We would like to thank FMC BioPolymer USA for product samples of Avicel. This work was supported through the Defense Threat Reduction Agency grant HDTRA1-13-1-0005 to KK and the NIH research grant 1R15AI100001-01A1to KK.

1. Preparación de Células y Reactivos <ol><li> El día antes del ensayo, la placa de células huésped apropiadas para el virus en cuestión (Tabla 1 y 2) a 90 - 100% de confluencia. </li><li> Preparar la solución de fijación de formaldehído al 10% en dH 2 O. En el ejemplo, la mezcla 5,56 ml de 36% de la formaldehído con 14,44 ml de H 2 O destilada (dH2O). NOTA: Use las prácticas de manejo seguro apropiado y ventilación cuando se utiliza formaldehído. </li><li> Preparar mancha cristal violeta: 1% de cristal violeta (CV) en etanol al 20% y DH 2 O. </li><li> Preparar los medios de comunicación de la placa 2x (tipo celular dependiente a la concentración 2x; véase la Tabla 2). Filtrar sobre un filtro de 0,2 micras si cualquier reactivo no son estériles. </li><li> Preparación de las placas de inmovilización (Tabla 3) <ol><li> Para superposiciones de líquidos, hacer una solución de 2,4% estéril de Avicel en dH 2 O. Para evitar la formación de grumos, añadir el polvo a un matraz que contiene agua ªen que se mezcla rápidamente con una barra de agitación, se vierte lentamente en Avicel y revolver rápidamente a temperatura ambiente (TA). Cuando la solución resulta demasiado viscoso para una barra de agitación para homogeneizar, cambiar a un agitador de matraces para&gt; 30 min con agitación fuerte para asegurar una homogeneización. NOTA: Las soluciones madre se pueden hacer a concentraciones más bajas, pero las soluciones pueden separar y tendrán que ser remezclado para asegurar la homogeneización. Las soluciones de trabajo de Avicel pueden utilizarse van desde 0,6 hasta 3%. </li><li> Después de la homogeneización, autoclave la solución y tienda sellada a temperatura ambiente. </li><li> Para agarosa y carboximetilcelulosa (CMC) superposiciones, preparar una solución de reserva en dH 2 O de 2% de CMC o agarosa al 0,6%. Mezclar con una barra de agitación y autoclave o microondas para poner en solución. </li></ol></li></ol> 2. Las diluciones e Infecciones <ol><li> El día después de la siembra, compruebe visualmente la confluencia y la viabilidad de las células antes de comenzar el ensayo. Asegurar un estándar celular morfologíaencontrar una monocapa confluente ~ 90% está presente. </li><li> Realizar una dilución en serie de diez veces de las muestras infecciosas. Utilice el medio de crecimiento celular para la propagación viral como el diluyente (Tabla 2). Variar el número de diluciones requeridas basado en el título esperado del virus en cuestión, y siempre utilizar una muestra de control no infectado para asegurar de forma independiente la viabilidad celular y ayuda en la identificación de la placa. </li><li> De las diluciones en serie, infectar las células durante 45 min a 1 h (Tabla 1). Utilice un volumen suficiente de inóculo para cubrir las células, mientras que manteniendo el volumen lo más bajo posible para maximizar el contacto con la monocapa viral (Tabla 4). Placas de roca suavemente cada 20 minutos para asegurar una cobertura uniforme y evitar la monocapa celular se seque. </li><li> Después de la infección, superponer un volumen apropiado de medio de inmovilización directamente a los inóculos en el pozo (Tabla 2) usando una mezcla 1: 1 de los medios de placa 2x y la immobilizing superposición de elección (CMC, agarosa o Avicel). Agite suavemente para mezclar. <ol><li> Para superposiciones de líquidos, mezclar 1: 1 con los medios de placa 2x calentado y 1.2 a 2.4% de RT Stock Avicel para obtener una solución de trabajo de 0,6 a 1,2% de medio de superposición Avicel. </li><li> Para una capa de agarosa, utilice una mezcla 1: 1 de los medios de placa 2x calentado y una solución madre de 0,6% de agarosa climatizada, lugar en un baño de agua 56 ° C durante 30 min para equilibrar la temperatura de la obtención de una concentración de agarosa / superposición final de 0,3 %. </li><li> Para CMC, preparar una solución de 2% y el tratamiento que el descrito para la capa de agarosa. </li><li> Cuando se aplica el recubrimiento a la monocapa, siempre equilibrar agarosa caliente o CMC en un 56 ° C el agua para evitar daños a la monocapa. Asegúrese de que la solución es cálido, pero no caliente al tacto para evitar la muerte de las células y los títulos virales reducidos. La mayoría de las superposiciones de agarosa comenzarán a solidificarse por debajo de 42 ° C, trabajar de forma rápida y / o preparar pequeños lotes para evitar la solidificación durante la manipulación. </li></ol></li><li> Después de la adición de la superposición, incubar las placas para producir placas distintas que son claramente contable. La formación de placas puede tomar 2-14 días dependiendo del virus que se analizaron, la Tabla 1. NOTA: Una vez que las placas superpuestas líquidos se colocan en la incubadora, no moverlos. Movimiento de las superposiciones de líquidos durante el período de incubación se traducirá en placas untadas. Agarosa y CMC superposiciones son semisólido y se pueden mover o revisados ​​periódicamente bajo un microscopio de luz para controlar el desarrollo de la placa. </li></ol> 3. Fijación y tinción de las células <ol><li> Para fijar las células, verter o aspirar la superposición Avicel, y fijar las células utilizando la solución de formaldehído al 10% durante 30 min a durante la noche (&lt;1 ml por pocillo de una placa de 6 pocillos). <ol><li> Para agarosa o CMC, añadir directamente la solución de formaldehído a la superposición durante 1 hora a toda la noche. NOTA: Las muestras pueden mantenerse durante largos períodos de tiempo en el fijador siempre lo haceno se evapore y seque ya que esto puede distorsionar la monocapa. </li></ol></li><li> Antes de la tinción y después de la fijación, deseche el formaldehído y quitar los tapones semisólidos para la agarosa y CMC, ya sea con agua corriente o manualmente con una espátula. Enjuague Avicel placas con agua para eliminar residual superposición / fijador antes de la tinción. </li><li> Para la tinción, cubrir las células con una cantidad mínima de solución de cristal violeta durante ~ 15 min. Placas de roca si es necesario para asegurar una cobertura uniforme. </li><li> Lavar suavemente la mancha violeta cristal con agua. Una vez fijado, manchado, y se seca, almacenar las placas de forma indefinida para futuros análisis. </li></ol> 4. Determinación de títulos virales <ol><li> Cuente las placas en cada pocillo, tomando el promedio de los técnicos repeticiones de la misma dilución. Para los grandes formatos de placas, pozos de descuento con menos de 5 o mayor de 100 placas. Tome nota del tamaño de la placa y la morfología. El control negativo debe tener una monocapa uniforme yse puede utilizar como un control de referencia. </li><li> Determinar el título viral de la muestra de stock de tomar el número medio de placas para una dilución y la inversa del factor de dilución total. </li></ol><img alt="Ecuación 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52065/52065eq1.jpg" width="300" /> NOTA: Como un ejemplo, 30 y 32 placas contada por repeticiones de la 1 x 10 -7 dilución [31 (promedio) / 10 -7 (dilución) x 0,4 ml (inóculo)] produciría un título de 7,75 x 10 8 pfu / ml.

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The authors have nothing to disclose and no competing or financial interests in the protocol or products described.

El factor más crítico para el éxito de un ensayo de placa se encuentra en la optimización del protocolo para el cultivo viral particular en cuestión ya que las condiciones pueden variar significativamente. Los puntos clave a tener en cuenta son: la sede de la compatibilidad celular con el virus en cuestión, las condiciones de crecimiento viral apropiados, los rangos de dilución suficiente con el fin de diferenciar claramente las placas, y la selección de superposición correcta y tinción de las células y de virus en cuestión. Mientras VEEV y RVFV tanto crecen bajo condiciones muy similares que utilizan muchos de los mismos tipos de células huésped, las diferencias en la morfología y cinética de crecimiento de placa varían significativamente. Cuando se utilizan células Vero para los ensayos de placa, que se han utilizado tradicionalmente como una línea celular de propagación y el indicador de virus y alfavirus fiebre hemorrágica, VEEV normalmente crece hasta títulos más altos que RVFV y demuestra el aumento de la cinética de replicación, el desarrollo de grandes placas uniformes a 48 hpi 4, 10-12. En contraste con VEEV, RVFV requiere 72 hpi y demuestra placas que son típicamente mucho más pequeño y de tamaño variable. En oposición a RVFV y VEEV, el virus de la gripe es altamente específica de la célula huésped y puede ser difícil para propagarse a través de cultivo de tejidos. Para el virus de la influenza, la entrada viral y fusión normalmente se inicia por la unión del receptor de la superficie celular con la hamagglutinin glicoproteína viral (HA), que media la entrada en la célula diana mediante la unión con el receptor de superficie de ácido α-siálico de la célula huésped. HA es una glicoproteína trimérico que está presente en la envoltura de la membrana de todos los virus de la gripe y requiere la escisión en el HA1 y HA2 subunidades por una proteasa específica de la célula huésped. Para complicar aún más el asunto, estos sitios de escisión a menudo pueden variar entre cepas virales 13. Como la expresión de proteasas capaces de escindir HA está restringida a tejidos específicos, proteasas are menudo añadido a medios de cultivo celular con el fin de facilitar la fusión viral y la entrada en la célula huésped seleccionada 13. TPCK-tripsina es un ejemplo de una proteasa de uso común que se utiliza en el cultivo de células MDCK tanto con y células Vero: facilitar la replicación multi-ciclo (en ausencia de cualquier suero inactivar la tripsina) a través de la activación proteolítica de HA viral 14,15. Como se demuestra en este estudio y otros, las diferencias en los ciclos de vida virales pueden influir en las selecciones de superposición, los formatos de placas, y los tiempos de recogida, con variaciones significativas entre diferentes clases y especies de virus. En nuestro estudio, las superposiciones de agarosa demostraron placas más claras en los títulos más altos que cualquiera de CMC o superposiciones de líquidos, tanto para RVFV y el virus de la influenza B, reforzando su utilidad entre una amplia gama de virus y tipos de células. Usando una concentración final de agarosa de bajo gran medida con la ayuda en la eliminación de los tapones sólidos y tinción simplificado. CMC demostró en general la peficacia oorest como una superposición de los tres virus probadas y producidas placas muy pequeñas y poco definidos para el virus de la influenza B. Aunque en general CMC demostró las características menos deseables, su uso en rápido crecimiento y extremadamente virulentas de virus podrían resultar ventajoso, como lo hizo parece reducir tamaño de la placa con sólo una mínima disminución en el título. La superposición líquido resultó ser el más versátil en que era extremadamente sencillo de preparar, mayor facilidad de uso, y fue comparable a agarosa a través de todos los virus seleccionados. En un formato de placa de un mayor rendimiento de 96 pocillos, aplicación y eliminación no fue inhibida debido a la solidificación como con revestimientos tradicionales, y proporcionado resultados precisos y consistentes. Una consideración cuando se utiliza superposiciones líquidos se encuentra en la coloración opaca y la incapacidad para controlar la formación de placa como las placas no se pueden mover hasta el punto de recogida, limitando esta adaptación a los virus con cinética de replicación previamente caracterizadas. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Pequeñas modificaciones en las condiciones de ensayo de placa pueden alterar significativamente los resultados, y la evaluación y el rendimiento de cualquier nuevo sistema o técnica está siempre garantizado. Mientras que un protocolo de ensayo de placa optimizada y estandarizada no existe para cada situación, nuestro informe demuestra la versatilidad y facilidad de uso en el tradicional, así como nuevos recubrimientos líquidos para ensayos de placa, mientras que proporciona un fondo suficiente para otras modificaciones de usuario.

El aislamiento y la cuantificación exacta de las muestras virales viables ha sido siempre un objetivo de la investigación en curso en virología. No fue sino hasta el advenimiento de la placa de ensayo en 1952 que un medio para calcular cuantitativamente y cualitativamente los títulos virales de los animales fue desarrollado por primera vez 1,2. Esta técnica se ha adaptado y modificado a partir de ensayos de fagos, que previamente habían sido utilizados para calcular los títulos de los bacteriófagos de valores en biología vegetal 1,2 en primer lugar. Mientras que medios alternativos para la cuantificación viral Desde entonces se han desarrollado y adaptado, tales como inmunoensayos, fluorescencia y microscopía electrónica de transmisión, la detección de impulsos resistiva sintonizable (TRPS), citometría de flujo, sistemas indicadores recombinantes, y reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (QRT-PCR) , estos métodos no logran identificar y cuantificar de replicación de viriones competentes 1,3. Si bien los avances en las tecnologías y técnicas continúan refinando y alterar el paisaje; handensayos e siguen representando el estándar de oro en la determinación de las concentraciones virales de viriones infecciosos líticas 1,4. Durante un ensayo de placa, una monocapa confluente de células huésped está infectado con un virus lítico de una concentración desconocida que se ha diluido en serie a una gama contable, típicamente entre 5-100 viriones. Las monocapas infectadas se cubren con un medio de recubrimiento de inmovilización para prevenir la infección viral de forma indiscriminada difusión a través de ya sea el flujo de convección mecánica o del medio líquido durante la propagación viral. Mientras que se han utilizado tradicionalmente superposiciones sólidos o semisólidos tales como agarosa, celulosa de metilo o carboximetil celulosa (CMC), superposiciones de líquidos se han convertido en una alternativa cada vez más atractiva con el desarrollo de nuevos recubrimientos líquidos tales como Avicel 5- 7. Ensayos de placas que utilizan líquido frente superposiciones tradicionales tienen varias ventajas como la superposición puede ser aplied a temperatura ambiente, y la aplicación y la eliminación es mucho más fácil. Como superposiciones líquidos no requieren calentamiento, virus lábiles delicados y de calor también pueden resultar más fáciles de placa. Después de la infección inicial y la aplicación de la superposición de inmovilización, las placas individuales, o zonas de muerte celular, comenzará a desarrollar una infección viral y la replicación como se ven limitados a la monocapa circundante. Las células infectadas continuarán el ciclo de replicación-lisis-infección, propagación aún más la infección, lo que resulta en placas cada vez más distintas y discretas. Dependiendo de la cinética de crecimiento y célula huésped viral usado, una placa visible normalmente formar dentro de 2-14 días. Monocapas celulares pueden entonces ser contadas con un microscopio de campo claro estándar, o más típicamente fijos y counterstained por el rojo o cristal violenta neutral con el fin de identificar fácilmente las placas con el ojo desnudo. Hay una amplia variedad de manchas de contador de placa disponibles, cada uno con ésimoEIR ventajas y desventajas específicas. Violeta cristal se añade típicamente en el punto de recogida y después de la fijación / extracción de la superposición, proporcionando una mancha contador rápido y distinto que permite la identificación de placas muy pequeñas cuando morfología mixta está presente. El rojo neutro tiene la ventaja de la aplicación temprana y el contacto constante con la superposición, lo que permite el seguimiento en vivo de desarrollo de la formación de placa, que es particularmente útil cuando se trabaja con un desconocido cinética de virus o de replicación. Sin embargo, hemos encontrado que la tinción normalmente no es tan distinta cuando se utiliza rojo neutro. 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-tetrazolio bromuro de difenil (MTT) ofrece varias ventajas, como las manchas de tinte de color amarillo viven células placas azules oscuras y virales pueden contarse sin eliminación de la superposición como con rojo neutro. El alto contraste entre células vivas y muertas que ofrece el MTT también permite la detección de pequeñas placas en una infección punto anterior post tiempo, Aunque el almacenamiento seguiría exigiendo la eliminación de la superposición de 8. Como cristal violeta se puede simplemente hizo en una solución de agua y alcohol, y ofrece un alto grado de sensibilidad para la morfología de la placa mixta, hemos elegido como una mancha counter preferente y simplificado para el protocolo demostró como estamos utilizando varias familias de bien virus caracterizados. Después de la fijación y tinción de la monocapa celular infectada, las placas se cuentan en orden para titular muestras de valores virales en términos de unidades formadoras de placa (pfu) por mililitro. Una gota de registro debe señalar entre diluciones en serie y, dependiendo del tamaño de la placa, entre 5-100 placas contadas, con un control negativo utilizado como referencia. Muestras estadísticamente variarán en un 10% por cada 100 placas contadas al comparar la muestra replica 3. La ventaja de usar ensayos de placas para determinar los títulos virales reside en su capacidad para cuantificar el número real de partículas virales infecciosas wentro de la muestra. Como múltiples viriones podrían potencialmente infectar una sola célula, se utiliza la terminología de las unidades frente a viriones durante titulaciones de placa 1,2. Morfología de la placa puede variar enormemente en condiciones de crecimiento diferentes y entre las especies virales. Tamaño de la placa, la claridad, la definición de fronteras, y la distribución deben tenerse en cuenta todos, ya que pueden proporcionar información valiosa sobre los factores de crecimiento y virulencia del virus en cuestión. Principios ensayo de placa de base también se pueden adaptar y modificar en un número de maneras diferentes, tales como en el uso de ensayos de formación de enfoque (AGL). AGL no se basan en la lisis celular y la contratinción para detectar la formación de placa, sino más bien inmunotinción emplean técnicas para detectar directamente las proteínas virales intracelulares a través de anticuerpos etiquetados. Aumento de la sensibilidad, la disminución de los tiempos de incubación después de la infección, y lo más importante la capacidad para cuantificar los virus no lítico son todos distintosventajas cuando se emplean ácidos grasos libres. Aunque se usan ampliamente, los factores limitantes críticos en AGL frente a un ensayo de placa tradicional se encuentra en la necesidad de anticuerpos apropiados y la capacidad de sólo sonda para subunidades de proteínas virales frente a viriones infecciosos reales 4. A los efectos de este estudio, vamos a limitar nuestra discusión a ensayos de placas clásicos y describir el uso de superposiciones de sólidos y semisólidos tradicionales (agarosa y CMC), junto con superposiciones de celulosa microcristalina líquido novedosos.

<table><tbody><tr><td>6-well CellStar plate for tissue culture</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658 160</td><td></td></tr><tr><td>12-well CellStar plate for tissue culture</td><td>Greiner Bio-One</td><td>665 180</td><td></td></tr><tr><td>96-well CellStar plate for tissue culture</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655 180</td><td></td></tr><tr><td>96-2ml deep well plate</td><td>USA Scientific</td><td>C15046314</td><td>For serial dilutions</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Quality Biologicals</td><td>112 013 101</td><td>Cell Media/Diluent</td></tr><tr><td>2x EMEM for plaques</td><td>Quality Biologicals</td><td>115 073 101</td><td>Warm to 37 &amp;#176;C</td></tr><tr><td>MEM 100x&amp;nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>25 025 Cl</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate&amp;nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>25 000 Cl</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140 122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030 081</td><td></td></tr><tr><td>HyClone FBS&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30910.03</td><td>Heat inactivate before use at 62 &amp;#176;C for 30 min</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma Aldritch</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin TPCK</td><td>Sigma Aldritch</td><td>T1426-50mg</td><td>Make aliquots/Avoid freeze thawing</td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>DEAE-Dextran</td><td>Sigma Aldritch</td><td>D9885-10G</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Sigma Aldritch</td><td>C3886-25G</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde Solution</td><td>Sigma Aldritch</td><td>F8775-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol denatured Reagent Grade</td><td>Sigma Aldritch</td><td>362808-1L</td><td></td></tr><tr><td>Avicel RC-591 NF</td><td>FMC BioPolymer USA</td><td>RC-591 NF</td><td>Shake vigorously when reconsitiuting&amp;nbsp; for &gt;30 min to homogenize</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16500-100</td><td></td></tr><tr><td>Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4888</td><td></td></tr></tbody></table>

viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems

Ensayos de placas siguen siendo uno de los métodos más precisos para la cuantificación directa de los viriones infecciosos y sustancias antivirales a través del conteo de placas discretas (unidades infecciosas y zonas muertas celulares) en el cultivo de células. Aquí se demuestra cómo realizar un ensayo de placa de base, y cómo superposiciones y técnicas diferentes pueden afectar la formación de placa y la producción. Típicamente sustratos de superposición sólidos o semisólidos, tales como agarosa o celulosa carboximetil, se han utilizado para restringir la propagación viral, prevención de la infección indiscriminada a través del medio de crecimiento líquido. Superposiciones inmovilizados restringen la infección celular para la monocapa que rodea inmediatamente, lo que permite la formación de focos contable discreto y formación de la placa posterior. Para superar las dificultades inherentes en el uso de recubrimientos tradicionales, una novela superposición de líquido que utiliza celulosa microcristalina y carboximetil celulosa de sodio se ha utilizado cada vez más como un sustituto en la normala placa de ensayo. Ensayos de placa de superposición líquidas se pueden realizar fácilmente en 6 o 12 formatos de placas, así como estándar por las técnicas tradicionales y no requieren equipo especial. Debido a su estado líquido y la posterior facilidad de aplicación y remoción, formatos de placas de microcultivo, alternativamente, se pueden utilizar como una rápida, precisa y de alta alternativa rendimiento para titulaciones virales de mayor escala. El uso de un polímero líquido viscoso climatizada no ofrece la oportunidad de racionalizar el trabajo, conserve los reactivos, espacio incubador, y aumenta la seguridad operativa cuando se utiliza en los laboratorios de contención tradicionales o altos como ningún calentamiento del reactivo o material de vidrio son obligatorios. Superposiciones líquidas también pueden ser más sensibles que los recubrimientos tradicionales para ciertos virus lábiles al calor.

La capacidad de los ensayos de placa de evaluar con precisión los títulos virales depende de numerosos factores: la selección de células huésped apropiado, medios y condiciones de crecimiento adecuadas para la viabilidad celular y viral, la propagación viral inmovilizado, y una determinación exacta del período de incubación viral para permitir un tiempo adecuado para distinta y la formación de placa contable. Para este estudio, se eligieron tres familias de virus representativos para demostrar diferencias en: la selección de superposición, períodos de incubación, y morfología de la placa a través de diferentes tipos de muestras. La encefalitis equina venezolana (VEEV) fue seleccionado como un modelo viral (+) ARN de cadena simple, que puede causar enfermedad significativa en las especies y seres humanos equinos y representa la familia Togaviridae. Influenza B cepa Taiwán, una segmentado (-) de virus ARN de cadena simple que infecta principalmente los seres humanos, representa a la familia Orthomyxoviridae. Valle del Rift virus de la fiebre (RVFV), a - virus de ARN de cadena simple artrópodo nacido infectando principalmente artrópodos, ()rumiantes y los seres humanos, fue seleccionado como representante de la familia Bunyaviridae. Para RVFV (Figura 1), los títulos se determinaron a partir de una solución madre de una cepa viva atenuada recombinante MP12 de RVFV en un formato de placa de 12 pocillos utilizando CMC, agarosa, o Avicel superposiciones que se incubaron de lado a lado para después de la infección 72 hr (HPI). Un plato representativo que muestra diluciones que van desde 10 -4-10 -7 se puede ver en el panel A. Las placas utilizando CMC y superposiciones de agarosa mostró placas pequeñas, claras y distintas, con un borde circular bien definida. Las placas con una capa de líquido fueron ligeramente más abundantes y de mayor tamaño en comparación con las placas de agarosa y CMC, y proporcionaron una frontera menos distintas. Los títulos virales se compararon en el Panel B con todas las superposiciones realizar comparable. Con el fin de obtener una comparación visual más clara entre las superposiciones de MP12, junto con un tamaño de muestra mayor para determinar reproduccibilidad, una placa de 6 pocillos también se probó por triplicado (Figura 2). En el formato de placa de 6 pocillos, el uso de una superposición de CMC mostró placas más pequeño que cualquiera superposiciones de agarosa o líquidos, que eran comparables en tamaño a la otra. Mientras que los títulos virales fueron similares entre los tres superposiciones (Panel D), placas formadas en las capas de agarosa y líquidos resultaron más fáciles de contar debido a su mayor tamaño. En contraste con RVFV, los títulos de VEEV y morfología de la placa entre las superposiciones de diferentes variaron notablemente (Figura 3A). Placas formadas en las capas de CMC demostraron una morfología clara y distinta cuando se utiliza un formato de placa de 12, a expensas de tamaño y sensibilidad de la placa (Panel B). En contraste con CMC, el uso de agarosa y líquidos superposiciones resultó en placas significativamente más grandes, lo que indica la inhibición viral más baja y aumento de la sensibilidad a la replicación VEEV. Esto fue confirmado previamente cuando se comparan exclusivamente agarosa frente a CMC en apaper publicado por Juárez et al. 4. Mientras agarosa y líquidos superposiciones producen placas más grandes que CMC, las placas habían bordes mal definidos y eran difíciles de contar en un formato de 12 pocillos, con superposiciones de líquidos que proporcionan la mayor difusión frontera. Cuando las placas se probaron en placas de 6 pocillos (Figura 4), ​​el más grande formato de 6 pocillos negada la cuestión de la abiertamente grandes placas que eran difíciles de diferenciar en el formato de 12 pocillos, con agarosa y superposiciones de líquidos que demuestren superior a las superposiciones de CMC en términos de definición placa y sensibilidad (Figura 4D). En comparación con RVFV o VEEV, influenza proporciona varios desafíos únicos cuando formación de placas, tales como el requisito de una proteasa externa. La sensibilidad de los virus de la influenza a las diferentes selecciones de superposición también ha sido bien documentado en el pasado ya que se han observado cambios significativos cuando las modificaciones de menor importancia como como diferentes marcas de agarosa tienen seres usado 9. Es interesante para la cepa de la influenza B Taiwán, el uso de la CMC como una superposición dio lugar a placas notablemente más pequeños que eran difíciles de contar y resultaron difíciles de marcar de forma fiable (Figura 5A). El uso de una capa de agarosa proporcionó las mejores placas (Panel C), y resultó en una mancha de fondo más oscuro (probablemente debido a un aumento de la viabilidad monocapa), y mostró placas más claras y nítidas en comparación directa con el uso de la superposición de líquido (Panel B ). Una clara ventaja de polímeros líquidos más de superposiciones sólidas y semisólidas, tales como agarosa y CMC, se encuentra en la facilidad de eliminación y aplicación. Superposiciones semiduros requieren calefacción, y la solidificación puede ser problemático cuando la manipulación y eliminación. Con el fin de sacar provecho de estas ventajas y determinar la viabilidad de la utilización de Avicel en forma de alto rendimiento para RVFV, un formato de placa de 96 pocillos se probó en diferentes concentrati superposicióncomplementos (Figura 6). Para RVFV MP-12, las diluciones se realizaron por cuadruplicado en ambos 0,6 y 1,2% concentraciones finales de Avicel. Aplicación de superposición y la eliminación demostraron simple, sin diferencias aparentes entre repeticiones o entre las concentraciones observadas, lo que demuestra un alto grado de reproducibilidad. Al puntuar, las placas eran distintos y contable a simple vista, lo que demuestra la viabilidad de la utilización de superposiciones de líquidos en un alto rendimiento para RVFV manera. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6.5in" width="650" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig1highres.jpg" /> Figura 1: Placa RVFV comparaciones de superposición utilizando placas de 12 pocillos se sembraron a Veros 2,5 x 10 5 células en placas de 12 pocillos y se infectaron con 200 l usando la misma muestra de partida diluido en serie de MP12.. Después de la infección 1,5 ml superposiciones de agarosa al 0,3%, 0,6% Avicel, o 1% de CMC (c definitivaoncentrations), se aplicaron con el fin de comparar directamente las superposiciones como se ha demostrado en el Panel A. Las placas se contaron y se titularon en el Panel B. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig2highres.jpg" /> Figura 2: placa RVFV comparaciones de superposición utilizando placas de 6 pocillos Veros se sembraron a 5 x 10 5 células en placas de 6 pocillos y se infectaron con 400 l usando la misma muestra de partida diluido en serie de MP12.. Tres ml superposiciones de agarosa al 0,3%, 0,6% Avicel, o 1% de CMC, se aplicaron con el fin de comparar directamente las superposiciones como se demuestra en el Panel A, B, y C. experimentos separados se llevaron a cabo de forma idéntica como se describe para paneles de AC, con las placas se contaron y se titularon en el Panel D (N = 3). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig3highres.jpg" /> Figura 3: &lt;strong&gt; placa VEEV comparaciones de superposición utilizando placas de 12 pocillos se sembraron Veros. a 2,5 x 10 5 células en placas de 12 pocillos y se infectaron con 200 l utilizando la misma muestra diluido en serie a partir de la cepa de la vacuna VEEV TC-83. Después de la infección 1,5 ml superposiciones de agarosa al 0,3%, 0,6% Avicel, o 1% de CMC, se aplicaron con el fin de comparar directamente las superposiciones como se demuestra en el Panel A. Las placas se contaron y se titularon en el Panel B. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig4highres.jpg" /> Figura 4: V EEV comparaciones de superposición de la placa que utilizan placas de 6 pocillos Veros se sembraron a 5 x 10 5 células en placas de 6 pocillos y se infectaron con 400 l usando la misma muestra de partida diluido en serie de VEEV TC-83.. Después de la infección, 3 ml superposiciones de agarosa al 0,3%, 0,6% Avicel, o un 1% de CMC, se aplicaron con el fin de comparar directamente las superposiciones como se ha demostradoen los Paneles A, B y C. experimentos separados se llevaron a cabo de forma idéntica a la descrita para Paneles A - C, con placas contadas y tituladas en el Panel D (N = 3). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig5highres.jpg" /> Figura 5: INFLUENZA placa comparaciones de superposición de las células MDCK se sembraron a 5 x 10 5 células en placas de 6 pocillos y se infectaron con 400 l de inóculo utilizando la misma muestra de partida diluido en serie de Influenza B Taiwan.. No suero bovino fetal (FBS) se utilizó en el medio de crecimiento o superposiciones, como FBS puede inhibir la propagación de la influenza mediante la inhibición de ciertas proteasas que son necesarios para la fusión viral. TPCK-tripsina se añadió a todas las superposiciones antes de la aplicación con el fin de facilitar la fusión viral y la entrada con las células huésped. Después de la infección, 3 ml superposiciones de agarosa al 0,3%, 0,6% Avicel, o 1% de CMC se aplicaron con el fin de comparar directamentelas superposiciones como se demuestra en el Panel A, B y C. experimentos separados se llevaron a cabo de forma idéntica como se describe en los Paneles A - C, con placas contadas y tituladas en el Panel D (N = 3). Mientras que en promedio fue tomada por placas CMC que resultaron difíciles de contar de forma fiable, ya que demostraron fronteras difusas y tamaños muy pequeños de placa. <img alt="Figura 6" fo:content-width="6.5in" width="650" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig6highres.jpg" /> Figura 6:. Superposiciones de placa de alto rendimiento Una placa de 96 pocillos de Veros en placas a 3 x 10 4 células por pocillo, se infectaron con 50 l de inóculo utilizando la misma muestra de partida diluido en serie de RVFV MP12 durante 1 hora, por cuadruplicado. Para las superposiciones, 0,6 y 1,2% concentraciones finales de Avicel se probaron para determinar la viabilidad y reproducibilidad de la utilización de superposiciones de líquidos de una manera de alto rendimiento, paneles A y B. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Tipo de la célula </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Período de infección </td><td> 1 hora </td><td> 1 hora </td><td> 45 min </td></tr><tr><td> El tiempo de incubación </td><td> 3 días </td><td> 2 días </td><td> 3 días </td></tr></tbody></table> Tabla 1: La placa de ensayo de inoculación condiciones y tipos de células <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Tipo de la célula </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Tipo de crecimiento</td><td> DMEM 1 </td><td> DMEM 1 </td><td> DMEM 2 </td></tr><tr><td> Placa de Medios </td><td> Un 2xEMEM </td><td> Un 2xEMEM </td><td> 2xEMEM B </td></tr></tbody></table> 1. Medio de Eagle Modificado de Dulbecco suplementado con 10% suero bovino fetal, 1% de L-glutamina, 1% Penicllin / estreptomicina. 2. Medio de Eagle Modificado de Dulbecco suplementado con 1% de L-glutamina, 1% Penicllin / estreptomicina, 0,2% albúmina de suero bovino, HEPES 0,025%, DEAE-dextrano 50 ug / ml. A. 2x Medio Esencial Mínimo (500 ml) suplementado con FBS al 5% (25 ml), 1% Esencial Mínimo Amino Acids (5 ml), 1% de piruvato sódico (5 ml), 1% de L-glutamina (5 ml), 2% penicilina / estreptomicina (10 ml). B. 2x Medio Esencial Mínimo (500 ml) suplementado con 0,2% de albúmina de suero bovino, aminoácidos esenciales 1% mínimo (5 ml), 50 ug / ml, 0,025% HEPES, DEAE-dextrano, Tripsina-TPCK * * Justo antes de la preparación, añadir 1 l por cada 25ml de 2 mg / ml de tripsina-TPCK a la alícuota que va a utilizar para mezclar con agarosa para placas. Tabla 2: La placa y Viral / Celular Crecimiento Medios <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Tipo de la célula </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Período de infección </td><td> 1 hora </td><td> 1 hora </td><td> 45 min </td></tr><tr><td> El tiempo de incubación </td><td> 3 días </td><td> 2 días </td><td> 3 días </td></tr></tbody></table> Soluciones de superposición no expirarán cuando se hace siempre y cuando se mantenga la esterilidad. Tabla 3: Superposiciones Stock <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> 6 así </td><td> 12 así </td><td> 96 así </td></tr><tr><td> Nº de células / pocillo </td><td> 5 x 10 5 </td><td> 2,5 x 10 5 </td><td> 3 x 10 4 </td></tr><tr><td> Volumen de inóculo (l) </td><td> 400 </td><td> 200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> volumen de superposición (ml) </td><td> 3 </td><td> 1.5 </td><td> 0,100 </td></tr></tbody></table> Tabla 4: Formatos de placas

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Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Viral Concentración Determinación A través de placa Ensayos: El uso de tradicionales y novedosos sistemas de superposición

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

111.5K vistas.  George Mason University. Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

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Plaque Assay for Murine Norovirus

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are observed during MNV-1 infection of murine dendritic cells or macrophages 1. This property of MNV-1 can be used to quantify the number of infectious particles in a given sample by performing a plaque assay 1. The plaque assay relies on the ability of MNV-1 to lyse cells and to form holes in a confluent cell monolayer, which are called plaques 3.
Multiple techniques can be used to detect viral infections in tissue culture, harvested tissue, clinical, and environmental samples, but not all measure the number of infectious particles (e.g. qRT-PCR). One way to quantify infectious viral particles is to perform a plaque assay 3, which will be described in detail below. A variation on the MNV plaque assay is the fluorescent focus assay, where MNV antigen is immunostained in cell monolayers 4. This assay can be faster, since viral antigen expression precedes plaque formation. It is also useful for titrating viruses unable to form plaques. However, the fluorescent focus assay requires additional resources beyond those of the plaque assay, such as antibodies and a microscope to count focus-forming units. Infectious MNV can also be quantified by determining the 50% Tissue Culture Infective Dose (TCID50) 3. This assay measures the amount of virus required to produce CPE in 50% of inoculated tissue culture cells by endpoint titration 5. However, its limit of detection is higher compared to a plaque assay 4.
In this article, we describe a plaque assay protocol that can be used to effectively determine the number of infectious MNV particles present in biological or environmental samples 1, 4, 6. This method is based on the preparation of 10-fold serial dilutions of MNV-containing samples, which are used to inoculate a monolayer of permissive cells (RAW 264.7 murine macrophage cells). Virus is allowed to attach to the cell monolayer for a given period of time and then aspirated before covering cells with a mixture of agarose and cell culture media. The agar enables the spread of viral progeny to neighboring cells while limiting spread to distantly located cells. Consequently, infected cells are lysed and form holes in the monolayer known as plaques. Upon sufficient spread of virus, plaques become visible following staining of cells with dyes, like neutral red, methylene blue, or crystal violet. At low dilutions, each plaque originates from one infectious viral particle and its progeny, which spread to neighboring cells. Thus, counting the number of plaques allows one to calculate plaque-forming units (PFU) present in the undiluted sample 3.

Here we describe a method to quantify infectious particles of murine norovirus (MNV), which is the only norovirus that efficiently replicates in cell culture. The plaque assay takes advantage of MNV&#x2019;s tropism for murine macrophages and can be adapted for use with biological or environmental samples containing MNV.

Placa de Ensayo para Norovirus murino

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Investigación

Inmunología e Infección

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

This study describes an imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relationships between viruses. The protocol employs a flatbed scanner and has four steps, including titration, titration quantitation, neutralization, and neutralization quantitation. The assay works well with current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses.

Optimización de un ensayo cuantitativo micro-neutralización

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies on the ability of a scientist to sterilize work surfaces and equipment as well as prevent contact of sterile instruments and solutions with non-sterile surfaces. Here we present the steps for several plating methods routinely used in the laboratory to isolate, propagate, or enumerate microorganisms such as bacteria and phage. All five methods incorporate aseptic technique, or procedures that maintain the sterility of experimental materials. Procedures described include (1) streak-plating bacterial cultures to isolate single colonies, (2) pour-plating and (3) spread-plating to enumerate viable bacterial colonies, (4) soft agar overlays to isolate phage and enumerate plaques, and (5) replica-plating to transfer cells from one plate to another in an identical spatial pattern. These procedures can be performed at the laboratory bench, provided they involve non-pathogenic strains of microorganisms (Biosafety Level 1, BSL-1). If working with BSL-2 organisms, then these manipulations must take place in a biosafety cabinet. Consult the most current edition of the Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) as well as Material Safety Data Sheets (MSDS) for Infectious Substances to determine the biohazard classification as well as the safety precautions and containment facilities required for the microorganism in question. Bacterial strains and phage stocks can be obtained from research investigators, companies, and collections maintained by particular organizations such as the American Type Culture Collection (ATCC). It is recommended that non-pathogenic strains be used when learning the various plating methods. By following the procedures described in this protocol, students should be able to: 
 
&#9679; Perform plating procedures without contaminating media. 
&#9679; Isolate single bacterial colonies by the streak-plating method. 
&#9679; Use pour-plating and spread-plating methods to determine the concentration of bacteria. 
&#9679; Perform soft agar overlays when working with phage. 
&#9679; Transfer bacterial cells from one plate to another using the replica-plating procedure. 
&#9679; Given an experimental task, select the appropriate plating method.

When working with media and reagents used to culture microorganisms, aseptic technique must be practiced to ensure contamination is minimized. A variety of plating methods are routinely used to isolate, propagate, or enumerate bacteria and phage, all of which incorporate procedures that maintain the sterility of experimental materials.

Técnicas de laboratorio asépticas: Métodos de Revestimiento

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies ...

Biología

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, both to decipher viral replication mechanisms and to study antivirals or provide development platform for vaccines. The construction and manipulation of a reverse genetic system for a negative-strand RNA virus such as a respiratory syncytial virus (RSV), however, remains delicate and requires special know-how. The RSV genome is a single-strand, negative-sense RNA of about 15 kb that serves as a template for both viral RNA replication and transcription. Our reverse genetics system uses a cDNA copy of the human RSV long strain genome (HRSV). This cDNA, as well as cDNAs encoding viral proteins of the polymerase complex (L, P, N, and M2-1), are placed in individual expression vectors under T7 polymerase control sequences. The transfection of these elements in BSR-T7/5 cells, which stably express T7 polymerase, allows the cytoplasmic replication and transcription of the recombinant RSV, giving rise to genetically modified virions. A new RSV, which is present at the cell surface and in the culture supernatant of BSRT7/5, is gathered to infect human HEp-2 cells for viral amplification. Two or three rounds of amplification are needed to obtain viral stocks containing 1 x 106 to 1 x 107 plaque-forming units (PFU)/mL. Methods for the optimal harvesting, freezing, and titration of viral stocks are described here in detail. We illustrate the protocol presented here by creating two recombinant viruses respectively expressing free green fluorescent protein (GFP) (RSV-GFP) or viral M2-1 fused to GFP (RSV-M2-1-GFP). We show how to use RSV-GFP to quantify RSV replication and the RSV-M2-1-GFP to visualize viral structures, as well as viral protein dynamics in live cells, by using video microscopy techniques.

We describe a method for generating and amplifying genetically modified respiratory syncytial viruses (RSVs) and an optimized plaque assay for RSVs. We illustrate this protocol by creating two recombinant viruses that respectively allow quantification of RSV replication and live analysis of RSV inclusion bodies and inclusion bodies-associated granules dynamics.

Generación, amplificación y titulación de virus sincitiales respiratorios recombinantes

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...

Plaquing of Herpes Simplex Viruses

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can be difficult to perform, requiring focus on its specifications and refinement. It is an incredibly challenging method for new students to master, mainly because it requires meticulous attention to the most minute details. This demonstration of plaquing herpes simplex viruses should help those who have struggled with visualizing the method, especially its nuances, over the years. While this manuscript is based on the same principles of standard plaquing methodology, it differs in that it contains a detailed description of (1) how best to handle host cells to avoid disruption during the process, (2) a more useful viscous medium than agarose to limit the diffusion of virions, and (3) a simple fixation and staining procedure that produces reliably reproducible results. Furthermore, the accompanying video helps demonstrate the finer distinctions in the process, which are frequently missed when instructing others on conducting plaque assays.

Plaquing is a routine method used to quantify live viruses in a population. Though plaquing is frequently taught in various microbiology curricula with bacteria and bacteriophages, plaquing of mammalian viruses is more complex and time-consuming. This protocol describes the procedures that function reliably for regular work with herpes simplex viruses.

Plaquing de los virus del herpes simple

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can ...

Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification

Zika virus (ZIKV) is a mosquito-borne virus belonging to the genus Flavivirus. ZIKV infection has been associated with congenital brain abnormalities and potentially Guillain-Barr&#233; syndrome in adults. Research on ZIKV to understand the disease mechanisms is important to facilitate vaccine and treatment development. The method of quantifying viruses is crucial and fundamental in the field of virology. The focus forming assay (FFA) is a virus quantification assay that detects the viral antigen with antibodies and identifies the infection foci of cells using the peroxidase immunostaining technique. The current study describes the virus propagation and quantification protocol using both 24-well and 96-well (high throughput) formats. Compared with other similar studies, this protocol has further described foci size optimization, which can serve as a guide to expand the use of this assay for other viruses. Firstly, ZIKV propagation is performed in Vero cells for 3 days. The culture supernatant containing ZIKV is harvested and quantitated using the FFA. Briefly, the virus culture is inoculated onto Vero cells and incubated for 2-3 days. Foci formation is then determined after optimized staining processes, including cell fixation, permeabilization, blocking, antibody binding, and incubation with peroxidase substrate. The stained virus foci are visualized using a stereo microscope (manual counting in 24-well format) or software analyzer (automated counting in 96-well format). The FFA provides reproducible, relatively fast results (3-4 days) and is suitable to be used for different viruses, including non-plaque-forming viruses. Subsequently, this protocol is useful for the study of ZIKV infection and could be used to detect other clinically important viruses.

The present protocol describes the propagation of Zika virus (ZIKV) in Vero African green monkey kidney cells and the quantification of ZIKV using cell-based colorimetric immunodetection methods in 24-well and 96-well (high throughput) formats.

Propagación de virus y cuantificación colorimétrica basada en células

Zika virus (ZIKV) is a mosquito-borne virus belonging to the genus Flavivirus. ZIKV infection has been associated with congenital brain abnormalities and ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

De Alto Rendimiento La titulación de luciferasa que expresan virus recombinantes

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Plaque Assay: A Method to Determine Viral Titer as Plaque Forming Units (PFU)

Source: Tilde Andersson1, Rolf Lood1 
1 Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, Lund University, 221 00 Lund, Sweden
Viruses that infect prokaryotic organisms, called bacteriophages or simply phages, were identified in the early 20th century by Twort (1) and d&#39;H&#233;relle (2) independently. Phages have since been widely recognized for their therapeutic value (3) and their influence on human (4), as well as global, ecosystems (5). Current concerns have fueled a renewed interest in the use of phages as an alternative to modern antibiotics in treatment of infectious disease (6). Essentially all phage research relies on the ability to purify and quantify viruses, also known as a viral titer. Initially described in 1952, this was the purpose of the plaque assay (7). Decades and multiple technological advancements later, the plaque assay remains one of the most reliable methods for determination of viral titer (8).
Bacteriophages subsist by injecting their genetic material into host cells, hijacking the machineries for production of new phage particles, and eventually causing the host to release numerous progeny virions through cell lysis. Because of their minute size, bacteriophages cannot be observed using solely light microscopy; therefore, scanning electron microscopy is required (Figure 1). Additionally, phages cannot be cultivated on nutritional agar plates like bacteria, as they need host cells to prey on.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig1.jpg" /> 
Figure 1: The morphology of a bacteriophage, here exemplified by an E. coli phage, can be studied using scanning electron microscopy. Most bacteriophages belong to Caudovirales (tailed bacteriophages). This particular phage has a very short tail structure and an icosahedral head, placing it in the family of Podoviruses.
The plaque assay (Figure 2) is based on incorporation of host cells, preferentially in log-phase growth, into the medium. This creates a dense, turbid layer of bacteria able to sustain viral growth. An isolated phage can subsequently infect, replicate within, and lyse one cell. With each lysed cell, multiple adjacent ones become immediately infected. Several cycles in, a clear zone (a plaque) can be observed in the otherwise turbid plate (Figure 2B/Figure 3A), indicating the presence of what was initially a single bacteriophage particle. The number of plaque forming units per volume (i.e. PFU/mL) of a sample, can thus be determined from the number of plaques generated.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig2.jpg" /> 
Figure 2: Testing for plaque forming units (PFU) is a common method for determining the number of bacteriophages in a sample. (A) The base of a sterile Petri dish is covered with an appropriate solid nutrient medium, followed by a mixture of soft media, susceptible host cells and a dilution of the original bacteriophage sample. Note that the phage-suspension could, in some cases, also be evenly spread-out across the surface of already solidified soft agar. (B) Growth of the host bacteria forms a lawn of cells in the top agar layer. Bacteriophage replication generates clear zones, or plaques, caused by host cell lysis.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig3.jpg" /> 
Figure 3: Results from PFU-testing show multiple plaques generated by bacteriophages. Due to lysis of susceptible host cells, plaques can be seen as clearing zones in the bacterial lawn, either with (A) full clearance, or (B) partial re-growth caused by generation of resistant bacteria (or possibly by temperate phages in the lysogenic cycle).
Certain temperate phages can adopt what is referred to as a lysogenic lifecycle, in addition to the formerly described lytic growth. In lysogeny, the virus assumes a latent state through incorporation of its genetic material into the genome of the host cell (9), often conferring resistance to further phage infections. This is sometimes revealed through a slight clouding of the plaque (Figure 3B). It is worth noting however, that plaques can also appear blurred due to re-growth of bacteria that have evolved resistance to the phage independent of previous phage infections.
Viruses can attach, or adsorb, to only a limited range of host bacteria (10). Host ranges are further limited by intracellular anti-viral strategies such as the CRISPR-Cas system (11). The resistance/sensitivity towards specific phages displayed by bacterial subgroups has historically been used to categorize bacterial strains into different phage types (Figure 4). Although the effectiveness of this method has now been surpassed by novel sequencing techniques, phage typing can still provide valuable information about bacteria-phage interactions, for instance, facilitating the design of a phage cocktail for clinical usage.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig4.jpg" /> 
Figure 4: Phage sensitivity of different bacterial strains. Soft agar plates with Cutibacterium acnes strain (A) AD27 and (B) AD35, were spotted with 21 different C. acnes bacteriophages. Only phage 11 were able to infect and kill AD27 while strain AD35 showed sensitivity towards all phages. This technique, termed phage typing, can be used to divide bacterial species and strains into different subgroups based on phage susceptibility.

Determining Viral Titer as Plaque Forming Units PFU

Ensayo de placa: Un método para determinar los títulos virales como unidades formadoras de placas (UFP)

Source: Tilde Andersson1, Rolf Lood1
1 Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, Lund University, 221 00 ...

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Determining Antiviral Efficacy of Experimental Drugs Through a Plaque Assay

Source: Yadavalli, T., et al. <a href="https://app.jove.com/v/62195">Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals.</a> J. Vis. Exp. (2021)
This video demonstrates the method to perform a plaque assay using a virus obtained from infected porcine cornea. The porcine cornea is used to test the antiviral efficacy of experimental drugs.

Determinación de la eficacia antiviral de fármacos experimentales mediante un ensayo de placa

1. Virus infection quantification
NOTE: Virus titers from porcine corneas should be evaluated every day to analyze the effect of drug treatment.

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Immunology

Immunodiagnostics

Specialized Assays

A Viral Attachment Assay for Screening of Antiviral Compounds

Source: Tai, C. et al., <a href="https://app.jove.com/v/53124">Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2015)
This video demonstrates a viral attachment assay for screening antiviral compounds. Using genetically modified hepatitis C virus and luciferase, it assesses inhibitory effects on viral attachment, as indicated by lower light intensity in co-treated wells compared to wells treated with the virus alone.

Un ensayo de unión viral para la detección de compuestos antivirales

NOTE: Ensure that all procedures involving cell culture and virus infection are conducted in certified biosafety hoods that are appropriate for the ...