huevos con la respectiva concentración de ensayo o de control. </li><li> Retire el plato de huevos al día siguiente y examinar el número y la estructura de los huevos en un microscopio estéreo. Obtener imágenes mediante el software Q-colors5. Cuente el número de huevos. Analizar la diferencia en el número de huevos obtenidos de jaulas de ensayo y de control. NOTA: Una prueba t no pareada se puede utilizar para determinar si el número de huevos son significativamente diferentes (p ≤0.05). </li></ol> 3. Ensayo bioquímico de Mosquito Enzyme Inhibitionpor Drogas NOTA: En esta sección se describe un ensayo de actividad enzimática utilizando DTNB como indicador para determinar el efecto de DZNep sobre la inhibición hidrolasa SAH en machos adultos y hembras de los mosquitos. <ol><li> Preparar un M Na 2 HPO 4 solución (fosfato de sodio dibásico) 0,1 mediante la adición de 14,19 g de Na 2 HPO 4 a 1 l de dH 2 O. A continuación, preparar un M NaH 2 PO 4 solución (fosfato de sodio monobásico) 0,1 mediante la adición de 13,79 g de NaH 2 PO 4 a 1 l de dH 2 O. </li><li> Valorar el M Na solución 0,1 2 HPO 4 con el 4 solución 0,1 M NaH 2 PO a pH 8,5. NOTA: Este será la solución madre de trabajo de 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5). </li><li> Preparar una solución de homogeneización de 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) mediante la adición de 0,3% Triton X-100. NOTA: La solución de homogeneización se puede almacenar a 4 ° C. </li><li> Prepare un 1,6 mM SAH (PM = 384,4) solución disolviendo 6,15 mg de HSA en 10 ml de 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5). </li><li> Preparar una solución 1,6 mM DTNB (PM = 396,4) disolviendo 6,3 mg de DTNB en 10 ml de 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5). Mantenga la solución DTNB fresco en hielo hasta su uso. </li><li> Preparar una solución 1 mM DZNep.HCl (PM = 298,73) disolviendo 0,3 mg de DZNep en 1 ml de dH2O A continuación, se diluye la solución 1 mM DZNep en una serie de concentraciones de 1,000 M a 0,002 mM en dH 2 O. </li><li> Para medir la inhibición de hidrolasa SAH por DZNep, preparar un extracto de enzima en bruto de mosquitos: Homogeneizar 10 mosquitos adultos no sanguíneos alimentado en 1 ml de helado 0,1 M NaH 2 PO 4 (pH 8,5), que contiene 0,3% de Triton X- 100, utilizando un homogeneizador de tejidos de vidrio. Transferir el homogenado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Centrifugar el homogeneizado durante 5 min a 10.000 xg a 4 ° C. Transferir el sobrenadante a un limpia1,5 ml tubo de microcentrífuga. Utilice el sobrenadante como la fuente de enzima para el ensayo bioquímico SAH. </li><li> Para el tratamiento en blanco (es decir, no DZNep, sin enzima), añadir 50 l mM SAH 1,6, 50 mM DTNB 1,6 l, y 100 l 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) a los pocillos individuales de una de 96 pocillos, microplaca de fondo plano. </li><li> Para el control (es decir, no DZNep), añadir 50 l mM SAH 1,6, 50 mM DTNB 1,6 l, 50 l 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) y 50 l de la enzima (SAH hidrolasa obtiene a partir de extracto bruto) para el individuo pozos. </li><li> Para los tratamientos DZNep, añadir 50 l mM SAH 1,6, 50 mM de DTNB 1,6 l, seleccionado concentración DZNep 50 l enzima y 50 l a pocillos individuales. Preparar 4 réplicas por tratamiento y control. </li><li> Leer la densidad óptica (OD) de las muestras de enzima SAH a 405 nm durante 5 minutos a intervalos de 20 seg usando un lector de microplaca de 96 pocillos. </li><li> Reste la DO en blanco del control de unnd tratamiento DO obtenida de cada pocillo. Se calcula el porcentaje restante actividad hidrolasa SAH usando la siguiente ecuación:% de actividad residual = (OD Tratamiento / Control OD) x 100. </li></ol>

<ol>
	<li>Gatton, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+mosquito+behavioural+adaptations+to+malaria+control+in+Africa.">The importance of mosquito behavioural adaptations to malaria control in Africa.</a> Evolution; International Journal of Organic Evolution. 67, 1218-1230 (2013).</li><li>Sternberg, E. D., Thomas, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+adaptation+to+temperature+and+the+implications+for+vector-borne+diseases.">Local adaptation to temperature and the implications for vector-borne diseases.</a> Trends in Parasitology. , (2014).</li><li>Rocca, K. A., Gray, E. M., Costantini, C., Besansky, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2La+chromosomal+inversion+enhances+thermal+tolerance+of+Anopheles+gambiae+larvae.">2La chromosomal inversion enhances thermal tolerance of Anopheles gambiae larvae.</a> Malaria Journal. 8, 147 (2009).</li><li>Coluzzi, M., Sabatini, A., Petrarca, V., Di Deco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+differentiation+and+adaptation+to+human+environments+in+the+Anopheles+gambiae+complex.">Chromosomal differentiation and adaptation to human environments in the Anopheles gambiae complex.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73, 483-497 (1979).</li><li>Donepudi, S., Mattison, R. J., Kihslinger, J. E., Godley, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+Cancer+Therapeutics.">Update on Cancer Therapeutics.</a> Science Direct. 2 (4), 157-206 (2007).</li><li>Greer, E. L., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+methylation:+a+dynamic+mark+in+health,+disease+and+inheritance.">Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance.</a> Nature Reviews. Genetics. 13, 343-357 (2012).</li><li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+and+their+function.">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li><li>Dawson, M. A., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+epigenetics:+from+mechanism+to+therapy.">Cancer epigenetics: from mechanism to therapy.</a> Cell. 150, 12-27 (2012).</li><li>Clough, E., Tedeschi, T., Hazelrigg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+oogenesis+and+germ+stem+cell+maintenance+by+the+Drosophila+histone+methyltransferase+Eggless/dSetDB1.">Epigenetic regulation of oogenesis and germ stem cell maintenance by the Drosophila histone methyltransferase Eggless/dSetDB1.</a> Developmental Biology. 388, 181-191 (2014).</li><li>Conrad, T., Akhtar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dosage+compensation+in+Drosophila+melanogaster:+epigenetic+fine-tuning+of+chromosome-wide+transcription.">Dosage compensation in Drosophila melanogaster: epigenetic fine-tuning of chromosome-wide transcription.</a> Nature Reviews. Genetics. 13, 123-134 (2011).</li><li>Miranda, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DZNep+is+a+global+histone+methylation+inhibitor+that+reactivates+developmental+genes+not+silenced+by+DNA+methylation.">DZNep is a global histone methylation inhibitor that reactivates developmental genes not silenced by DNA methylation.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 8, 1579-1588 (2009).</li><li>Cui, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRIMA-1,+a+Mutant+p53+Reactivator,+Restores+the+Sensitivity+of+TP53+Mutant-type+Thyroid+Cancer+Cells+to+the+Histone+Methylation+Inhibitor+3-Deazaneplanocin+A+(DZNep).">PRIMA-1, a Mutant p53 Reactivator, Restores the Sensitivity of TP53 Mutant-type Thyroid Cancer Cells to the Histone Methylation Inhibitor 3-Deazaneplanocin A (DZNep).</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 99 (11), E962 (2014).</li><li>Fujiwara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Deazaneplanocin+A+(DZNep),+an+inhibitor+of+S-adenosyl-methionine-dependent+methyltransferase,+promotes+erythroid+differentiation.">3-Deazaneplanocin A (DZNep), an inhibitor of S-adenosyl-methionine-dependent methyltransferase, promotes erythroid differentiation.</a> The Journal of Biological Chemistry. , (2014).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+polycomb+group+protein+EZH2+is+a+novel+therapeutic+target+in+tongue+cancer.">The polycomb group protein EZH2 is a novel therapeutic target in tongue cancer.</a> Oncotarget. 4, 2532-2549 (2013).</li><li>Nakagawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+therapy+with+the+histone+methyltransferase+EZH2+inhibitor+3-deazaneplanocin+A+inhibits+the+growth+of+cholangiocarcinoma+cells.">Epigenetic therapy with the histone methyltransferase EZH2 inhibitor 3-deazaneplanocin A inhibits the growth of cholangiocarcinoma cells.</a> Oncology Reports. 31, 983-988 (2014).</li><li>Crea, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+disruption+of+Polycomb+Repressive+Complex+2+inhibits+tumorigenicity+and+tumor+progression+in+prostate+cancer.">Pharmacologic disruption of Polycomb Repressive Complex 2 inhibits tumorigenicity and tumor progression in prostate cancer.</a> Molecular Cancer. 10, 40 (2011).</li><li>Vella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EZH2+down-regulation+exacerbates+lipid+accumulation+and+inflammation+in+in+vitro+and+in+vivo+NAFLD.">EZH2 down-regulation exacerbates lipid accumulation and inflammation in in vitro and in vivo NAFLD.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14, 24154-24168 (2013).</li><li>Tan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+disruption+of+Polycomb-repressive+complex+2-mediated+gene+repression+selectively+induces+apoptosis+in+cancer+cells.">Pharmacologic disruption of Polycomb-repressive complex 2-mediated gene repression selectively induces apoptosis in cancer cells.</a> Genes &amp; Development. 21, 1050-1063 (2007).</li><li>Chiang, P. K., Cantoni, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+biochemical+transmethylations+by+3-deazaadenosine+in+vivo.">Perturbation of biochemical transmethylations by 3-deazaadenosine in vivo.</a> Biochemical Pharmacology. 28, 1897-1902 (1979).</li><li>Lu, Y. X., Denlinger, D. L., Xu, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+repressive+complex+2+(PRC2)+protein+ESC+regulates+insect+developmental+timing+by+mediating+H3K27me3+and+activating+prothoracicotropic+hormone+gene+expression.">Polycomb repressive complex 2 (PRC2) protein ESC regulates insect developmental timing by mediating H3K27me3 and activating prothoracicotropic hormone gene expression.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288, 23554-23564 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Hay varios pasos vitales para la aplicación exitosa de este protocolo. Para el ensayo de las larvas, se debe tener cuidado para etiquetar y replicar cada concentración de ensayo correctamente. La aleatorización de las muestras de ensayo y la adición de la cantidad designada de fármaco a los pocillos de ensayo respectivos es una parte importante de este montaje experimental. Antes de añadir 2º larvas de mosquitos instar a una microplaca de 96 pocillos, cada larva se puede poner en una toalla de papel pa...

La malaria es responsable del mayor número de muertes relacionadas con insectos en el mundo. Se estima que unos 219 millones de casos cada año se producen en todo el mundo, lo que resulta en aproximadamente 660.000 muertes, principalmente en África 1. A pesar de los esfuerzos concertados, programas contra la malaria se enfrentan a varios retos. Mientras que los mosquiteros tratados con insecticida y componentes clave formulario pulverización residual del programa, la resistencia a los insecticidas en poblaciones locales impiden estos esfuerzos 2. El rápido aumento de las poblaciones de mosquitos resistentes a los insecticidas se atribuye en gran medida a la capacidad de los mosquitos de la malaria para adaptarse rápidamente a los cambios en su entorno y explotar nichos diferentes 3,4,5. Para superar los actuales mecanismos de resistencia a los insecticidas, la exploración de nuevos objetivos insecticidas y compuestos de la próxima generación se justifica. Un protocolo simple, paso a paso para determinar la eficacia de los insecticidas experimentales sobre las diversas etapas de la vida de la malaria mosquitoes mejorarían significativamente estos esfuerzos. Los estudios farmacológicos de efectos del fármaco sobre las líneas celulares y modelos animales han establecido el uso de fármacos epigenéticos como una herramienta útil para la modulación de la genética y la fisiología de las células y los organismos. Metilación del ADN y modificación de las histonas son dos mecanismos epigenéticos que afectan la expresión génica en los organismos multicelulares sin cambiar la secuencia de ADN subyacente 6. Las modificaciones post traduccionales como la metilación juegan un papel crucial en el mantenimiento de la integridad celular y la expresión génica, y pueden afectar a varios procesos fundamentales 7,8,9. Investigación en algunas especies de insectos han puesto de relieve la importancia de la epigenética en procesos que implican la ovogénesis y células madre de mantenimiento 10, así como la compensación de dosis 11. Sin embargo, están todavía por explorar esos aspectos en los vectores de enfermedades. El uso de un compuesto para modular este sistema en los mosquitos puede proporcionarnos enmonumentos en las nuevas vías de destino insecticida. 3-Deazaneplanocin A (DZNep) es un inhibidor de la metilación de la histona conocido, que impacto en diversos tipos de cánceres se han estudiado 12,13,14,15,16. DZNep es un fármaco soluble en agua estable epigenética que inhibe indirectamente la lisina de la histona metiltransferasa N (EZH2), un componente del complejo represivo polycomb 2 (PRC2) en células de mamífero. PRC2 juega un papel importante en la regulación del crecimiento de las células madre en los organismos multicelulares, y la metilación de la histona es un aspecto clave de la PRC2 mediada por silenciamiento génico. En ratones inmunodeprimidos, las células pre-tratadas con DZNep han demostrado ser menos tumorígena 17. Esta droga se está utilizado para el estudio de otras enfermedades, como la enfermedad de hígado graso no alcohólico, en el que está implicado EZH2 18. DZNep es un establecido S -adenosylhomocysteine ​​(SAH) inhibidor hidrolasa 19, 20. La inhibición de los resultados de SAH hidrolasa en unaacumulación de SAH y, a su vez, conduce a la inhibición de la actividad metiltransferasa mediante la limitación de los grupos de donantes de metilo disponibles. SAH es un derivado de aminoácido utilizado por muchos organismos, incluyendo los insectos, en sus vías metabólicas. Un estudio reciente ha demostrado que DZNep en dosis bajas pueden afectar la diapausa y retrasar el desarrollo de insectos 21. Aquí, un protocolo robusto para investigar los efectos de un compuesto soluble en agua en varias etapas de la vida de los mosquitos se desarrolla. Las tres partes de este protocolo incluyen instrucciones para examinar los efectos de un compuesto soluble en agua sobre los mosquitos inmaduros, adultos hembras se alimentan de sangre, y la actividad enzimática de adulto de sexo masculino y los mosquitos hembra. En primer lugar, DZNep se disuelve en agua para estudiar el desarrollo de mosquitos inmaduros y la supervivencia. Esto se realiza a dos concentraciones para comparar las diferencias que surjan de aumento de 10 veces en la exposición al fármaco. Para explorar el efecto de las drogas en adultos hembras de los mosquitos, DZNepse añade a sangre de oveja desfibrilación y alimentados artificialmente la sangre a las hembras. Posteriormente, se examina el resultado de la droga sobre la fecundidad. Finalmente, un ensayo de actividad enzimática se realiza usando 5,5&#39;-ditiobis- (ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB) como un indicador para determinar el efecto de DZNep en la inhibición de hidrolasa SAH en machos adultos y hembras de los mosquitos. Mientras que este protocolo se desarrolla con un mosquito de la malaria, Anopheles gambiae, puede ser fácilmente adaptado al estudio de los efectos de los compuestos de interés en cualquier especie de mosquito u otros insectos. Las técnicas que se detallan en este protocolo no se pueden aplicar de manera eficiente a un fármaco con poca o ninguna solubilidad en agua o medios acuosos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="668">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Name of the Reagent/Equipment&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:192px;">Company</td>
			<td style="width:133px;">Catalgue Number</td>
			<td style="width:125px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well microplate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture plate</td>
			<td>CytoOne</td>
			<td>CC7682-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Sorvall Fresco</td>
			<td>76003758</td>
			<td>A different centrifuge can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colored tape rolls</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S68134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DTNB</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DZNep.HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SMLO305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Egg dish cups</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter papers</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-795E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass feeders</td>
			<td>Virginia Tech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass tissue homogenizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heating element</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">NC0520091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td>Percival scientific</td>
			<td>I36VLC8</td>
			<td>A different incubator can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge tube, &#160;2 ml</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>22-283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge tube, 1.5 ml</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4910 000.069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M-3154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M-8643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pH meter&#160;</td>
			<td>Mettler Toledo 7easy</td>
			<td>S20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate reader</td>
			<td>Spectramax</td>
			<td>M2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SAH</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9384</td>
			<td>store at -20C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

toxicological assays for testing effects of an epigenetic drug on development, fecundity and survivorship of malaria mosquitoes

Resistencia insecticida plantea un problema importante para los programas de control de la malaria. Los mosquitos se adaptan a una amplia gama de cambios en el entorno rápidamente, haciendo la malaria controlar un problema omnipresente en los países tropicales. La aparición de poblaciones resistentes a los insecticidas garantiza la exploración de nuevas vías objetivo de drogas y compuestos para el control del mosquito vector. Fármacos epigenéticos están bien establecidos en la investigación del cáncer, sin embargo, no se sabe mucho acerca de sus efectos sobre los insectos. Este estudio proporciona un protocolo sencillo para el examen de los efectos toxicológicos de 3-Deazaneplanocin A (DZNep), un fármaco epigenético experimental para el tratamiento del cáncer, en el vector de la malaria, Anopheles gambiae. Se observó un aumento dependiente de la concentración de la mortalidad y disminución en el tamaño en los mosquitos inmaduros expuestos a DZNep, mientras que el compuesto reduce la fecundidad de mosquitos adultos en relación con los tratamientos de control. Además, hubo una disminución dependiente de la droga en S -adenosilhomocisteına (SAH) la actividad hidrolasa en los mosquitos tras la exposición a DZNep en relación con los tratamientos de control. Estos protocolos proporcionan al investigador un procedimiento simple, paso a paso para evaluar varios puntos finales toxicológicos para una droga experimental y, a su vez, demuestran un enfoque único multi-conductor se utiliza para explorar los efectos toxicológicos de drogas o compuestos de epigenéticos solubles en agua intereses contra los mosquitos vectores y otros insectos.

La Figura 1 es una representación esquemática de los ensayos; que describe las diversas etapas del procedimiento indicado en este artículo. A medida que el protocolo se basa en diferentes etapas de la vida de los mosquitos, no hay una secuencia particular que deba seguirse para los experimentos se detallan aquí. El usuario puede elegir para llevar a cabo uno o más ensayos al mismo tiempo, dependiendo de la disponibilidad de la muestra. La figura 2</strong...

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Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition.

Los ensayos toxicológicos para efectos de prueba de un epigenética de Drogas sobre el Desarrollo, Fecundidad y Sobrevivencia de los mosquitos de malaria

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making ...

toxicological-assays-for-testing-effects-an-epigenetic-drug-on

Research

JoVE Journal

Biology

8.4K vistas.  Virginia Tech. A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition. 

Video: Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This video protocol demonstrates a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles stephensi embryos for the generation of transformed mosquitoes. Techniques for preparing microinjection needles, collecting and preparing embryos and performing the microinjection are illustrated.

Anopheles stephensi mosquitoes are vectors for malaria inhabiting India and throughout Asia. This video demonstrates the technique for performing microinjections of this species with transgenes that will confer resistance to the malaria to the mosquito. Much of the methodology demonstrated in this video is applicable to microinjection techniques of other mosquito species.

La inyección de una. Los embriones stephensi para generar la malaria resistente a los mosquitos

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This ...

Investigación

Biología

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of the virus in the mosquito tissues. This protocol is routinely used for studying mosquito-virus interactions, especially for identification of novel host factors that are able to determine vector competence. The entire experiment must be conducted in a BSL2 laboratory. Similar to Plasmodium falciparum infections, proper attire including gloves and lab coat must be worn at all times. After the experiment, all the materials that came in contact with the virus need to be treated with 75% ethanol and bleached before proceeding with normal washing. All other materials need to be autoclaved before discarding them.

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for the dengue virus, it must be evaluated for it's role in preventing viral infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of dengue infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for growing up the virus in culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Protocolo para las infecciones de dengue en mosquitos (Aedes aegypti) y determinación de fenotipo infección

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Protocol for Plasmodium falciparum Infections in Mosquitoes and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for malaria, it must be evaluated for its role in preventing Plasmodium infections within the mosquito.    This protocol illustrates how the extent of plasmodium infections of mosquitoes can be assayed.  The techniques for preparing the gametocyte culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Once a gene is identified as potentially refractory for malaria, it must be evaluated for its role in preventing Plasmodium infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of plasmodium infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for preparing the gametocyte culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Protocolo de infecciones por Plasmodium falciparum en la determinación de fenotipo mosquitos y la infección

Once a gene is identified as potentially refractory for malaria, it must be evaluated for its role in preventing Plasmodium infections within the ...

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite.  The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite. The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocolo para ensayos de RNAi en mosquitos adultos (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Preventing the Spread of Malaria and Dengue Fever Using Genetically Modified Mosquitoes

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population replacement strategy, the idea that transgenic mosquitoes can be released into the wild to control disease transmission, is introduced, as well as the concept of genetic drive and the design criterion for an effective genetic drive system. The ethical considerations of releasing genetically-modified organisms into the wild are also discussed.

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission. Population replacement strategy, the idea that transgenic mosquitoes can be released into the wild to control disease transmission, is introduced as well as the concept of genetic drive and the design criterion for an effective genetic drive system. The ethical considerations of releasing genetically-modified organisms into the wild are also discussed.

Cómo prevenir la propagación de la malaria y el dengue Con mosquitos genéticamente modificados

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population ...

Building a Better Mosquito: Identifying the Genes Enabling Malaria and Dengue Fever Resistance in A. gambiae and A. aegypti Mosquitoes

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus infections.   Explanation is given for how key refractory genes, those genes conferring resistance to vector pathogens, are identified in the mosquito and how this knowledge can be used to generate transgenic mosquitoes that are unable to carry the malaria parasite or dengue virus.

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus infections. Explanation is given for how key refractory genes, those genes conferring resistance to vector pathogens, are identified in the mosquito and how this knowledge can be used to generate transgenic mosquitoes that are unable to carry the malaria parasite or dengue virus.

La construcción de un mosquito mejor: La identificación de los genes que permiten resistencia a la malaria y el dengue en A. gambiae y A. aegypti

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus ...

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase (COX/SDH) Double-labeling Histochemistry

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of aging suggests a role for mtDNA mutations, which can alter bioenergetics homeostasis and cellular function, in the aging process 3. A wealth of evidence has been compiled in support of this theory 1,4, an example being the mtDNA mutator mouse 5; however, the precise role of mtDNA damage in aging is not entirely understood 6,7.
Observing the activity of respiratory enzymes is a straightforward approach for investigating mitochondrial dysfunction. Complex IV, or cytochrome c oxidase (COX), is essential for mitochondrial function. The catalytic subunits of COX are encoded by mtDNA and are essential for assembly of the complex (Figure 1). Thus, proper synthesis and function are largely based on mtDNA integrity 2. Although other respiratory complexes could be investigated, Complexes IV and II are the most amenable to histochemical examination 8,9. Complex II, or succinate dehydrogenase (SDH), is entirely encoded by nuclear DNA (Figure 1), and its activity is typically not affected by impaired mtDNA, although an increase might indicate mitochondrial biogenesis 10-12. The impaired mtDNA observed in mitochondrial diseases, aging, and age-related diseases often leads to the presence of cells with low or absent COX activity 2,12-14. Although COX and SDH activities can be investigated individually, the sequential double-labeling method 15,16 has proved to be advantageous in locating cells with mitochondrial dysfunction 12,17-21.
Many of the optimal constitutions of the assay have been determined, such as substrate concentration, electron acceptors/donors, intermediate electron carriers, influence of pH, and reaction time 9,22,23. 3,3'-diaminobenzidine (DAB) is an effective and reliable electron donor 22. In cells with functioning COX, the brown indamine polymer product will localize in mitochondrial cristae and saturate cells 22. Those cells with dysfunctional COX will therefore not be saturated by the DAB product, allowing for the visualization of SDH activity by reduction of nitroblue tetrazolium (NBT), an electron acceptor, to a blue formazan end product 9,24. Cytochrome c and sodium succinate substrates are added to normalize endogenous levels between control and diseased/mutant tissues 9. Catalase is added as a precaution to avoid possible contaminating reactions from peroxidase activity 9,22. Phenazine methosulfate (PMS), an intermediate electron carrier, is used in conjunction with sodium azide, a respiratory chain inhibitor, to increase the formation of the final reaction products 9,25. Despite this information, some critical details affecting the result of this seemly straightforward assay, in addition to specificity controls and advances in the technique, have not yet been presented.

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase COX/SDH Double-labeling Histochemistry

The cytochrome c oxidase/sodium dehydrogenase (COX/SDH) double-labeling method allows for direct visualization of mitochondrial respiratory enzyme deficiencies in fresh-frozen tissue sections. This is a straightforward histochemical technique and is useful in investigating mitochondrial diseases, aging, and aging-related disorders.

La visualización de la función respiratoria mitocondrial utilizando citocromo C Oxidasa / Succinato Deshidrogenasa (COX / SDH) de doble etiquetado Histoquímica

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

Generación de Myospheres De hESCs por epigenética Reprogramación

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, several traits are typically characterized using molecular assays to aid in epidemiological studies. These traits include species identification, insecticide resistance, parasite infection status, and host preference. Since populations of the Anopheles gambiae complex are morphologically indistinguishable, a polymerase chain reaction (PCR) is traditionally used to identify species. Once the species is known, several downstream assays are routinely performed to elucidate further characteristics. For instance, mutations known as KDR in a para gene confer resistance against DDT and pyrethroid insecticides. Additionally, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) or Plasmodium parasite DNA detection PCR assays are used to detect parasites present in mosquito tissues. Lastly, a combination of PCR and restriction enzyme digests can be used to elucidate host preference (e.g., human vs. animal blood) by screening the mosquito bloodmeal for host-specific DNA. We have developed a multi-detection assay (MDA) that combines all of the aforementioned assays into a single multiplex reaction genotyping 33SNPs for 96 or 384 samples at a time. Because the MDA includes multiple markers for species, Plasmodium detection, and host blood identification, the likelihood of generating false positives or negatives is greatly reduced from previous assays that include only one marker per trait. This robust and simple assay can detect these key mosquito traits cost-effectively and in a fraction of the time of existing assays.

Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

Un ensayo multi-detección para los mosquitos transmisores de la malaria

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such as Zika, dengue and malaria. Assays for rapid, high-throughput analyses of unformulated novel chemistries against mosquito larvae and adults are presented. We describe protocols for single point-dose and dose response assays to evaluate the toxicity of small molecule chemistries to the Aedes aegypti vector of Zika, dengue and yellow fever,&#160;the malaria vector, Anopheles gambiae and the northern house mosquito, Culex quinquefasciatus, on contact and via ingestion. As an example, we evaluated the toxicity of amitriptyline, a small molecule antagonist of G protein-coupled receptors, via larval, adult topical and adult blood-feeding assay. The protocols provide a starting point to investigate insecticide potential. Results are discussed in the context of additional experiments to explore product applications and mechanisms for delivery.

Protocols are described for assessing the toxicity of chemistries to immature and adult mosquitoes for development as new classes of larvicides, adulticides and endectocides. The protocols enable high-throughput testing of multiple chemistries at single-point dose and subsequent evaluation via dose response assay to determine toxicity on contact or via ingestion.

Protocolos para las pruebas de la toxicidad de la novela química insecticida para mosquitos

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...