We would like to thank FMC BioPolymer USA for product samples of Avicel. This work was supported through the Defense Threat Reduction Agency grant HDTRA1-13-1-0005 to KK and the NIH research grant 1R15AI100001-01A1to KK.

1. Preparazione di cellule e reagenti <ol><li> Il giorno prima del test, sulla piastra cellule ospiti per il virus in questione (Tabella 1 e 2) a 90 - 100% di confluenza. </li><li> Preparare soluzione di fissaggio del 10% di formaldeide in dH 2 O. A esempio, mescolare 5,56 ml di 36% stock di formaldeide con 14,44 ml di H 2 O distillata (dH 2 O). NOTA: uso sicuro appropriata pratiche di manipolazione e ventilazione durante l&#39;uso di formaldeide. </li><li> Preparare macchia di cristallo viola: 1% di cristallo viola (CV) in etanolo al 20% e dH 2 O. </li><li> Preparare il supporto targa 2x (tipo di cellula dipendente a concentrazione 2x; vedi tabella 2). Filtrare su un filtro da 0,2 micron se qualche reagenti non sono sterili. </li><li> Preparazione di sovrapposizioni immobilizzanti (Tabella 3) <ol><li> Per sovrapposizioni liquidi, fare una soluzione sterile 2,4% di Avicel in dH 2 O. Per evitare grumi, aggiungere la polvere in un pallone contenente acqua tha sta rapidamente mescolando con un ancoretta, versare Avicel lentamente e mescolare rapidamente a temperatura ambiente (RT). Quando la soluzione si rivela troppo viscoso per un ancoretta per omogeneizzare, passare a uno shaker pallone per&gt; 30 min con pesanti agitazione per assicurare una omogeneizzazione. NOTA: Le soluzioni madre possono essere effettuate a concentrazioni più basse, ma le soluzioni possono separare e dovranno essere remixato per garantire omogeneizzazione. Soluzioni di lavoro Avicel possono essere usate vanno 0,6-3%. </li><li> Dopo omogeneizzazione, autoclave la soluzione e conservare sigillato a temperatura ambiente. </li><li> Per agarosio e carbossimetilcellulosa (CMC) sovrapposizioni, preparare una soluzione madre in dH 2 O del 2% CMC o 0,6% di agarosio. Mescolare con un ancoretta e autoclave o forno a microonde per portare in soluzione. </li></ol></li></ol> 2. diluizioni e infezioni <ol><li> Il giorno dopo la placcatura, controllare visivamente la confluenza e la vitalità delle cellule prima di iniziare il test. Garantire standard di morfologia cellulare untrovare un monostrato confluente ~ 90% è presente. </li><li> Effettuare una diluizione seriale di dieci volte dei campioni infettive. Utilizzare i mezzi di crescita cellulare per la propagazione virale come diluente (Tabella 2). Variare il numero di diluizioni necessarie sulla base del titolo atteso del virus in questione, e utilizzare sempre un campione di controllo non infetto al fine di garantire in modo indipendente la vitalità cellulare e l&#39;aiuto nell&#39;identificazione della placca. </li><li> Dalle diluizioni seriali, di infettare le cellule per 45 minuti a 1 ora (Tabella 1). Utilizzare un volume sufficiente di inoculo a coprire le cellule, mantenendo il volume più basso possibile per massimizzare il contatto virale con il monostrato (Tabella 4). Lastre di roccia delicatamente ogni 20 min per assicurare una copertura uniforme e prevenire il monostrato cellulare si secchi. </li><li> Dopo l&#39;infezione, sovrapporre un volume adeguato di immobilizzare media direttamente ai inoculums nel pozzo (Tabella 2) utilizzando una miscela 1: 1 di supporti placca 2x e immobilizzione sovrapposizione di scelta (CMC, agarosio o Avicel). Agitare delicatamente per mescolare. <ol><li> Per sovrapposizioni liquido, miscelare 1: 1 con mezzi riscaldati placca 2x e 1,2-2,4% RT magazzino Avicel per ottenere una soluzione di lavoro di 0,6-1,2% Avicel mezzo di copertura. </li><li> Per una sovrapposizione di agarosio, utilizzare una miscela 1: 1 di supporti 2x placca riscaldate e una soluzione madre di riscaldamento 0,6% di agarosio, posto in un bagno d&#39;acqua a 56 ° per 30 minuti per equilibrare la temperatura ottenendo una concentrazione finale di agarosio / sovrapposizione di 0,3 %. </li><li> Per CMC, preparare una soluzione madre 2% e trattare come descritto per la sovrapposizione di agarosio. </li><li> Quando si applica la sovrapposizione al monostrato, equilibrare sempre agarosio caldo o CMC in acqua 56 ° C per evitare di danneggiare il monostrato. Assicurarsi che la soluzione è caldo, ma non bollente al tatto per prevenire la morte cellulare e titoli virali ridotti. La maggior parte delle sovrapposizioni agarosio inizierà a solidificarsi al di sotto di 42 ° C, lavorare velocemente e / o preparare piccoli lotti per evitare la solidificazione durante la manipolazione. </li></ol></li><li> Dopo l&#39;aggiunta della sovrapposizione, incubare le piastre a produrre placche distinte che sono chiaramente numerabile. La formazione della placca può richiedere 2-14 giorni a seconda del virus in fase di analisi, la tabella 1. NOTA: Una volta che le piastre sovrapposte liquidi sono posti in incubatrice, non li sposta. Movimento delle sovrapposizioni liquido durante il periodo di incubazione si tradurrà in placche macchiate. Agarosio e CMC sovrapposizioni sono semisolida e possono essere spostati o controllati periodicamente al microscopio ottico per monitorare lo sviluppo della placca. </li></ol> 3. Fissaggio e Celle di colorazione <ol><li> Per fissare le cellule, travasare o aspirare la sovrapposizione Avicel, e fissare le cellule con la soluzione di formaldeide al 10% per 30 minuti per tutta la notte (&lt;1 ml per pozzetto di una piastra ben 6). <ol><li> Per agarosio o CMC, aggiungere direttamente la soluzione di formaldeide per la sovrapposizione per 1 ora a tutta la notte. NOTA: I campioni possono essere conservati per lunghi periodi di tempo nel fissativo a condizione che fanon evaporare e asciugare come questo può distorcere il monostrato. </li></ol></li><li> Prima di colorazione e dopo la fissazione, scartare la formaldeide e togliere i tappi semisolidi per l&#39;agarosio e CMC sia con acqua corrente o manualmente con una spatola. Sciacquare placche Avicel con acqua per eliminare residui di sovrapposizione / fissativo prima della colorazione. </li><li> Per la colorazione, coprire le cellule con una quantità minima di soluzione di violetto cristallo per ~ 15 min. Lastre di roccia se necessario per garantire anche la copertura. </li><li> Lavare delicatamente la macchia di cristallo viola con acqua. Una volta fissato, macchiato, e secco, negozio di placche a tempo indeterminato per le analisi future. </li></ol> 4. Determinazione virali I titoli <ol><li> Contare le placche in ciascun pozzetto, prendendo la media per eventuali repliche tecnici della stessa diluizione. Per i grandi formati lastra, pozzi di sconto con meno di 5 o superiore a 100 placche. Prendete nota di dimensioni della placca e morfologia. Il controllo negativo dovrebbe avere un monostrato uniforme epuò essere utilizzato come controllo di riferimento. </li><li> Determinare il titolo virale del campione magazzino prendendo il numero medio di placche di diluizione e l&#39;inverso del fattore di diluizione totale. </li></ol><img alt="Equazione 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52065/52065eq1.jpg" width="300" /> NOTA: Come esempio, 30 e 32 placche contato per replicati del 1 x 10 -7 diluizione [31 (medio) / 10 -7 (diluizione) x 0,4 ml (inoculo)] produrrebbe un titolo di 7,75 x 10 8 pfu / ml.

<ol>
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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+the+Filovirus+Plaque+Assay+for+Use+in+Preclinical+Studies.">Standardization of the Filovirus Plaque Assay for Use in Preclinical Studies.</a> Viruses. 4, 3511-3530 (2012).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays.">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virol. J. 3, 63 (2006).</li><li>Klebe, R. J., Harriss, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+technically+simple+&#8216;non-lethal&#8217;+vital+staining+procedure+for+viral+plaque+and+cell+transformation+assays.">A technically simple &#8216;non-lethal&#8217; vital staining procedure for viral plaque and cell transformation assays.</a> Arch. Virol. 81, 359-362 (1984).</li><li>Gaush, C. R., Smith, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+and+plaque+assay+of+influenza+virus+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells.">Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells.</a> Appl. 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D., Garten, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+influenza+virus+infection+in+human+airway+cell+cultures+by+an+antisense+peptide-conjugated+morpholino+oligomer+targeting+the+hemagglutinin-activating+protease+TMPRSS2.">Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2.</a> J. Virol. 85, 1554-1562 (2011).</li><li>Youil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+influenza+virus+replication+in+Vero+and+MDCK+cell+lines.">Comparative study of influenza virus replication in Vero and MDCK cell lines.</a> J. Virol. Methods. 120, 23-31 (2004).</li><li>Tobita, K., Sugiura, A., Enomoto, C., Furuyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plaque+assay+and+primary+isolation+of+influenza+a+viruses+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells+(MDCK)+in+the+presence+of+trypsin.">Plaque assay and primary isolation of influenza a viruses in an established line of canine kidney cells (MDCK) in the presence of trypsin.</a> Med. Microbiol. Immunol. (Berl.). 162, 9-14 (1975).</li></ol>

The authors have nothing to disclose and no competing or financial interests in the protocol or products described.

Il fattore più critico per un saggio di placca successo risiede nella ottimizzazione del protocollo per la coltura virale specifico in questione come condizioni possono variare significativamente. Punti chiave da prendere in considerazione sono: ospitare la compatibilità cellulare con il virus in questione, adeguate condizioni di crescita virale, gli intervalli di diluizione sufficienti al fine di distinguere chiaramente placche, e la selezione di sovrapposizione corretta e colorazione per le cellule e virus in questione. Mentre VeeV e RVFV sia crescere in condizioni molto simili utilizzando molti degli stessi tipi di cellula ospite, differenze di placca morfologia e cinetica di crescita variano notevolmente. Quando si utilizza cellule Vero per le prove di placca, che sono stati tradizionalmente utilizzati come una linea cellulare di propagazione e indicatore virus della febbre emorragica e alfavirus, VeeV cresce in genere a titoli più elevati rispetto RVFV e dimostra aumentato la cinetica di replica, lo sviluppo di placche di grandi dimensioni uniformi a 48 hpi 4, 10-12. In contrasto VeeV, RVFV richiede 72 hpi e dimostra placche che sono in genere molto più piccoli e di dimensioni variabili. In opposizione a RVFV e VeeV, il virus dell&#39;influenza è altamente cellula ospite specifico e può essere difficile da diffondere attraverso la cultura dei tessuti. Per il virus dell&#39;influenza, l&#39;ingresso del virus e la fusione è normalmente attivate dal legame del recettore sulla superficie cellulare con la glicoproteina virale hamagglutinin (HA), che media l&#39;ingresso nella cellula bersaglio attraverso il legame con il recettore di superficie di acido α-sialico della cellula ospite. HA è una glicoproteina trimeric che è presente nella busta membrana di tutti i virus influenzali e richiede fenditura nella subunità HA1 e HA2 da una proteasi specifica cellula ospite. A complicare ulteriormente la questione, questi siti di rottura possono spesso variare tra i ceppi virali 13. In quanto espressione di proteasi capaci di scindere HA è limitato a specifici tessuti, proteasi are spesso aggiunto al mezzo di coltura per facilitare la fusione e l&#39;ingresso del virus nella cellula ospite selezionata 13. TPCK-tripsina è un esempio di una proteasi di uso comune che viene utilizzato in colture cellulari sia MDCK e cellule Vero: agevolare replica multi-ciclo (in assenza di siero inattivare la tripsina) attraverso l&#39;attivazione proteolitica di HA virale 14,15. Come dimostrato in questo studio e di altri, le differenze di cicli di vita virali possono influenzare le selezioni di sovrapposizione, formati lastra, e dei tempi di incasso, con variazioni significative tra le classi diverse e specie di virus. Nel nostro studio, le sovrapposizioni di agarosio dimostrato placche più chiare a titoli più elevati rispetto sia CMC o sovrapposizioni liquidi sia per RVFV e virus dell&#39;influenza B, rafforzando la sua utilità tra una vasta gamma di virus e tipi di cellule. Utilizzando una bassa concentrazione finale di agarosio grande aiuto nel rimuovere i tappi solidi e colorazione semplificata. CMC generale ha dimostrato la poorest efficacia come un overlay per tutti e tre i virus testati e prodotti molto piccoli e indistinti placche per il virus dell&#39;influenza B. Anche se nel complesso CMC ha dimostrato le caratteristiche meno desiderabili, il suo uso in rapida crescita ed estremamente virulenti virus potrebbe rivelarsi vantaggiosa, come ha fatto apparire per ridurre le dimensioni della placca con solo una riduzione minima del titolo. La sovrapposizione del liquido si è rivelato il più versatile che era estremamente semplice da preparare, maggiore facilità di utilizzo, ed era paragonabile a agarosio su tutti i virus selezionati. In un formato piatto throughput più elevato a 96 pozzetti, l&#39;applicazione e la rimozione non è stata inibita a causa di solidificazione come con sovrapposizioni tradizionali, e ha fornito risultati accurati e coerenti. Una considerazione quando si utilizza sovrapposizioni liquido sta nella colorazione opaca e l&#39;incapacità di controllare la formazione della placca come le piastre non possono essere spostati fino al punto di raccolta, limitando questo adattamento per virus con una cinetica di replicazione precedentemente caratterizzati. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Le modifiche secondarie in condizioni di analisi della placca possono alterare significativamente i risultati, e la valutazione e le prestazioni di un nuovo sistema o tecnica è sempre garantito. Mentre un protocollo di test targa ottimizzato e standardizzato non esiste per ogni situazione, il nostro rapporto dimostra la versatilità e facilità d&#39;uso in tradizionale così come overlay liquidi innovativi per analisi di placca, fornendo un&#39;esperienza sufficiente per ulteriori modifiche da parte dell&#39;utente.

L&#39;isolamento e la quantificazione accurata di campioni virali vitali è stata sempre un obiettivo di ricerca in corso in virologia. Non è stato fino all&#39;avvento del saggio di placca nel 1952 che un mezzo per calcolare quantitativamente e qualitativamente titoli virali di origine animale per la prima volta messo a punto 1,2. Questa tecnica è stato adattato e modificato da saggi fagi, che era stato precedentemente utilizzato per calcolare titoli azionari di batteriofagi in biologia vegetale 1,2. Mentre mezzi alternativi per la quantificazione virale da allora sono stati sviluppati e adattati, come ad esempio immunologiche, fluorescenza e microscopia elettronica a trasmissione, il rilevamento degli impulsi resistivo regolabile (TRPS), citometria a flusso, sistemi di giornalista ricombinanti, e inverso quantitativa reazione a catena della polimerasi della trascrizione (qRT-PCR) , questi metodi non riescono a identificare e quantificare replica virons competenti 1,3. Mentre i progressi delle tecnologie e delle tecniche continuano a perfezionare e modificare il paesaggio; plaque saggi continuano a rappresentare il gold standard per determinare le concentrazioni virali infettive per virons litiche 1,4. Nel corso di un saggio di placca, un monostrato confluente di cellule ospiti è stato infettato da un virus litico di una concentrazione sconosciuta che è stata diluita in serie ad una serie numerabile, in genere tra 5-100 virioni. Monostrati infetti vengono poi coperti con un mezzo di copertura immobilizzante per prevenire l&#39;infezione virale da diffondere indiscriminatamente sia attraverso il flusso meccanico o convezione del mezzo liquido durante la propagazione virale. Mentre sono stati tradizionalmente utilizzati sovrapposizioni solidi o semisolidi come agarosio, metilcellulosa e carbossimetilcellulosa (CMC), sovrapposizioni liquidi sono diventati un&#39;alternativa sempre più attraente con lo sviluppo di nuovi strati liquidi come Avicel 5- 7. Saggi placca che utilizzano liquido contro le sovrapposizioni tradizionali presentano diversi vantaggi come la sovrapposizione può essere applicato a temperatura ambiente, e l&#39;applicazione e la rimozione è molto più semplice. Come sovrapposizioni liquidi non necessitano di riscaldamento, virus labili delicate e di calore possono anche risultare più facile placca. Dopo l&#39;infezione iniziale e l&#39;applicazione della sovrapposizione immobilizzare, singole placche o zone di morte cellulare, inizierà a sviluppare infezione e la replicazione virale sono vincolati al monostrato circostante. Cellule infettate continuerà il ciclo di replica-lisi-infezione si propaga ulteriormente l&#39;infezione, con conseguente placche sempre più distinti e discreti. A seconda della cinetica di crescita e di accoglienza delle cellule virale utilizzato, una targa visibile normalmente formare entro 2-14 giorni. Monostrati cellulari possono poi essere contate con un microscopio a campo chiaro normale, o più tipicamente fissi e contrastate dal rosso neutro o violento cristallo per identificare prontamente placche ad occhio nudo. Vi è un&#39;ampia varietà di macchie contatore placca disponibili, ciascuna offerta thEIR vantaggi e svantaggi specifici. Cristal violetto è tipicamente aggiunto nel punto di raccolta e dopo il fissaggio / rimozione della sovrapposizione, fornendo una macchia contatore rapida e distinta che consente l&#39;identificazione di piccole placche quando morfologia mista è presente. Rosso neutro ha il vantaggio di prima applicazione e il contatto costante con la sovrapposizione, consentendo il monitoraggio in tempo reale di sviluppare la formazione della placca, che è particolarmente utile quando si lavora con uno sconosciuto virus o di replica cinetica. Abbiamo però scoperto che la colorazione non è in genere distinto durante l&#39;utilizzo rosso neutro. 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolio bromuro (MTT) offre numerosi vantaggi, come le macchie gialle colorante cellule vive scuro placche blu e virali possono essere contati senza rimozione della sovrapposizione come con rosso neutro. L&#39;elevato contrasto tra cellule vive e morte offerte dalla MTT permette anche la rilevazione di piccole placche in un momento precedente l&#39;infezione punto di post, Anche se lo stoccaggio sarebbe comunque richiedere la rimozione della sovrapposizione 8. Come cristal violetto può essere fatta semplicemente in una soluzione di acqua e alcol, e fornisce un elevato grado di sensibilità per la morfologia di placca mista, abbiamo scelto come un contatore macchia preferito e semplificato per il protocollo dimostrato come stiamo utilizzando diverse famiglie di ben virus caratterizzati. Dopo aver sistemato e colorare il monostrato cellulare infetto, placche sono contati per poi titolare azionari campioni virali in termini di unità formanti placca (PFU) per millilitro. Una goccia registro deve essere osservata tra diluizioni seriali e, a seconda delle dimensioni piatto, tra 5-100 placche contati, con un controllo negativo utilizzato come riferimento. Campioni statisticamente possono variare del 10% per ogni 100 placche contati quando si confrontano campione replica 3. Il vantaggio di utilizzare saggi placca per determinare i titoli virali risiede nella loro capacità di quantificare il numero effettivo di particelle virali infettive well&#39;ambito del campione. Come più virioni potrebbero potenzialmente infettare una singola cella, la terminologia di unità rispetto virons viene utilizzato durante titolazioni placca 1,2. La morfologia della placca può variare notevolmente in condizioni di crescita differenti e tra le specie virali. Dimensione della placca, la chiarezza, la definizione dei bordi, e la distribuzione dovrebbero essere annotate in quanto possono fornire informazioni preziose sui fattori di crescita e di virulenza del virus in questione. Principi di base del saggio di placca possono anche essere adattate e modificate in vari modi diversi, ad esempio nell&#39;uso di focus formare saggi (FFA). FFAs non si basano su lisi cellulare e di contrasto per rilevare la formazione della placca, ma piuttosto impiegano tecniche per rilevare direttamente le proteine ​​virali intracellulari mediante anticorpi marcati immunoistochimica. Aumento della sensibilità, riduzione tempi di incubazione dopo l&#39;infezione, e, soprattutto, la capacità di quantificare i virus non-litici sono tutti distintivantaggi quando si impiegano FFAs. Mentre ampiamente utilizzati, i fattori critici limitanti in FFAs differenziano un saggio di placca tradizionale risiede nella necessità di anticorpi appropriati e la capacità di rilevarne solo subunità proteiche virali infettive rispetto virons attuale 4. Ai fini di questo studio, ci limiteremo la nostra discussione di saggi placca classica e descrivere l&#39;uso di strati solidi e semisolidi tradizionali (agarosio e CMC), insieme a nuovi liquido microcristalline sovrapposizioni di cellulosa.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="692">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:127px;">Company</td>
			<td style="width:129px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">6-well CellStar plate for tissue culture</td>
			<td style="width:127px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:129px;">658 160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">12-well CellStar plate for tissue culture</td>
			<td style="width:127px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:129px;">665 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">96-well CellStar plate for tissue culture</td>
			<td style="width:127px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:129px;">655 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">96-2ml deep well plate</td>
			<td style="width:127px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:129px;">C15046314</td>
			<td>For serial dilutions</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">DMEM</td>
			<td style="width:127px;">Quality Biologicals</td>
			<td style="width:129px;">112 013 101</td>
			<td>Cell Media/Diluent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">2X EMEM for plaques</td>
			<td style="width:127px;">Quality Biologicals</td>
			<td style="width:129px;">115 073 101</td>
			<td>Warm to 37 oC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">MEM 100X&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Cellgro</td>
			<td style="width:129px;">25 025 Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Sodium Pyruvate&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Cellgro</td>
			<td style="width:129px;">25 000 Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:129px;">15140 122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:129px;">25030 081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:269px;">HyClone FBS&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:129px;">SH30910.03</td>
			<td>Heat inactivate before use at 62 oC for 30 min</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">A7030-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Trypsin TPCK</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">T1426-50mg</td>
			<td>Make aliquots/Avoid freeze thawing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">HEPES&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:129px;">15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">DEAE-Dextran</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">D9885-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Crystal Violet</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">C3886-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Formaldehyde Solution</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">F8775-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Ethanol denatured Reagent Grade</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td>362808-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Avicel RC-591 NF</td>
			<td style="width:127px;">FMC BioPolymer USA</td>
			<td style="width:129px;">RC-591 NF</td>
			<td>Shake vigorously when reconsitiuting&#160; for &#62;30 min to homogenize</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">UltraPure Agarose&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:129px;">16500-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">C4888</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems

Saggi placca rimangono uno dei metodi più accurati per la quantificazione diretta di virons infettivi e sostanze antivirali attraverso il conteggio delle placche discreti (unità infettive e le zone morte cellulare) in coltura cellulare. Qui mostriamo come eseguire un saggio di placca di base, e come sovrapposizioni e tecniche differenti in grado di influenzare la formazione di placca e la produzione. Tipicamente substrati sovrapposizione solidi o semisolidi, come agarosio o carbossimetilcellulosa, sono stati utilizzati per limitare la diffusione virale, impedendo l&#39;infezione indiscriminata attraverso il terreno di coltura liquido. Sovrapposizioni immobilizzati limitano infezione cellulare per il monostrato immediatamente circostante, consentendo la formazione di foci discreta numerabile e la successiva formazione della placca. Per superare le difficoltà insite nell&#39;uso sovrapposizioni tradizionali, una sovrapposizione di liquido romanzo utilizzando cellulosa microcristallina e carbossimetilcellulosa di sodio è stato sempre più utilizzato come sostituto nella normasaggio di placca. Overlay test placca liquidi possono essere facilmente eseguite in entrambi i formati lastra e standard di 6 o 12 secondo le tecniche tradizionali e non richiedono attrezzature speciali. Grazie al suo stato liquido e successiva facilità di applicazione e rimozione, formati lastra microcultura possono inoltre essere utilizzati come un rapido, preciso e throughput elevato alternativa titolazioni virali scala più grande. L&#39;uso di un polimero liquido viscoso riscaldato non offre la possibilità di snellire il lavoro, conserva i reagenti, spazio incubatore, e aumenta la sicurezza operativa quando viene utilizzato nei laboratori tradizionali o alti di contenimento, come il riscaldamento del reagente o vetreria sono obbligatori. Sovrapposizioni liquidi possono anche rivelarsi più sensibili di overlay tradizionali per alcuni di calore virus labili.

La capacità del test di placca per valutare con precisione titoli virali si basa su numerosi fattori: la selezione della cellula ospite appropriato, i media adeguati e condizioni di crescita per la vitalità cellulare e virale, la propagazione virale immobilizzato, e una determinazione accurata del periodo di incubazione del virus per consentire un tempo adeguato per distinti e la formazione della placca numerabile. Per questo studio, i virus provenienti da tre famiglie rappresentativi sono stati scelti per dimostrare le differenze di: selezione overlay, periodi di incubazione, e la morfologia della placca attraverso diversi tipi di campioni. Encefalite equina venezuelana (VeeV) è stato scelto come modello virale (+) ssRNA, che può causare significative malattie nelle specie equina e gli esseri umani e rappresenta la famiglia Togaviridae. Influenza B Taiwan ceppo, un segmentato (-) ssRNA virus di infettare gli esseri umani in primo luogo, rappresenta la famiglia Orthomyxoviridae. Rift Valley virus della febbre (RVFV), una - virus ssRNA artropode nato infettare principalmente artropodi, ()ruminanti e gli esseri umani, è stato selezionato come rappresentante della famiglia Bunyaviridae. Per RVFV (figura 1), i titoli sono stati determinati da una soluzione madre di un ricombinante vivo attenuato ceppo MP12 di RVFV in un formato a 12 pozzetti utilizzando CMC, agarosio, o sovrapposizioni Avicel che sono state incubate side-by-side per la post infezione 72 ore (hpi). Un piatto rappresentante che mostra diluizioni che vanno da 10 -4 a 10 -7 può essere visto in Pannello di A. placche con CMC e sovrapposizioni di agarosio ha mostrato piccole, chiare e distinte placche con un bordo circolare ben definito. Le placche con una sovrapposizione di liquido erano leggermente più abbondanti e più grande rispetto a agarosio e placche CMC, e hanno fornito un bordo meno distinte. Titoli virali sono stati confrontati in Pannello B con tutte le sovrapposizioni di eseguire in modo paragonabile. Per ottenere un confronto visivo più chiara tra overlay per MP12 insieme con un campione più grande per determinare riprodubilità, una piastra 6 pozzo è stato anche trialed in triplice copia (Figura 2). Nel formato piastra 6 bene, l&#39;uso di una sovrapposizione CMC mostrato placche più piccole sia sovrapposizioni agarosio o liquide, che erano di dimensioni paragonabili a vicenda. Mentre titoli virali sono risultati simili tra i tre strati (pannello D), placche formate in sovrapposizioni di agarosio e liquidi dimostrato più facile contare a causa della loro maggiore dimensione. In contrasto con RVFV, titoli VeeV e morfologia della placca tra le sovrapposizioni differenti variava notevolmente (Figura 3A). Le placche costituite sovrapposizioni CMC dimostrato una morfologia chiara e distinta quando si utilizza un formato a 12 pozzetti, a scapito della dimensione e sensibilità della placca (Pannello B). In contrasto con CMC, l&#39;uso di agarosio e liquidi sovrapposizioni provocato placche significativamente più grandi, indicando l&#39;inibizione virale inferiore e maggiore sensibilità alla replica VeeV. Ciò è stato già confermato quando si confrontano esclusivamente agarosio contro CMC in apaper pubblicato da Juarez et al. 4. Mentre agarosio e liquidi sovrapposizioni prodotte placche più grandi di CMC, le placche erano mal definiti confini ed erano difficili da contare in un formato 12 bene, con sovrapposizioni liquidi che forniscono la massima diffusione confine. Quando placche erano trialed in 6 pozzetti (Figura 4), ​​il più grande formato 6 ben negato il rilascio di apertamente grandi placche che sono difficili da differenziare in formato 12 bene, con agarosio e sovrapposizioni liquidi comprovanti superiore alle sovrapposizioni CMC in termini di definizione placca e sensibilità (Figura 4D). In confronto a RVFV o VeeV, l&#39;influenza fornisce diverse sfide uniche quando plaquing, come l&#39;obbligo di un proteasi esterna. La sensibilità del virus dell&#39;influenza a diverse selezioni di sovrapposizione è stato ben documentato in passato come cambiamenti significativi sono stati notati quando le modifiche come minori come marche di agarosio differenti hanno essereen usato 9. È interessante notare che per il ceppo influenzale B Taiwan, l&#39;uso di CMC come sovrapposizione provocato placche marcatamente più piccoli che sono difficili da contare e dimostrata difficilmente segnare affidabile (Figura 5A). L&#39;uso di una sovrapposizione agarosio fornito i migliori placche (pannello C), e portato a una macchia sfondo più scuro (probabilmente dovuto alla maggiore redditività monostrato), e ha mostrato placche chiare e nitide in confronto diretto con l&#39;uso della sovrapposizione liquido (Pannello B ). Un vantaggio di polimeri liquidi oltre sovrapposizioni solidi o semisolidi, come agarosio e CMC, sta nella facilità di rimozione e applicazione. Sovrapposizioni semiduri richiedono riscaldamento, e solidificazione possono risultare problematico durante la manipolazione e la rimozione. Al fine di capitalizzare questi vantaggi e per determinare la praticità di utilizzare Avicel in modo high-throughput per RVFV, un formato a 96 pozzetti è stato trialed a vari concentrazi overlayons (Figura 6). Per RVFV MP-12, diluizioni sono state eseguite in quadruplicato in entrambi 0.6 e 1.2% concentrazioni finali di Avicel. Applicazione e rimozione Overlay dimostrato semplice, senza differenze apparenti tra replicati o tra concentrazioni notato, dimostrando un alto grado di riproducibilità. Quando segnando, placche erano distinte e numerabile ad occhio nudo, dimostrando la fattibilità di utilizzare sovrapposizioni liquidi in modo elevato throughput per RVFV. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6.5in" width="650" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig1highres.jpg" /> Figura 1:. RVFV placca confronti di sovrapposizione utilizzando piastre da 12 pozzetti Veros sono stati piastrati a 2,5 x 10 5 cellule in piastre da 12 pozzetti e infettati con 200 microlitri utilizzando lo stesso campione di partenza in serie diluita di MP12. Dopo l&#39;infezione 1,5 ml sovrapposizioni di agarosio 0,3%, 0,6% Avicel, o 1% CMC (c finaleconcentrazioni del), sono stati applicati al fine di confrontare direttamente le sovrapposizioni come dimostrato nel Pannello di A. placche sono stati contati e titolato nel Pannello B. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig2highres.jpg" /> Figura 2:. RVFV placca confronti di sovrapposizione che utilizzano 6 pozzetti Veros sono stati piastrati a 5 x 10 5 cellule in 6 pozzetti e infettati con 400 microlitri utilizzando lo stesso campione di partenza in serie diluita di MP12. Tre ml sovrapposizioni di agarosio 0,3%, 0,6% Avicel o 1% CMC, sono stati applicati al fine di confrontare le sovrapposizioni come dimostrato nel Pannello A, B, e C. esperimenti indipendenti sono stati eseguiti in modo identico come descritto per pannelli AC, con placche contati e titolati nel Pannello di D (N = 3). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig3highres.jpg" /> Figura 3: &lt;strong&gt; confronti di sovrapposizione VeeV placca utilizzando piastre da 12 pozzetti. Veros sono stati piastrati a 2,5 x 10 5 cellule in piastre da 12 pozzetti e infettati con 200 microlitri utilizzando lo stesso campione di partenza in serie diluito del ceppo del vaccino VeeV TC-83. Dopo l&#39;infezione 1,5 ml sovrapposizioni di agarosio 0,3%, 0,6% Avicel, o 1% CMC, sono stati applicati al fine di confrontare direttamente le sovrapposizioni come dimostrato nel Pannello di A. placche sono stati contati e titolato nel Pannello di B. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig4highres.jpg" /> Figura 4:. V EEV confronti placca di sovrapposizione che utilizzano 6 pozzetti Veros sono stati piastrati a 5 x 10 5 cellule in 6 pozzetti e infettati con 400 microlitri utilizzando lo stesso campione di partenza in serie diluita di VeeV TC-83. Dopo l&#39;infezione, 3 ml sovrapposizioni di agarosio 0,3%, 0,6% Avicel, o un 1% di CMC, sono stati applicati al fine di confrontare le sovrapposizioni come dimostratoin pannelli A, B e C. esperimenti indipendenti sono stati eseguiti in modo identico come descritto per Pannelli A - C, con placche contati e titolato in Pannello D (N = 3). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig5highres.jpg" /> Figura 5: Influenza confronti overlay placca cellule MDCK sono state piastrate a 5 x 10 5 cellule in 6 pozzetti e infettati con 400 ml di inoculo utilizzando lo stesso campione di partenza in serie diluita di influenza B Taiwan.. N siero fetale bovino (FBS) è stato utilizzato nei mezzi crescita o sovrapposizioni, come FBS può inibire influenza la propagazione attraverso l&#39;inibizione di alcune proteasi che sono necessari per la fusione virale. TPCK-tripsina inserito in tutti gli overlay prima dell&#39;applicazione al fine di facilitare la fusione virale e voce con le cellule ospiti. Dopo l&#39;infezione, 3 ml sovrapposizioni di agarosio 0,3%, 0,6% Avicel, o 1% CMC sono stati applicati al fine di confrontare direttamentele sovrapposizioni come dimostrato nel riquadro A, B e C. esperimenti indipendenti sono stati eseguiti in modo identico come descritto Pannelli A - C, con placche contati e titolato in Pannello D (N = 3). Mentre in media è stata presa per placche CMC si sono dimostrati difficili da contare in modo affidabile come hanno dimostrato le frontiere diffuse e piccolissime dimensioni della placca. <img alt="Figura 6" fo:content-width="6.5in" width="650" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig6highres.jpg" /> Figura 6:. Alta velocità effettiva sovrapposizioni placca A 96 pozzetti di Veros placcato a 3 x 10 4 cellule per pozzetto, sono stati infettati con 50 ml di inoculo utilizzando lo stesso campione di partenza in serie diluita di RVFV MP12 per 1 ora, in quattro esemplari. Per le sovrapposizioni, 0.6 e 1.2% concentrazioni finali di Avicel stati trialed per determinare la fattibilità e la riproducibilità di utilizzare sovrapposizioni liquidi in maniera high throughput, pannelli A e B. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VeeV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Tipo di cella </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Periodo di infezione </td><td> 1 ora </td><td> 1 ora </td><td> 45 min </td></tr><tr><td> Tempo di incubazione </td><td> 3 giorni </td><td> 2 giorni </td><td> 3 giorni </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Targa del saggio di inoculazione Condizioni e cellulari Tipi <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VeeV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Tipo di cella </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Tipo di Crescita</td><td> DMEM 1 </td><td> DMEM 1 </td><td> DMEM 2 </td></tr><tr><td> Targa media </td><td> 2xEMEM A </td><td> 2xEMEM A </td><td> 2xEMEM B </td></tr></tbody></table> 1. Dulbecco Modified Eagle Medium supplementato con 10% siero fetale bovino, 1% L-glutammina, 1% Penicllin / streptomicina. 2. Dulbecco Modified Eagle Medium integrato con 1% di L-glutammina, 1% Penicllin / streptomicina, 0,2% sieroalbumina bovina, lo 0,025% HEPES, DEAE-Destrano 50ug / ml. A. 2x minimo supporto essenziale (500 ml) supplementato con 5% FBS (25 ml), 1% minimo amminoacidi essenziali (5 ml), 1% di sodio piruvato (5 ml), 1% L-glutammina (5 ml), 2% Pen / Strep (10 ml). B. 2x minimo supporto essenziale (500 ml) integrato con 0,2% sieroalbumina bovina, un 1% Minimum Essential Amino Acids (5 ml), 50ug / ml, 0,025% HEPES, DEAE-Destrano, tripsina-TPCK * * Poco prima della preparazione, aggiungere 1 ml ogni 25ml di 2 mg / ml di brodo TPCK-tripsina alla aliquota che verrà utilizzato per mescolare con agarosio per placche. Tabella 2: Placca e Viral / Cellular crescita Medias <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VeeV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Tipo di cella </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Periodo di infezione </td><td> 1 ora </td><td> 1 ora </td><td> 45 min </td></tr><tr><td> Tempo di incubazione </td><td> 3 giorni </td><td> 2 giorni </td><td> 3 giorni </td></tr></tbody></table> Le soluzioni di sovrapposizione non scadono quando fatto fino a quando la sterilità è mantenuta. Tabella 3: Sovrapposizioni Archivio <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> 6 bene </td><td> 12 bene </td><td> 96 bene </td></tr><tr><td> # Di cellule / pozzetto </td><td> 5 x 10 5 </td><td> 2,5 x 10 5 </td><td> 3 x 10 4 </td></tr><tr><td> Volume di inoculum (ml) </td><td> 400 </td><td> 200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> volume di sovrapposizione (ml) </td><td> 3 </td><td> 1.5 </td><td> 0,100 </td></tr></tbody></table> Tabella 4: formati lastra

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Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Viral Determinazione Concentrazione Attraverso placca saggi: Sistemi overlay per mezzo di tradizionali e nuovi

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

viral-concentration-determination-through-plaque-assays-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

111.3K Views.  George Mason University. Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

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Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Utilizzando un pan-virale Assay Microarray (Virochip) allo schermo campioni clinici di patogeni virali

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

Analisi quantitativa di tutti influenza di tipo A Hemagglutinins e neuraminidasi virale utilizzando anticorpi Universale di saggi semplice Slot Blot

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant limitations, viruses are more resistant to many inactivation processes and standard fecal indicators do not inform on the source of contamination. The development of cost-effective methods for the concentration of viruses from water and molecular assays facilitates the applicability of viruses as indicators of fecal contamination and as microbial source tracking (MST) tools. Adenoviruses and polyomaviruses are DNA viruses infecting specific vertebrate species including humans and are persistently excreted in feces and/or urine in all geographical areas studied. In previous studies, we suggested the quantification of human adenoviruses (HAdV) and JC polyomaviruses (JCPyV) by quantitative PCR (qPCR) as an index of human fecal contamination. Recently, we have developed qPCR assays for the specific quantification of porcine adenoviruses (PAdV) and bovine polyomaviruses (BPyV) as animal fecal markers of contamination with sensitivities of 1-10 genome copies per test tube. In this study, we present the procedure to be followed to identify the source of contamination in water samples using these tools. As example of representative results, analysis of viruses in ground water presenting high levels of nitrates is shown.
Detection of viruses in low or moderately polluted waters requires the concentration of the viruses from at least several liters of water into a much smaller volume, a procedure that usually includes two concentration steps in series. This somewhat cumbersome procedure and the variability observed in viral recoveries significantly hamper the simultaneous processing of a large number of water samples.
In order to eliminate the bottleneck caused by the two-step procedures we have applied a one-step protocol developed in previous studies and applicable to a diversity of water matrices. The procedure includes: acidification of ten-liter water samples, flocculation by skimmed milk, gravity sedimentation of the flocculated materials, collection of the precipitate and centrifugation, resuspension of the precipitate in 10 ml phosphate buffer. The viral concentrate is used for the extraction of viral nucleic acids and the specific adenoviruses and polyomaviruses of interest are quantified by qPCR. High number of samples may be simultaneously analyzed using this low-cost concentration method.
The procedure has been applied to the analysis of bathing waters, seawater and river water and in this study, we present results analyzing groundwater samples. This high-throughput quantitative method is reliable, straightforward, and cost-effective.

The study describes a cost-effective method for the identification of the source of fecal/urine contamination or contamination by nitrates in water using qPCR for the specific quantification of human/porcine/bovine DNA viruses, adenoviruses and polyomaviruses, proposed as MST tools.

Costo-efficace metodo per il rilevamento di origine microbica Utilizzando specifici virus umani e animali

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant ...

Plaque Assay for Murine Norovirus

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are observed during MNV-1 infection of murine dendritic cells or macrophages 1. This property of MNV-1 can be used to quantify the number of infectious particles in a given sample by performing a plaque assay 1. The plaque assay relies on the ability of MNV-1 to lyse cells and to form holes in a confluent cell monolayer, which are called plaques 3.
Multiple techniques can be used to detect viral infections in tissue culture, harvested tissue, clinical, and environmental samples, but not all measure the number of infectious particles (e.g. qRT-PCR). One way to quantify infectious viral particles is to perform a plaque assay 3, which will be described in detail below. A variation on the MNV plaque assay is the fluorescent focus assay, where MNV antigen is immunostained in cell monolayers 4. This assay can be faster, since viral antigen expression precedes plaque formation. It is also useful for titrating viruses unable to form plaques. However, the fluorescent focus assay requires additional resources beyond those of the plaque assay, such as antibodies and a microscope to count focus-forming units. Infectious MNV can also be quantified by determining the 50% Tissue Culture Infective Dose (TCID50) 3. This assay measures the amount of virus required to produce CPE in 50% of inoculated tissue culture cells by endpoint titration 5. However, its limit of detection is higher compared to a plaque assay 4.
In this article, we describe a plaque assay protocol that can be used to effectively determine the number of infectious MNV particles present in biological or environmental samples 1, 4, 6. This method is based on the preparation of 10-fold serial dilutions of MNV-containing samples, which are used to inoculate a monolayer of permissive cells (RAW 264.7 murine macrophage cells). Virus is allowed to attach to the cell monolayer for a given period of time and then aspirated before covering cells with a mixture of agarose and cell culture media. The agar enables the spread of viral progeny to neighboring cells while limiting spread to distantly located cells. Consequently, infected cells are lysed and form holes in the monolayer known as plaques. Upon sufficient spread of virus, plaques become visible following staining of cells with dyes, like neutral red, methylene blue, or crystal violet. At low dilutions, each plaque originates from one infectious viral particle and its progeny, which spread to neighboring cells. Thus, counting the number of plaques allows one to calculate plaque-forming units (PFU) present in the undiluted sample 3.

Here we describe a method to quantify infectious particles of murine norovirus (MNV), which is the only norovirus that efficiently replicates in cell culture. The plaque assay takes advantage of MNV&#x2019;s tropism for murine macrophages and can be adapted for use with biological or environmental samples containing MNV.

Saggio di placca per Norovirus Murine

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

To identify potential antivirals against BTV, we have developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based assay was the first assay developed to evaluate whether a compound showed any antiviral efficacy and have been used to screen large compound library. Meanwhile, cytotoxicity of antivirals could also be evaluated using the CPE-based assay. The dose-response assay was designed to determine the range of efficacy for the selected antiviral, i.e. 50% inhibitory concentration (IC50) or effective concentration (EC50), as well as its range of cytotoxicity (CC50). The ToA assay was employed for the initial MoA study to determine the underlying mechanism of the novel antivirals during BTV viral lifecycle or the possible effect on host cellular machinery. These assays are vital for the evaluation of antiviral efficacy in cell culture system, and have been used for our recent researches leading to the identification of a number of novel antivirals against BTV.

Three assays, including the cytopathic effect (CPE)-based assay, dose-response assay and Time-of-Addition (ToA) assay have been developed, optimized, validated and utilized to identify novel antivirals against Bluetongue virus (BTV), as well as to determine the possible Mechanism-of-Action (MoA) for newly identified antivirals.

Saggi per l&#39;individuazione di nuovi antivirali contro virus della Bluetongue

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

Utilizzando il Overlay saggio misurare Qualitativamente produzione batterica di sensibilità e di pneumococcico batteriocine

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Fenomica fagi: Approcci fisiologici per caratterizzare Novel virali Proteine

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

All&#39;inizio virali ingresso saggi per l&#39;identificazione e la valutazione di composti antivirali

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Lo sviluppo del liofilizzato Loop-mediate isotermici amplificazione reagenti per la rilevazione di<em&gt; Burnetii Coxiella</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Misurare Influenza neuraminidasi Inibizione anticorpo I titoli da Enzyme-linked lectina Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Viral Determinazione Concentrazione Attraverso placca saggi: Sistemi overlay per mezzo di tradizionali e nuovi

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