We would like to thank FMC BioPolymer USA for product samples of Avicel. This work was supported through the Defense Threat Reduction Agency grant HDTRA1-13-1-0005 to KK and the NIH research grant 1R15AI100001-01A1to KK.

1. Preparación de Células y Reactivos <ol><li> El día antes del ensayo, la placa de células huésped apropiadas para el virus en cuestión (Tabla 1 y 2) a 90 - 100% de confluencia. </li><li> Preparar la solución de fijación de formaldehído al 10% en dH 2 O. En el ejemplo, la mezcla 5,56 ml de 36% de la formaldehído con 14,44 ml de H 2 O destilada (dH2O). NOTA: Use las prácticas de manejo seguro apropiado y ventilación cuando se utiliza formaldehído. </li><li> Preparar mancha cristal violeta: 1% de cristal violeta (CV) en etanol al 20% y DH 2 O. </li><li> Preparar los medios de comunicación de la placa 2x (tipo celular dependiente a la concentración 2x; véase la Tabla 2). Filtrar sobre un filtro de 0,2 micras si cualquier reactivo no son estériles. </li><li> Preparación de las placas de inmovilización (Tabla 3) <ol><li> Para superposiciones de líquidos, hacer una solución de 2,4% estéril de Avicel en dH 2 O. Para evitar la formación de grumos, añadir el polvo a un matraz que contiene agua ªen que se mezcla rápidamente con una barra de agitación, se vierte lentamente en Avicel y revolver rápidamente a temperatura ambiente (TA). Cuando la solución resulta demasiado viscoso para una barra de agitación para homogeneizar, cambiar a un agitador de matraces para&gt; 30 min con agitación fuerte para asegurar una homogeneización. NOTA: Las soluciones madre se pueden hacer a concentraciones más bajas, pero las soluciones pueden separar y tendrán que ser remezclado para asegurar la homogeneización. Las soluciones de trabajo de Avicel pueden utilizarse van desde 0,6 hasta 3%. </li><li> Después de la homogeneización, autoclave la solución y tienda sellada a temperatura ambiente. </li><li> Para agarosa y carboximetilcelulosa (CMC) superposiciones, preparar una solución de reserva en dH 2 O de 2% de CMC o agarosa al 0,6%. Mezclar con una barra de agitación y autoclave o microondas para poner en solución. </li></ol></li></ol> 2. Las diluciones e Infecciones <ol><li> El día después de la siembra, compruebe visualmente la confluencia y la viabilidad de las células antes de comenzar el ensayo. Asegurar un estándar celular morfologíaencontrar una monocapa confluente ~ 90% está presente. </li><li> Realizar una dilución en serie de diez veces de las muestras infecciosas. Utilice el medio de crecimiento celular para la propagación viral como el diluyente (Tabla 2). Variar el número de diluciones requeridas basado en el título esperado del virus en cuestión, y siempre utilizar una muestra de control no infectado para asegurar de forma independiente la viabilidad celular y ayuda en la identificación de la placa. </li><li> De las diluciones en serie, infectar las células durante 45 min a 1 h (Tabla 1). Utilice un volumen suficiente de inóculo para cubrir las células, mientras que manteniendo el volumen lo más bajo posible para maximizar el contacto con la monocapa viral (Tabla 4). Placas de roca suavemente cada 20 minutos para asegurar una cobertura uniforme y evitar la monocapa celular se seque. </li><li> Después de la infección, superponer un volumen apropiado de medio de inmovilización directamente a los inóculos en el pozo (Tabla 2) usando una mezcla 1: 1 de los medios de placa 2x y la immobilizing superposición de elección (CMC, agarosa o Avicel). Agite suavemente para mezclar. <ol><li> Para superposiciones de líquidos, mezclar 1: 1 con los medios de placa 2x calentado y 1.2 a 2.4% de RT Stock Avicel para obtener una solución de trabajo de 0,6 a 1,2% de medio de superposición Avicel. </li><li> Para una capa de agarosa, utilice una mezcla 1: 1 de los medios de placa 2x calentado y una solución madre de 0,6% de agarosa climatizada, lugar en un baño de agua 56 ° C durante 30 min para equilibrar la temperatura de la obtención de una concentración de agarosa / superposición final de 0,3 %. </li><li> Para CMC, preparar una solución de 2% y el tratamiento que el descrito para la capa de agarosa. </li><li> Cuando se aplica el recubrimiento a la monocapa, siempre equilibrar agarosa caliente o CMC en un 56 ° C el agua para evitar daños a la monocapa. Asegúrese de que la solución es cálido, pero no caliente al tacto para evitar la muerte de las células y los títulos virales reducidos. La mayoría de las superposiciones de agarosa comenzarán a solidificarse por debajo de 42 ° C, trabajar de forma rápida y / o preparar pequeños lotes para evitar la solidificación durante la manipulación. </li></ol></li><li> Después de la adición de la superposición, incubar las placas para producir placas distintas que son claramente contable. La formación de placas puede tomar 2-14 días dependiendo del virus que se analizaron, la Tabla 1. NOTA: Una vez que las placas superpuestas líquidos se colocan en la incubadora, no moverlos. Movimiento de las superposiciones de líquidos durante el período de incubación se traducirá en placas untadas. Agarosa y CMC superposiciones son semisólido y se pueden mover o revisados ​​periódicamente bajo un microscopio de luz para controlar el desarrollo de la placa. </li></ol> 3. Fijación y tinción de las células <ol><li> Para fijar las células, verter o aspirar la superposición Avicel, y fijar las células utilizando la solución de formaldehído al 10% durante 30 min a durante la noche (&lt;1 ml por pocillo de una placa de 6 pocillos). <ol><li> Para agarosa o CMC, añadir directamente la solución de formaldehído a la superposición durante 1 hora a toda la noche. NOTA: Las muestras pueden mantenerse durante largos períodos de tiempo en el fijador siempre lo haceno se evapore y seque ya que esto puede distorsionar la monocapa. </li></ol></li><li> Antes de la tinción y después de la fijación, deseche el formaldehído y quitar los tapones semisólidos para la agarosa y CMC, ya sea con agua corriente o manualmente con una espátula. Enjuague Avicel placas con agua para eliminar residual superposición / fijador antes de la tinción. </li><li> Para la tinción, cubrir las células con una cantidad mínima de solución de cristal violeta durante ~ 15 min. Placas de roca si es necesario para asegurar una cobertura uniforme. </li><li> Lavar suavemente la mancha violeta cristal con agua. Una vez fijado, manchado, y se seca, almacenar las placas de forma indefinida para futuros análisis. </li></ol> 4. Determinación de títulos virales <ol><li> Cuente las placas en cada pocillo, tomando el promedio de los técnicos repeticiones de la misma dilución. Para los grandes formatos de placas, pozos de descuento con menos de 5 o mayor de 100 placas. Tome nota del tamaño de la placa y la morfología. El control negativo debe tener una monocapa uniforme yse puede utilizar como un control de referencia. </li><li> Determinar el título viral de la muestra de stock de tomar el número medio de placas para una dilución y la inversa del factor de dilución total. </li></ol><img alt="Ecuación 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52065/52065eq1.jpg" width="300" /> NOTA: Como un ejemplo, 30 y 32 placas contada por repeticiones de la 1 x 10 -7 dilución [31 (promedio) / 10 -7 (dilución) x 0,4 ml (inóculo)] produciría un título de 7,75 x 10 8 pfu / ml.

<ol>
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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+the+Filovirus+Plaque+Assay+for+Use+in+Preclinical+Studies.">Standardization of the Filovirus Plaque Assay for Use in Preclinical Studies.</a> Viruses. 4, 3511-3530 (2012).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays.">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virol. J. 3, 63 (2006).</li><li>Klebe, R. J., Harriss, J. 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Chem. 287, 7399-7410 (2012).</li><li>Austin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+Activation+following+Rift+Valley+Fever+Virus+Infection+Contributes+to+Cell+Death+and+Viral+Production.">p53 Activation following Rift Valley Fever Virus Infection Contributes to Cell Death and Viral Production.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>B&#246;ttcher-Friebertsh&#228;user, E., Stein, D. A., Klenk, H. -. D., Garten, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+influenza+virus+infection+in+human+airway+cell+cultures+by+an+antisense+peptide-conjugated+morpholino+oligomer+targeting+the+hemagglutinin-activating+protease+TMPRSS2.">Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2.</a> J. Virol. 85, 1554-1562 (2011).</li><li>Youil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+influenza+virus+replication+in+Vero+and+MDCK+cell+lines.">Comparative study of influenza virus replication in Vero and MDCK cell lines.</a> J. Virol. Methods. 120, 23-31 (2004).</li><li>Tobita, K., Sugiura, A., Enomoto, C., Furuyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plaque+assay+and+primary+isolation+of+influenza+a+viruses+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells+(MDCK)+in+the+presence+of+trypsin.">Plaque assay and primary isolation of influenza a viruses in an established line of canine kidney cells (MDCK) in the presence of trypsin.</a> Med. Microbiol. Immunol. (Berl.). 162, 9-14 (1975).</li></ol>

The authors have nothing to disclose and no competing or financial interests in the protocol or products described.

El factor más crítico para el éxito de un ensayo de placa se encuentra en la optimización del protocolo para el cultivo viral particular en cuestión ya que las condiciones pueden variar significativamente. Los puntos clave a tener en cuenta son: la sede de la compatibilidad celular con el virus en cuestión, las condiciones de crecimiento viral apropiados, los rangos de dilución suficiente con el fin de diferenciar claramente las placas, y la selección de superposición correcta y tinción de las células y de virus en cuestión. Mientras VEEV y RVFV tanto crecen bajo condiciones muy similares que utilizan muchos de los mismos tipos de células huésped, las diferencias en la morfología y cinética de crecimiento de placa varían significativamente. Cuando se utilizan células Vero para los ensayos de placa, que se han utilizado tradicionalmente como una línea celular de propagación y el indicador de virus y alfavirus fiebre hemorrágica, VEEV normalmente crece hasta títulos más altos que RVFV y demuestra el aumento de la cinética de replicación, el desarrollo de grandes placas uniformes a 48 hpi 4, 10-12. En contraste con VEEV, RVFV requiere 72 hpi y demuestra placas que son típicamente mucho más pequeño y de tamaño variable. En oposición a RVFV y VEEV, el virus de la gripe es altamente específica de la célula huésped y puede ser difícil para propagarse a través de cultivo de tejidos. Para el virus de la influenza, la entrada viral y fusión normalmente se inicia por la unión del receptor de la superficie celular con la hamagglutinin glicoproteína viral (HA), que media la entrada en la célula diana mediante la unión con el receptor de superficie de ácido α-siálico de la célula huésped. HA es una glicoproteína trimérico que está presente en la envoltura de la membrana de todos los virus de la gripe y requiere la escisión en el HA1 y HA2 subunidades por una proteasa específica de la célula huésped. Para complicar aún más el asunto, estos sitios de escisión a menudo pueden variar entre cepas virales 13. Como la expresión de proteasas capaces de escindir HA está restringida a tejidos específicos, proteasas are menudo añadido a medios de cultivo celular con el fin de facilitar la fusión viral y la entrada en la célula huésped seleccionada 13. TPCK-tripsina es un ejemplo de una proteasa de uso común que se utiliza en el cultivo de células MDCK tanto con y células Vero: facilitar la replicación multi-ciclo (en ausencia de cualquier suero inactivar la tripsina) a través de la activación proteolítica de HA viral 14,15. Como se demuestra en este estudio y otros, las diferencias en los ciclos de vida virales pueden influir en las selecciones de superposición, los formatos de placas, y los tiempos de recogida, con variaciones significativas entre diferentes clases y especies de virus. En nuestro estudio, las superposiciones de agarosa demostraron placas más claras en los títulos más altos que cualquiera de CMC o superposiciones de líquidos, tanto para RVFV y el virus de la influenza B, reforzando su utilidad entre una amplia gama de virus y tipos de células. Usando una concentración final de agarosa de bajo gran medida con la ayuda en la eliminación de los tapones sólidos y tinción simplificado. CMC demostró en general la peficacia oorest como una superposición de los tres virus probadas y producidas placas muy pequeñas y poco definidos para el virus de la influenza B. Aunque en general CMC demostró las características menos deseables, su uso en rápido crecimiento y extremadamente virulentas de virus podrían resultar ventajoso, como lo hizo parece reducir tamaño de la placa con sólo una mínima disminución en el título. La superposición líquido resultó ser el más versátil en que era extremadamente sencillo de preparar, mayor facilidad de uso, y fue comparable a agarosa a través de todos los virus seleccionados. En un formato de placa de un mayor rendimiento de 96 pocillos, aplicación y eliminación no fue inhibida debido a la solidificación como con revestimientos tradicionales, y proporcionado resultados precisos y consistentes. Una consideración cuando se utiliza superposiciones líquidos se encuentra en la coloración opaca y la incapacidad para controlar la formación de placa como las placas no se pueden mover hasta el punto de recogida, limitando esta adaptación a los virus con cinética de replicación previamente caracterizadas. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Pequeñas modificaciones en las condiciones de ensayo de placa pueden alterar significativamente los resultados, y la evaluación y el rendimiento de cualquier nuevo sistema o técnica está siempre garantizado. Mientras que un protocolo de ensayo de placa optimizada y estandarizada no existe para cada situación, nuestro informe demuestra la versatilidad y facilidad de uso en el tradicional, así como nuevos recubrimientos líquidos para ensayos de placa, mientras que proporciona un fondo suficiente para otras modificaciones de usuario.

El aislamiento y la cuantificación exacta de las muestras virales viables ha sido siempre un objetivo de la investigación en curso en virología. No fue sino hasta el advenimiento de la placa de ensayo en 1952 que un medio para calcular cuantitativamente y cualitativamente los títulos virales de los animales fue desarrollado por primera vez 1,2. Esta técnica se ha adaptado y modificado a partir de ensayos de fagos, que previamente habían sido utilizados para calcular los títulos de los bacteriófagos de valores en biología vegetal 1,2 en primer lugar. Mientras que medios alternativos para la cuantificación viral Desde entonces se han desarrollado y adaptado, tales como inmunoensayos, fluorescencia y microscopía electrónica de transmisión, la detección de impulsos resistiva sintonizable (TRPS), citometría de flujo, sistemas indicadores recombinantes, y reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (QRT-PCR) , estos métodos no logran identificar y cuantificar de replicación de viriones competentes 1,3. Si bien los avances en las tecnologías y técnicas continúan refinando y alterar el paisaje; handensayos e siguen representando el estándar de oro en la determinación de las concentraciones virales de viriones infecciosos líticas 1,4. Durante un ensayo de placa, una monocapa confluente de células huésped está infectado con un virus lítico de una concentración desconocida que se ha diluido en serie a una gama contable, típicamente entre 5-100 viriones. Las monocapas infectadas se cubren con un medio de recubrimiento de inmovilización para prevenir la infección viral de forma indiscriminada difusión a través de ya sea el flujo de convección mecánica o del medio líquido durante la propagación viral. Mientras que se han utilizado tradicionalmente superposiciones sólidos o semisólidos tales como agarosa, celulosa de metilo o carboximetil celulosa (CMC), superposiciones de líquidos se han convertido en una alternativa cada vez más atractiva con el desarrollo de nuevos recubrimientos líquidos tales como Avicel 5- 7. Ensayos de placas que utilizan líquido frente superposiciones tradicionales tienen varias ventajas como la superposición puede ser aplied a temperatura ambiente, y la aplicación y la eliminación es mucho más fácil. Como superposiciones líquidos no requieren calentamiento, virus lábiles delicados y de calor también pueden resultar más fáciles de placa. Después de la infección inicial y la aplicación de la superposición de inmovilización, las placas individuales, o zonas de muerte celular, comenzará a desarrollar una infección viral y la replicación como se ven limitados a la monocapa circundante. Las células infectadas continuarán el ciclo de replicación-lisis-infección, propagación aún más la infección, lo que resulta en placas cada vez más distintas y discretas. Dependiendo de la cinética de crecimiento y célula huésped viral usado, una placa visible normalmente formar dentro de 2-14 días. Monocapas celulares pueden entonces ser contadas con un microscopio de campo claro estándar, o más típicamente fijos y counterstained por el rojo o cristal violenta neutral con el fin de identificar fácilmente las placas con el ojo desnudo. Hay una amplia variedad de manchas de contador de placa disponibles, cada uno con ésimoEIR ventajas y desventajas específicas. Violeta cristal se añade típicamente en el punto de recogida y después de la fijación / extracción de la superposición, proporcionando una mancha contador rápido y distinto que permite la identificación de placas muy pequeñas cuando morfología mixta está presente. El rojo neutro tiene la ventaja de la aplicación temprana y el contacto constante con la superposición, lo que permite el seguimiento en vivo de desarrollo de la formación de placa, que es particularmente útil cuando se trabaja con un desconocido cinética de virus o de replicación. Sin embargo, hemos encontrado que la tinción normalmente no es tan distinta cuando se utiliza rojo neutro. 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-tetrazolio bromuro de difenil (MTT) ofrece varias ventajas, como las manchas de tinte de color amarillo viven células placas azules oscuras y virales pueden contarse sin eliminación de la superposición como con rojo neutro. El alto contraste entre células vivas y muertas que ofrece el MTT también permite la detección de pequeñas placas en una infección punto anterior post tiempo, Aunque el almacenamiento seguiría exigiendo la eliminación de la superposición de 8. Como cristal violeta se puede simplemente hizo en una solución de agua y alcohol, y ofrece un alto grado de sensibilidad para la morfología de la placa mixta, hemos elegido como una mancha counter preferente y simplificado para el protocolo demostró como estamos utilizando varias familias de bien virus caracterizados. Después de la fijación y tinción de la monocapa celular infectada, las placas se cuentan en orden para titular muestras de valores virales en términos de unidades formadoras de placa (pfu) por mililitro. Una gota de registro debe señalar entre diluciones en serie y, dependiendo del tamaño de la placa, entre 5-100 placas contadas, con un control negativo utilizado como referencia. Muestras estadísticamente variarán en un 10% por cada 100 placas contadas al comparar la muestra replica 3. La ventaja de usar ensayos de placas para determinar los títulos virales reside en su capacidad para cuantificar el número real de partículas virales infecciosas wentro de la muestra. Como múltiples viriones podrían potencialmente infectar una sola célula, se utiliza la terminología de las unidades frente a viriones durante titulaciones de placa 1,2. Morfología de la placa puede variar enormemente en condiciones de crecimiento diferentes y entre las especies virales. Tamaño de la placa, la claridad, la definición de fronteras, y la distribución deben tenerse en cuenta todos, ya que pueden proporcionar información valiosa sobre los factores de crecimiento y virulencia del virus en cuestión. Principios ensayo de placa de base también se pueden adaptar y modificar en un número de maneras diferentes, tales como en el uso de ensayos de formación de enfoque (AGL). AGL no se basan en la lisis celular y la contratinción para detectar la formación de placa, sino más bien inmunotinción emplean técnicas para detectar directamente las proteínas virales intracelulares a través de anticuerpos etiquetados. Aumento de la sensibilidad, la disminución de los tiempos de incubación después de la infección, y lo más importante la capacidad para cuantificar los virus no lítico son todos distintosventajas cuando se emplean ácidos grasos libres. Aunque se usan ampliamente, los factores limitantes críticos en AGL frente a un ensayo de placa tradicional se encuentra en la necesidad de anticuerpos apropiados y la capacidad de sólo sonda para subunidades de proteínas virales frente a viriones infecciosos reales 4. A los efectos de este estudio, vamos a limitar nuestra discusión a ensayos de placas clásicos y describir el uso de superposiciones de sólidos y semisólidos tradicionales (agarosa y CMC), junto con superposiciones de celulosa microcristalina líquido novedosos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="692">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:127px;">Company</td>
			<td style="width:129px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">6-well CellStar plate for tissue culture</td>
			<td style="width:127px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:129px;">658 160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">12-well CellStar plate for tissue culture</td>
			<td style="width:127px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:129px;">665 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">96-well CellStar plate for tissue culture</td>
			<td style="width:127px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:129px;">655 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">96-2ml deep well plate</td>
			<td style="width:127px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:129px;">C15046314</td>
			<td>For serial dilutions</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">DMEM</td>
			<td style="width:127px;">Quality Biologicals</td>
			<td style="width:129px;">112 013 101</td>
			<td>Cell Media/Diluent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">2X EMEM for plaques</td>
			<td style="width:127px;">Quality Biologicals</td>
			<td style="width:129px;">115 073 101</td>
			<td>Warm to 37 oC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">MEM 100X&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Cellgro</td>
			<td style="width:129px;">25 025 Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Sodium Pyruvate&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Cellgro</td>
			<td style="width:129px;">25 000 Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:129px;">15140 122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:129px;">25030 081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:269px;">HyClone FBS&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:129px;">SH30910.03</td>
			<td>Heat inactivate before use at 62 oC for 30 min</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">A7030-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Trypsin TPCK</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">T1426-50mg</td>
			<td>Make aliquots/Avoid freeze thawing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">HEPES&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:129px;">15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">DEAE-Dextran</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">D9885-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Crystal Violet</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">C3886-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Formaldehyde Solution</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">F8775-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Ethanol denatured Reagent Grade</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td>362808-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Avicel RC-591 NF</td>
			<td style="width:127px;">FMC BioPolymer USA</td>
			<td style="width:129px;">RC-591 NF</td>
			<td>Shake vigorously when reconsitiuting&#160; for &#62;30 min to homogenize</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">UltraPure Agarose&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:129px;">16500-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">C4888</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems

Ensayos de placas siguen siendo uno de los métodos más precisos para la cuantificación directa de los viriones infecciosos y sustancias antivirales a través del conteo de placas discretas (unidades infecciosas y zonas muertas celulares) en el cultivo de células. Aquí se demuestra cómo realizar un ensayo de placa de base, y cómo superposiciones y técnicas diferentes pueden afectar la formación de placa y la producción. Típicamente sustratos de superposición sólidos o semisólidos, tales como agarosa o celulosa carboximetil, se han utilizado para restringir la propagación viral, prevención de la infección indiscriminada a través del medio de crecimiento líquido. Superposiciones inmovilizados restringen la infección celular para la monocapa que rodea inmediatamente, lo que permite la formación de focos contable discreto y formación de la placa posterior. Para superar las dificultades inherentes en el uso de recubrimientos tradicionales, una novela superposición de líquido que utiliza celulosa microcristalina y carboximetil celulosa de sodio se ha utilizado cada vez más como un sustituto en la normala placa de ensayo. Ensayos de placa de superposición líquidas se pueden realizar fácilmente en 6 o 12 formatos de placas, así como estándar por las técnicas tradicionales y no requieren equipo especial. Debido a su estado líquido y la posterior facilidad de aplicación y remoción, formatos de placas de microcultivo, alternativamente, se pueden utilizar como una rápida, precisa y de alta alternativa rendimiento para titulaciones virales de mayor escala. El uso de un polímero líquido viscoso climatizada no ofrece la oportunidad de racionalizar el trabajo, conserve los reactivos, espacio incubador, y aumenta la seguridad operativa cuando se utiliza en los laboratorios de contención tradicionales o altos como ningún calentamiento del reactivo o material de vidrio son obligatorios. Superposiciones líquidas también pueden ser más sensibles que los recubrimientos tradicionales para ciertos virus lábiles al calor.

La capacidad de los ensayos de placa de evaluar con precisión los títulos virales depende de numerosos factores: la selección de células huésped apropiado, medios y condiciones de crecimiento adecuadas para la viabilidad celular y viral, la propagación viral inmovilizado, y una determinación exacta del período de incubación viral para permitir un tiempo adecuado para distinta y la formación de placa contable. Para este estudio, se eligieron tres familias de virus representativos para demostrar diferencias en: la selección de superposición, períodos de incubación, y morfología de la placa a través de diferentes tipos de muestras. La encefalitis equina venezolana (VEEV) fue seleccionado como un modelo viral (+) ARN de cadena simple, que puede causar enfermedad significativa en las especies y seres humanos equinos y representa la familia Togaviridae. Influenza B cepa Taiwán, una segmentado (-) de virus ARN de cadena simple que infecta principalmente los seres humanos, representa a la familia Orthomyxoviridae. Valle del Rift virus de la fiebre (RVFV), a - virus de ARN de cadena simple artrópodo nacido infectando principalmente artrópodos, ()rumiantes y los seres humanos, fue seleccionado como representante de la familia Bunyaviridae. Para RVFV (Figura 1), los títulos se determinaron a partir de una solución madre de una cepa viva atenuada recombinante MP12 de RVFV en un formato de placa de 12 pocillos utilizando CMC, agarosa, o Avicel superposiciones que se incubaron de lado a lado para después de la infección 72 hr (HPI). Un plato representativo que muestra diluciones que van desde 10 -4-10 -7 se puede ver en el panel A. Las placas utilizando CMC y superposiciones de agarosa mostró placas pequeñas, claras y distintas, con un borde circular bien definida. Las placas con una capa de líquido fueron ligeramente más abundantes y de mayor tamaño en comparación con las placas de agarosa y CMC, y proporcionaron una frontera menos distintas. Los títulos virales se compararon en el Panel B con todas las superposiciones realizar comparable. Con el fin de obtener una comparación visual más clara entre las superposiciones de MP12, junto con un tamaño de muestra mayor para determinar reproduccibilidad, una placa de 6 pocillos también se probó por triplicado (Figura 2). En el formato de placa de 6 pocillos, el uso de una superposición de CMC mostró placas más pequeño que cualquiera superposiciones de agarosa o líquidos, que eran comparables en tamaño a la otra. Mientras que los títulos virales fueron similares entre los tres superposiciones (Panel D), placas formadas en las capas de agarosa y líquidos resultaron más fáciles de contar debido a su mayor tamaño. En contraste con RVFV, los títulos de VEEV y morfología de la placa entre las superposiciones de diferentes variaron notablemente (Figura 3A). Placas formadas en las capas de CMC demostraron una morfología clara y distinta cuando se utiliza un formato de placa de 12, a expensas de tamaño y sensibilidad de la placa (Panel B). En contraste con CMC, el uso de agarosa y líquidos superposiciones resultó en placas significativamente más grandes, lo que indica la inhibición viral más baja y aumento de la sensibilidad a la replicación VEEV. Esto fue confirmado previamente cuando se comparan exclusivamente agarosa frente a CMC en apaper publicado por Juárez et al. 4. Mientras agarosa y líquidos superposiciones producen placas más grandes que CMC, las placas habían bordes mal definidos y eran difíciles de contar en un formato de 12 pocillos, con superposiciones de líquidos que proporcionan la mayor difusión frontera. Cuando las placas se probaron en placas de 6 pocillos (Figura 4), ​​el más grande formato de 6 pocillos negada la cuestión de la abiertamente grandes placas que eran difíciles de diferenciar en el formato de 12 pocillos, con agarosa y superposiciones de líquidos que demuestren superior a las superposiciones de CMC en términos de definición placa y sensibilidad (Figura 4D). En comparación con RVFV o VEEV, influenza proporciona varios desafíos únicos cuando formación de placas, tales como el requisito de una proteasa externa. La sensibilidad de los virus de la influenza a las diferentes selecciones de superposición también ha sido bien documentado en el pasado ya que se han observado cambios significativos cuando las modificaciones de menor importancia como como diferentes marcas de agarosa tienen seres usado 9. Es interesante para la cepa de la influenza B Taiwán, el uso de la CMC como una superposición dio lugar a placas notablemente más pequeños que eran difíciles de contar y resultaron difíciles de marcar de forma fiable (Figura 5A). El uso de una capa de agarosa proporcionó las mejores placas (Panel C), y resultó en una mancha de fondo más oscuro (probablemente debido a un aumento de la viabilidad monocapa), y mostró placas más claras y nítidas en comparación directa con el uso de la superposición de líquido (Panel B ). Una clara ventaja de polímeros líquidos más de superposiciones sólidas y semisólidas, tales como agarosa y CMC, se encuentra en la facilidad de eliminación y aplicación. Superposiciones semiduros requieren calefacción, y la solidificación puede ser problemático cuando la manipulación y eliminación. Con el fin de sacar provecho de estas ventajas y determinar la viabilidad de la utilización de Avicel en forma de alto rendimiento para RVFV, un formato de placa de 96 pocillos se probó en diferentes concentrati superposicióncomplementos (Figura 6). Para RVFV MP-12, las diluciones se realizaron por cuadruplicado en ambos 0,6 y 1,2% concentraciones finales de Avicel. Aplicación de superposición y la eliminación demostraron simple, sin diferencias aparentes entre repeticiones o entre las concentraciones observadas, lo que demuestra un alto grado de reproducibilidad. Al puntuar, las placas eran distintos y contable a simple vista, lo que demuestra la viabilidad de la utilización de superposiciones de líquidos en un alto rendimiento para RVFV manera. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6.5in" width="650" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig1highres.jpg" /> Figura 1: Placa RVFV comparaciones de superposición utilizando placas de 12 pocillos se sembraron a Veros 2,5 x 10 5 células en placas de 12 pocillos y se infectaron con 200 l usando la misma muestra de partida diluido en serie de MP12.. Después de la infección 1,5 ml superposiciones de agarosa al 0,3%, 0,6% Avicel, o 1% de CMC (c definitivaoncentrations), se aplicaron con el fin de comparar directamente las superposiciones como se ha demostrado en el Panel A. Las placas se contaron y se titularon en el Panel B. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig2highres.jpg" /> Figura 2: placa RVFV comparaciones de superposición utilizando placas de 6 pocillos Veros se sembraron a 5 x 10 5 células en placas de 6 pocillos y se infectaron con 400 l usando la misma muestra de partida diluido en serie de MP12.. Tres ml superposiciones de agarosa al 0,3%, 0,6% Avicel, o 1% de CMC, se aplicaron con el fin de comparar directamente las superposiciones como se demuestra en el Panel A, B, y C. experimentos separados se llevaron a cabo de forma idéntica como se describe para paneles de AC, con las placas se contaron y se titularon en el Panel D (N = 3). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig3highres.jpg" /> Figura 3: &lt;strong&gt; placa VEEV comparaciones de superposición utilizando placas de 12 pocillos se sembraron Veros. a 2,5 x 10 5 células en placas de 12 pocillos y se infectaron con 200 l utilizando la misma muestra diluido en serie a partir de la cepa de la vacuna VEEV TC-83. Después de la infección 1,5 ml superposiciones de agarosa al 0,3%, 0,6% Avicel, o 1% de CMC, se aplicaron con el fin de comparar directamente las superposiciones como se demuestra en el Panel A. Las placas se contaron y se titularon en el Panel B. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig4highres.jpg" /> Figura 4: V EEV comparaciones de superposición de la placa que utilizan placas de 6 pocillos Veros se sembraron a 5 x 10 5 células en placas de 6 pocillos y se infectaron con 400 l usando la misma muestra de partida diluido en serie de VEEV TC-83.. Después de la infección, 3 ml superposiciones de agarosa al 0,3%, 0,6% Avicel, o un 1% de CMC, se aplicaron con el fin de comparar directamente las superposiciones como se ha demostradoen los Paneles A, B y C. experimentos separados se llevaron a cabo de forma idéntica a la descrita para Paneles A - C, con placas contadas y tituladas en el Panel D (N = 3). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig5highres.jpg" /> Figura 5: INFLUENZA placa comparaciones de superposición de las células MDCK se sembraron a 5 x 10 5 células en placas de 6 pocillos y se infectaron con 400 l de inóculo utilizando la misma muestra de partida diluido en serie de Influenza B Taiwan.. No suero bovino fetal (FBS) se utilizó en el medio de crecimiento o superposiciones, como FBS puede inhibir la propagación de la influenza mediante la inhibición de ciertas proteasas que son necesarios para la fusión viral. TPCK-tripsina se añadió a todas las superposiciones antes de la aplicación con el fin de facilitar la fusión viral y la entrada con las células huésped. Después de la infección, 3 ml superposiciones de agarosa al 0,3%, 0,6% Avicel, o 1% de CMC se aplicaron con el fin de comparar directamentelas superposiciones como se demuestra en el Panel A, B y C. experimentos separados se llevaron a cabo de forma idéntica como se describe en los Paneles A - C, con placas contadas y tituladas en el Panel D (N = 3). Mientras que en promedio fue tomada por placas CMC que resultaron difíciles de contar de forma fiable, ya que demostraron fronteras difusas y tamaños muy pequeños de placa. <img alt="Figura 6" fo:content-width="6.5in" width="650" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig6highres.jpg" /> Figura 6:. Superposiciones de placa de alto rendimiento Una placa de 96 pocillos de Veros en placas a 3 x 10 4 células por pocillo, se infectaron con 50 l de inóculo utilizando la misma muestra de partida diluido en serie de RVFV MP12 durante 1 hora, por cuadruplicado. Para las superposiciones, 0,6 y 1,2% concentraciones finales de Avicel se probaron para determinar la viabilidad y reproducibilidad de la utilización de superposiciones de líquidos de una manera de alto rendimiento, paneles A y B. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Tipo de la célula </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Período de infección </td><td> 1 hora </td><td> 1 hora </td><td> 45 min </td></tr><tr><td> El tiempo de incubación </td><td> 3 días </td><td> 2 días </td><td> 3 días </td></tr></tbody></table> Tabla 1: La placa de ensayo de inoculación condiciones y tipos de células <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Tipo de la célula </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Tipo de crecimiento</td><td> DMEM 1 </td><td> DMEM 1 </td><td> DMEM 2 </td></tr><tr><td> Placa de Medios </td><td> Un 2xEMEM </td><td> Un 2xEMEM </td><td> 2xEMEM B </td></tr></tbody></table> 1. Medio de Eagle Modificado de Dulbecco suplementado con 10% suero bovino fetal, 1% de L-glutamina, 1% Penicllin / estreptomicina. 2. Medio de Eagle Modificado de Dulbecco suplementado con 1% de L-glutamina, 1% Penicllin / estreptomicina, 0,2% albúmina de suero bovino, HEPES 0,025%, DEAE-dextrano 50 ug / ml. A. 2x Medio Esencial Mínimo (500 ml) suplementado con FBS al 5% (25 ml), 1% Esencial Mínimo Amino Acids (5 ml), 1% de piruvato sódico (5 ml), 1% de L-glutamina (5 ml), 2% penicilina / estreptomicina (10 ml). B. 2x Medio Esencial Mínimo (500 ml) suplementado con 0,2% de albúmina de suero bovino, aminoácidos esenciales 1% mínimo (5 ml), 50 ug / ml, 0,025% HEPES, DEAE-dextrano, Tripsina-TPCK * * Justo antes de la preparación, añadir 1 l por cada 25ml de 2 mg / ml de tripsina-TPCK a la alícuota que va a utilizar para mezclar con agarosa para placas. Tabla 2: La placa y Viral / Celular Crecimiento Medios <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Tipo de la célula </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Período de infección </td><td> 1 hora </td><td> 1 hora </td><td> 45 min </td></tr><tr><td> El tiempo de incubación </td><td> 3 días </td><td> 2 días </td><td> 3 días </td></tr></tbody></table> Soluciones de superposición no expirarán cuando se hace siempre y cuando se mantenga la esterilidad. Tabla 3: Superposiciones Stock <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> 6 así </td><td> 12 así </td><td> 96 así </td></tr><tr><td> Nº de células / pocillo </td><td> 5 x 10 5 </td><td> 2,5 x 10 5 </td><td> 3 x 10 4 </td></tr><tr><td> Volumen de inóculo (l) </td><td> 400 </td><td> 200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> volumen de superposición (ml) </td><td> 3 </td><td> 1.5 </td><td> 0,100 </td></tr></tbody></table> Tabla 4: Formatos de placas

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Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Viral Concentración Determinación A través de placa Ensayos: El uso de tradicionales y novedosos sistemas de superposición

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

viral-concentration-determination-through-plaque-assays-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

110.1K vistas.  George Mason University. Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

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Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

El uso de un ensayo de microarrays Pan-viral (Virochip) a la pantalla de muestras clínicas de los patógenos virales

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Investigación

Inmunología e Infección

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

El análisis cuantitativo de todos Influenza Tipo A Hemaglutininas viral y neuraminidasas el uso de anticuerpos Universal en simples ensayos Slot Blot

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant limitations, viruses are more resistant to many inactivation processes and standard fecal indicators do not inform on the source of contamination. The development of cost-effective methods for the concentration of viruses from water and molecular assays facilitates the applicability of viruses as indicators of fecal contamination and as microbial source tracking (MST) tools. Adenoviruses and polyomaviruses are DNA viruses infecting specific vertebrate species including humans and are persistently excreted in feces and/or urine in all geographical areas studied. In previous studies, we suggested the quantification of human adenoviruses (HAdV) and JC polyomaviruses (JCPyV) by quantitative PCR (qPCR) as an index of human fecal contamination. Recently, we have developed qPCR assays for the specific quantification of porcine adenoviruses (PAdV) and bovine polyomaviruses (BPyV) as animal fecal markers of contamination with sensitivities of 1-10 genome copies per test tube. In this study, we present the procedure to be followed to identify the source of contamination in water samples using these tools. As example of representative results, analysis of viruses in ground water presenting high levels of nitrates is shown.
Detection of viruses in low or moderately polluted waters requires the concentration of the viruses from at least several liters of water into a much smaller volume, a procedure that usually includes two concentration steps in series. This somewhat cumbersome procedure and the variability observed in viral recoveries significantly hamper the simultaneous processing of a large number of water samples.
In order to eliminate the bottleneck caused by the two-step procedures we have applied a one-step protocol developed in previous studies and applicable to a diversity of water matrices. The procedure includes: acidification of ten-liter water samples, flocculation by skimmed milk, gravity sedimentation of the flocculated materials, collection of the precipitate and centrifugation, resuspension of the precipitate in 10 ml phosphate buffer. The viral concentrate is used for the extraction of viral nucleic acids and the specific adenoviruses and polyomaviruses of interest are quantified by qPCR. High number of samples may be simultaneously analyzed using this low-cost concentration method.
The procedure has been applied to the analysis of bathing waters, seawater and river water and in this study, we present results analyzing groundwater samples. This high-throughput quantitative method is reliable, straightforward, and cost-effective.

The study describes a cost-effective method for the identification of the source of fecal/urine contamination or contamination by nitrates in water using qPCR for the specific quantification of human/porcine/bovine DNA viruses, adenoviruses and polyomaviruses, proposed as MST tools.

Método rentable para el Rastreo de uso microbiana específica virus humanos y animales

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant ...

Plaque Assay for Murine Norovirus

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are observed during MNV-1 infection of murine dendritic cells or macrophages 1. This property of MNV-1 can be used to quantify the number of infectious particles in a given sample by performing a plaque assay 1. The plaque assay relies on the ability of MNV-1 to lyse cells and to form holes in a confluent cell monolayer, which are called plaques 3.
Multiple techniques can be used to detect viral infections in tissue culture, harvested tissue, clinical, and environmental samples, but not all measure the number of infectious particles (e.g. qRT-PCR). One way to quantify infectious viral particles is to perform a plaque assay 3, which will be described in detail below. A variation on the MNV plaque assay is the fluorescent focus assay, where MNV antigen is immunostained in cell monolayers 4. This assay can be faster, since viral antigen expression precedes plaque formation. It is also useful for titrating viruses unable to form plaques. However, the fluorescent focus assay requires additional resources beyond those of the plaque assay, such as antibodies and a microscope to count focus-forming units. Infectious MNV can also be quantified by determining the 50% Tissue Culture Infective Dose (TCID50) 3. This assay measures the amount of virus required to produce CPE in 50% of inoculated tissue culture cells by endpoint titration 5. However, its limit of detection is higher compared to a plaque assay 4.
In this article, we describe a plaque assay protocol that can be used to effectively determine the number of infectious MNV particles present in biological or environmental samples 1, 4, 6. This method is based on the preparation of 10-fold serial dilutions of MNV-containing samples, which are used to inoculate a monolayer of permissive cells (RAW 264.7 murine macrophage cells). Virus is allowed to attach to the cell monolayer for a given period of time and then aspirated before covering cells with a mixture of agarose and cell culture media. The agar enables the spread of viral progeny to neighboring cells while limiting spread to distantly located cells. Consequently, infected cells are lysed and form holes in the monolayer known as plaques. Upon sufficient spread of virus, plaques become visible following staining of cells with dyes, like neutral red, methylene blue, or crystal violet. At low dilutions, each plaque originates from one infectious viral particle and its progeny, which spread to neighboring cells. Thus, counting the number of plaques allows one to calculate plaque-forming units (PFU) present in the undiluted sample 3.

Here we describe a method to quantify infectious particles of murine norovirus (MNV), which is the only norovirus that efficiently replicates in cell culture. The plaque assay takes advantage of MNV&#x2019;s tropism for murine macrophages and can be adapted for use with biological or environmental samples containing MNV.

Placa de Ensayo para Norovirus murino

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

To identify potential antivirals against BTV, we have developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based assay was the first assay developed to evaluate whether a compound showed any antiviral efficacy and have been used to screen large compound library. Meanwhile, cytotoxicity of antivirals could also be evaluated using the CPE-based assay. The dose-response assay was designed to determine the range of efficacy for the selected antiviral, i.e. 50% inhibitory concentration (IC50) or effective concentration (EC50), as well as its range of cytotoxicity (CC50). The ToA assay was employed for the initial MoA study to determine the underlying mechanism of the novel antivirals during BTV viral lifecycle or the possible effect on host cellular machinery. These assays are vital for the evaluation of antiviral efficacy in cell culture system, and have been used for our recent researches leading to the identification of a number of novel antivirals against BTV.

Three assays, including the cytopathic effect (CPE)-based assay, dose-response assay and Time-of-Addition (ToA) assay have been developed, optimized, validated and utilized to identify novel antivirals against Bluetongue virus (BTV), as well as to determine the possible Mechanism-of-Action (MoA) for newly identified antivirals.

Los ensayos para la identificación de nuevos antivirales contra la fiebre catarral ovina Virus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

Uso de la superposición de ensayo para medir cualitativamente la producción bacteriana y sensibilidad hacia neumocócica bacteriocinas

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Fenómica fagos: enfoques fisiológicos para caracterizar Novela Virales Proteínas

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

Ensayos pronta entrada virales para la identificación y evaluación de compuestos antivirales

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

La medición de la influenza neuraminidasa inhibición títulos de anticuerpos mediante un ensayo de lectina ligado a enzimas

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell surface-expressed T-cell receptor (TCR) must functionally recognize human leukocyte antigen (HLA)-restricted tumor-derived peptides (pHLA). However, we and others have shown that most TCRs bind sub-optimally to tumor antigens. Uncovering the molecular mechanisms that define this poor recognition could aid in the development of new targeted therapies that circumnavigate these shortcomings. Indeed, present therapies that lack this molecular understanding have not been universally effective. Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between TCRs and pHLA governs T-cell functionality. These methods include the generation of soluble TCRs and pHLA and the use of these reagents for X-ray crystallography, biophysical analysis, and antigen-specific T-cell staining with pHLA multimers. Using these approaches and guided by structural analysis, it is possible to modify the interaction between TCRs and pHLA and to then test how these modifications impact T-cell antigen recognition. These findings have already helped to clarify the mechanism of T-cell recognition of a number of cancer antigens and could direct the development of altered peptides and modified TCRs for new cancer therapies.

Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between the T-cell receptor and tumor antigens, presented by human leukocyte antigens, governs T-cell functionality; these methods include protein production, X-ray crystallography, biophysics, and functional T-cell experiments.

El uso de cristalografía de rayos X, Biofísica y Ensayos funcionales para determinar la célula T mecanismos que rigen el reconocimiento del receptor de antígenos del cáncer