El protocolo nos permite detectar el efecto del tratamiento sobre la susceptibilidad a la malaria de los vectores africanos de la malaria. Por ejemplo, compuestos destinados a bloquear la transmisión del humano al mosquito. Esta técnica permite a los investigadores evaluar un gran número de compuestos en condiciones de laboratorio, incluso antes de que los GATEs de toxicidad estén disponibles.
Las disecciones del intestino medio pueden ser desafiantes al principio, pero solo se necesita algo de práctica. Además, poder identificar ooquistes no siempre es fácil. Primero, usando un aspirador bucal, coloque 25 mosquitos hembra Anopheles gambiae no alimentados en una taza de alimentación de 350 mililitros.
Etiquete las copas claramente para distinguir entre los grupos de control y tratamiento. Elija el número de tazas por tratamiento de acuerdo con el número de réplicas técnicas incluidas. Conecte el sistema de alimentación de vidrio a un baño de agua y mantenga la temperatura a 37 grados centígrados.
Luego, prepare el intestino de vaca o la membrana sintética enjuagándolo con agua del grifo y cortándolo en trozos que se ajustan para cada alimentador. Cubra la parte inferior de cada alimentador y sujete la membrana con una banda elástica. Para usar las tazas de alimentación como copas de infección, primero, mantenga la membrana encima de las redes de las tazas.
Luego coloque las tazas de infección debajo de los comederos. Ahora, agregue un mililitro de sangre infectada con gametocitos a los comederos de las tazas de control, y sangre infectada con gametocitos con un compuesto de prueba a los comederos de las tazas de tratamiento. Luego deje que los mosquitos se alimenten durante unos 40 minutos.
Después de la alimentación, retire los comederos de las tazas, enjuague los comederos y trate el exceso de sangre con hipoclorito. Luego, derribe todos los mosquitos en el hielo durante uno o dos minutos, y seleccione los mosquitos que han tomado una comida de sangre buscando abdómenes hinchados y rojos. Reemplace el agua azucarada que se administra en días alternos a cada taza de infección con una almohadilla de agua con azúcar al 10% e incube las tazas de infección en una cámara de bioseguridad durante ocho a 10 días.
De ocho a 10 días después de alimentarse, derribe a los mosquitos infectados colocándolos en hielo. Luego, transfiéralos a tubos marcados con etanol al 70%, manteniendo el control en cada grupo de tratamiento en tubos separados. Manteniendo separados los grupos de control y de prueba, transfiera los mosquitos a placas de Petri etiquetadas forradas con papel de filtro.
Agregue una gota de PBS en un portaobjetos de vidrio debidamente marcado y transfiera un mosquito del papel de filtro a la gota. Fijar el tórax del mosquito con una aguja de disección. Luego, retire el intestino medio tirando del séptimo segmento abdominal con fórceps y transfiéralo a una gota de mercurocromo al 0,1% en un nuevo portaobjetos de microscopio.
Deje que el intestino se manche durante ocho a 10 minutos. Luego coloque un resbalón de cubierta en la tripa manchada y véalo bajo una iluminación de campo brillante con un aumento de 20 a 40 veces. Registre el número de ooquistes por intestino medio para el control y cada grupo de tratamiento.
En este estudio, se encontró que el compuesto MMV1581558 restringe significativamente el número de ooquistes de Plasmodium falciparum en el intestino medio de mosquitos hembra Anopheles gambiae en comparación con el control. En el grupo control, la prevalencia promedio de ooquistes en el intestino medio fue del 89% con una intensidad promedio de 9,5 ooquistes por intestino medio. Pero en el grupo tratado con MMV1581558, la prevalencia promedio de ooquistes fue del 36% con una intensidad promedio de solo 1.5 ooquistes por intestino medio.
Por lo tanto, el tratamiento con MMV1581558 resultó en una actividad de bloqueo de transmisión del 58% y una actividad reductora de transmisión del 82% en las tres réplicas biológicas. Es fundamental garantizar que los mosquitos se alimenten de un cultivo saludable de gametocitos. Si estos son gametocitos inmaduros, o no gametocitos en etapa cinco, la probabilidad de contraer una infección en el mosquito es limitada o imposible.
El ensayo utiliza un método de identificación morfológica visual, sin embargo, se pueden utilizar ensayos de cuantificación molecular. Sin embargo, esto es más costoso y podría limitar su uso en laboratorios con recursos limitados. Tener la capacidad de hacer esta técnica abre nuevas vías para evaluar el cambio de prevalencia e intensidad de la malaria entre casi cualquier cosa en mosquito.
Por ejemplo, comparando la capacidad vectorial de las especies.
